轉基因艾美耳球蟲作為疫苗活載體的研究進展

（南陽農業(yè)職業(yè)學院，河南 南陽 473000）

轉基因艾美耳球蟲作為疫苗活載體的研究進展

胡云，楊紅玉

（南陽農業(yè)職業(yè)學院，河南 南陽 473000）

雞球蟲病（coccidiosis）病原為艾美爾屬（Eimeria）球蟲，是頂復門（Phylum Apicomplexa）原蟲中的一大類，屬于艾美爾科（Eimeriidae），艾美爾屬（Eimeria）。雞球蟲病是危害養(yǎng)禽業(yè)最嚴重的疾病之一，每年給世界養(yǎng)禽業(yè)帶來超過30億美元的經濟損失。

1 艾美爾球蟲與動物機體的免疫

艾美爾球蟲屬于腸道上皮細胞內寄生性原蟲，球蟲感染宿主細胞后，在帶蟲空泡內完成體內發(fā)育階段。早期研究認為帶蟲空泡是宿主免疫系統和球蟲接觸的屏障，弓形蟲只允許分子量小于1 300 D的蛋白出入帶蟲空泡，而越來越多的研究表明，帶蟲空泡是球蟲抗原與宿主接觸的一種途徑，帶蟲空泡膜與宿主的內質網膜融合，從而將帶蟲空泡內的抗原成分分泌至宿主胞漿。此外，子孢子、裂殖子和配子反復入侵腸黏膜上皮細胞，多次刺激宿主的免疫系統，也是宿主產生保護性免疫應答的重要因素。就是這種特殊的生活史導致蟲體對腸黏膜上皮細胞的反復入侵，進而能激發(fā)機體產生堅實的保護性細胞免疫和黏膜免疫。

機體黏膜部位（如腸道、呼吸道、泌尿生殖道）能夠通過多重機制保護宿主免受病原體的入侵：其固有的緊密結構如上皮細胞層間的連接和管腔的密閉微環(huán)境，為機體抵抗病原感染提供了機械性的保護屏障，但是仍有許多病原能夠突破黏膜上皮的屏障，進入腸黏膜細胞激發(fā)特異性免疫反應；此外，在機體的黏膜部位，存在大量的抗原遞呈細胞和淋巴細胞，T細胞經樹突狀細胞活化后，刺激B細胞分泌IgA抗體，后者能夠對病原體發(fā)揮中和作用。

雞球蟲主要經腸道感染，能夠激發(fā)宿主產生高效的黏膜免疫應答和細胞免疫。而禽流感、新城疫等禽類重要傳染病也主要經腸道和呼吸道傳播，這是設想利用轉基因球蟲防治禽流感、新城疫等禽類重要傳染病的立腳點。病毒入侵機體后主要在消化道和呼吸道部位繁殖擴增，因而宿主產生的免疫分子和免疫細胞主要靶向消化道及呼吸道黏膜；而艾美耳球蟲免疫能夠誘導雞產生以腸黏膜免疫應答為主的共同黏膜免疫反應，即腸黏膜部位的特異性的IgA+漿細胞和T細胞可趨化至呼吸道等其他黏膜部位，產生異位保護力。艾美耳球蟲不同階段的蟲體反復入侵腸道細胞，這時如果表達外源蛋白，外源蛋白也會跟隨蟲體反復入侵腸細胞而激發(fā)強大的黏膜免疫和細胞免疫應答。因此研發(fā)出高效的黏膜免疫疫苗-轉基因柔嫩艾美耳球蟲疫苗有非常重要的意義。

黏膜部位微環(huán)境復雜，因此黏膜疫苗發(fā)揮效果困難重重，黏膜疫苗在進入黏膜部位遞呈給抗原細胞之前要面臨上皮層的機械屏障和各種蛋白酶的消化作用，因此迫切需要黏膜佐劑提高腸道部位對黏膜疫苗的免疫反應?；魜y毒素（Cholera toxin）和大腸桿菌不耐熱腸毒素（E.coli heat-labile enterotoxin）是近幾年來研究比較熱的兩種黏膜佐劑。這些新型黏膜佐劑的開發(fā)為防治經黏膜部位感染的傳染病提供了無限前景。

2 轉基因球蟲作為疫苗活載體的優(yōu)勢

艾美耳球蟲具有嚴格的宿主特異性，一種球蟲只感染一種動物，而且球蟲入侵腸道細胞后，僅僅在帶蟲空泡內發(fā)育，與宿主細胞核隔離，球蟲的基因片段插入或整合進宿主基因組的可能性較小。

基因組容量大（約60Mb），可供外源基因的插入位點多。

艾美耳球蟲為真核生物，可以對表達的外源蛋白進行糖基化修飾。這樣表達出的外源蛋白能夠更好地激發(fā)宿主免疫反應。

免疫原性強、可激發(fā)產生共同黏膜免疫反應：由于很多禽類重要傳染病都是經腸道傳播，而球蟲疫苗在田間的保護率≥90%，艾美耳球蟲能激發(fā)起高效的腸道黏膜免疫應答。因此轉基因球蟲可以在宿主發(fā)揮抗球蟲免疫的同時，激發(fā)對其他病原的免疫反應，達到“一苗多用”的效果。自然飼養(yǎng)條件下卵囊可以重復感染，免疫一次即相當于多次預防接種。

