基于免疫磁分離的熒光微球免疫層析法檢測豬霍亂沙門氏菌

黃震　夏詩琪　劉道峰　劉成偉　賴衛(wèi)華

摘要建立了基于免疫磁分離的熒光微球免疫層析法，檢測豬霍亂沙門氏菌。待檢樣品經(jīng)免疫磁分離富集和熱洗脫處理后，用熒光微球免疫層析試紙條進(jìn)行檢測。每毫克納米磁珠標(biāo)記30 μg抗體制備的免疫磁珠，對濃度為102～106 CFU/mL 的豬霍亂沙門氏菌的捕獲率均大于90%，特異性好； 在pH=6時，以300 μg/mg豬霍亂沙門氏菌單抗11D8D4標(biāo)記熒光微球，制備免疫熒光微球； 以2.0 mg/mL豬霍亂沙門氏菌單抗5F11B11噴涂檢測線（T線），以1.0 mg/mL驢抗鼠IgG噴涂質(zhì)控線（C線），制備免疫層析試紙條。采用建立的基于免疫磁分離的熒光微球免疫層析方法檢測豬霍亂沙門氏菌，在PBS緩沖液中檢出限為1.5×105 CFU/mL，牛奶中檢出限為7.6×105 CFU/mL，與直接采用熒光微球免疫層析方法檢測相比，檢出限分別降低了10倍和200倍。本方法可有效富集牛奶中的沙門氏菌，避免了基質(zhì)干擾，靈敏度大大提高，具有較好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞免疫磁分離； 熒光微球； 免疫層析； 豬霍亂沙門氏菌

1引 言

沙門氏菌是一類能夠?qū)е氯诵蠊不技膊〉氖吃葱灾虏【鶾1]，可以引起腸胃炎、傷寒、敗血癥等多種疾病[2，3]。傳統(tǒng)的沙門氏菌檢測方法，需經(jīng)過前增菌、選擇性增菌、分離培養(yǎng)等過程，費(fèi)時（5～7天）費(fèi)力[4]。而其它檢測方法，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[5]、電化學(xué)法[6]、酶聯(lián)免疫吸附法[7]和石英晶體微天平法[8]等，雖然靈敏度較高，但操作繁瑣，難以滿足現(xiàn)場檢測的需求。

免疫層析法具有簡便、快速和靈敏等優(yōu)勢，已廣泛應(yīng)用于食品安全[9]、醫(yī)學(xué)檢驗[10]和環(huán)境檢測[11]等領(lǐng)域。熒光微球（Fluorescent microspheres， FMs）為發(fā)射光譜類的新型標(biāo)記物，能有效消除背景干擾[12]，提高檢測靈敏度[13～15]。但熒光微球免疫層析方法（FM lateral flow assay， FMLFA）用于實際樣品的檢測時，常由于目標(biāo)菌濃度低、基質(zhì)成分復(fù)雜，對檢測結(jié)果有較大的影響[16，17]。

免疫磁分離（Immunomagnetic separation， IMS）利用免疫磁性材料的磁性和特異性，在外加磁場作用下，將基質(zhì)中的目標(biāo)物分離、富集[18]。此方法能有效濃縮目標(biāo)物，避免基質(zhì)對檢測過程的干擾，因此常作為食品、醫(yī)學(xué)、環(huán)境檢測中的前處理手段[19，20]。

目前，已有集成IMS和膠體金免疫層析方法的報道[21，22]，與傳統(tǒng)膠體金免疫層析方法相比，此方法的靈敏度更高，檢出時間更短，但靈敏度偏低[23]，因此，將高靈敏的熒光微球免疫層析法與IMS結(jié)合，有望進(jìn)一步提高方法的檢測靈敏度。本研究建立了基于IMS的FMLFA法檢測豬霍亂沙門氏菌的方法，對于食品中食源性致病菌的檢測具有重要參考意義。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

熒光微球試紙條讀取儀（上海互幗科學(xué)儀器有限公司）； XYZB3050噴點(diǎn)平臺（美國BIODOT公司）； HGS201切條機(jī)（杭州峰航科技有限公司）。