球蟲作為疫苗載體，可以口服接種，簡單易行。因為卵囊壁能夠保護它抵抗嗉囊和胃等酸性環(huán)境，不降低疫苗的活性。適用于群體飲水免疫或拌料免疫；球蟲的繁殖周期較短，且感染屬于自限性，在生成卵囊以后即排到體外，不會引起免疫耐受問題。

生物安全性高。雞球蟲各個種均以雞為惟一宿主，不會跨種間傳播，因此轉基因球蟲在田間的釋放不造成所謂“散毒”的局面。

3 轉基因艾美耳球蟲作為疫苗活載體的研究進展

1998年英國的Tomley研究小組利用微線體1基因的調控序列作為啟動子首次實現了以β-半乳糖基因（lacZ）為報告基因的柔嫩艾美耳球蟲的瞬時轉染，并觀察到轉染子孢子可以在MDBK細胞上發(fā)育到第一代裂殖子。開啟了艾美爾球蟲轉基因研究的序幕。

2007年郝力力以球蟲本身的序列為啟動子，用黃色熒光蛋白和紅色熒光蛋白作為報告基因，以卵囊階段提取的基因組DNA為模板，用PCR的方法，得到相關蛋白的啟動子及肌動蛋白的下游調控序列。最終實現能夠表達黃色和紅色熒光蛋白的柔嫩艾美耳球蟲的瞬間轉染，轉染后的子孢子在MDBK細胞上能夠發(fā)育到第一代裂殖子。

2008年閆文朝首次利用熒光報告基因和藥物篩選壓力獲得了能夠穩(wěn)定轉染的艾美耳球蟲系，并且獲得了穩(wěn)定表達黃色熒光蛋白和乙胺嘧啶抗性基因的轉基因球蟲系（TE1）。并對TE1繁殖力、致病力和免疫原性等生物學特性進行了研究。研究發(fā)現轉基因球蟲TE1卵囊孢子化后，1個卵囊內的4個孢子囊并非全部表達黃色熒光蛋白。球蟲在合子減數分裂過程中存在同源或異源染色體重組和基因轉換現象，使表達外源抗原基因的轉基因球蟲在傳代遞增過程中比例下降。

2008年劉賢勇通過引入限制性內切酶介導的整合技術（REMI）使球蟲的轉染效率提高了200倍，為轉基因球蟲的穩(wěn)定篩選建立轉基因球蟲系奠定了良好的基礎，他同時首次進行了轉基因球蟲系的安全性評估。

2011年黃驍舾建立了轉基因艾美耳球蟲激發(fā)的宿主免疫反應的檢測平臺，它建立的一株能夠將黃色熒光蛋白打靶到微線中的轉基因球蟲能夠激發(fā)宿主產生更高的淋巴細胞增殖反應和顯著IgA反應，為轉基因球蟲成為新型疫苗載體展現了良好的前景。

2011年殷光文嘗試在同一個質粒載體中將黃色熒光蛋白基因置于mic1啟動子和actin的3′調控序列之間構建成一個表達框，而將紅色熒光蛋白基因置于Actin的5′和3′調控序列之間構建成另一個表達框，成功地建立了雙框表達載體，實現了不同外源蛋白同時表達，對轉基因球蟲成為新型活疫苗載體至關重要。

2012年Fiona M.Tomley和Damer P.Blake將空腸彎曲桿菌的保護性抗原CjaA轉染到柔嫩艾美耳球蟲中，建立了穩(wěn)定表達空腸彎曲桿菌CjaA的轉基因球蟲系，將該球蟲系免疫雞后用空腸彎曲桿菌攻毒，結果發(fā)現轉基因球蟲免疫的雞群能夠抵抗空腸彎曲桿菌的感染。

4 存在的問題及未來發(fā)展趨勢

盡管當前艾美爾球蟲作為疫苗活載體的研究已經取得了一些突破性的進展，但是在轉基因操作技術和轉基因球蟲的應用上仍然存在著很多問題。直接轉染卵囊將成為未來的研究方向，它可以省去子孢子提取及外科手術途徑接種等步驟，簡單易行。

當前艾美耳球蟲轉基因的挑戰(zhàn)還在于如何提高轉染效率和提高轉基因的表達效率，可以利用轉座子元件進一步提高艾美耳球蟲的轉染效率，從而提高轉基因成功的可能性。另外在艾美爾球蟲轉基因研究中將可能采用基于類轉錄激活因子效應物核酸酶（TALEN）、基于CRISPR/ Cas9的基因編輯技術等新的手段。

艾美耳球蟲轉基因研究取得的重要成就為其防治藥物及疫苗的研發(fā)描繪了光明的前景，假以時日，基于轉基因球蟲的活載體疫苗將不僅能實現球蟲病的有效防控，還有望成為預防畜禽其他重大疫病的多價疫苗。□