表面羧基化的熒光微球（直徑175 nm，最大激發(fā)波長470 nm，最大發(fā)射波長525 nm，10 mg/mL， 德國默克公司）； 表面羧基化的磁珠（Magnetic nanobeads， MNBs， 上海奧潤微納新材料科技有限公司，直徑180 nm，10 mg/mL）； 抗豬霍亂沙門氏菌單克隆抗體11D8D4、5F11B11（實驗室自制）[22]； 驢抗鼠IgG （北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）； PVC底板、聚酯膜、吸水紙（上海金標(biāo)生物技術(shù)有限公司）； 牛血清蛋白（BSA，Amresco公司）； 酪蛋白（美國Sigma公司）； 硝酸纖維素膜（NC膜，德國Sartorius公司）； BCA蛋白微量定量試劑盒（美國賽默飛公司）； 1（3二甲氨基丙基）3乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N羥基硫代琥珀酰亞胺（NHSS）、2（N嗎啉）乙磺酸（MES）等化學(xué)試劑均為分析純，購于上海阿拉丁試劑有限公司； 牛奶購自本地超市。

豬霍亂沙門氏菌（ATCC 10708）、甲型副傷寒沙門氏菌（ATCC9150）、鼠傷寒沙門氏菌（ATCC 13311）、腸炎沙門氏菌（ATCC 13076）、鴨沙門氏菌（ATCC 9270）、普通大腸桿菌（ATCC 25922）、大腸桿菌O157∶H7（ATCC 43888）、阪崎腸桿菌（CMCC 45401）、單增李斯特菌（ATCC 13932）、枯草芽孢桿菌（BD168， 菌株來自江西省疾病預(yù)防控制中心）、普通變形桿菌（CMCC 49027）、蠟樣芽孢桿菌（CMCC 63305）、福氏志賀氏菌（CMCC 2457）、藤黃微球菌（CMCC 28001）保存于本實驗室。

2.2免疫磁珠的制備與優(yōu)化

2.2.1免疫磁珠的制備取100 μL磁珠母液，用MEST緩沖液（0.01 mol/L MES，pH 5.5，0.02% Tween20）洗滌3次。加入1 mL新配制的10 mg/mL的EDC和NHSS溶液重懸。室溫下混旋，活化1 h后，磁分離，棄上清液，沉淀用1 mL 0.01 mol/L硼酸硼砂緩沖液（BS， pH 8.5）重懸。加入30 μg/mg（抗體/磁珠）單抗11D8D4，室溫下混旋標(biāo)記1 h，磁分離，棄上清液。沉淀以1 mL 含1% BSA的BS緩沖液重懸，室溫下混旋封閉1 h。經(jīng)磁分離棄上清液，沉淀用BST緩沖液（0.01 mol/L PBS，pH 8.5，0.02% Tween20）洗滌3次，以100 μL重懸液（0.01 mol/mL PBS，pH 8.5； 1% BSA； 5% 蔗糖； 3% 海藻糖； 0.05% PEG20000； 0.4% Tween20； 0.05% NaN3）重懸，4℃保存，備用。

2.2.2免疫磁珠抗體標(biāo)記量的優(yōu)化按照2.2.1節(jié)方法，分別按抗體/磁珠=0、20、30、40和50 μg/mg（w/w）的比例加入單抗11D8D4制備免疫磁珠（Immunomagnetic beads，IMBs）。分別取100 μg IMBs與1 mL豬霍亂沙門氏菌菌液（2.1×106 CFU/mL）混合，室溫下混旋反應(yīng)1 h，磁分離，取上清液，用平板計數(shù)法計算菌數(shù)，按公式（1）計算捕獲率（Capture efficiency， CE）。所有數(shù)據(jù)均為3次實驗的平均值。

2.3.3IMBs的特異性分析

1株豬霍亂沙門氏菌和13株非豬霍亂沙門氏菌被用于IMBs的特異性分析實驗。分別取1 mL待檢菌菌液（106 CFU/mL），加入100 μg IMBs，室溫反應(yīng)1 h，磁分離，計算CE。

2.4免疫熒光微球的制備與條件優(yōu)化

2.4.1免疫熒光微球的制備取1 mL 磷酸鹽緩沖液（PB， pH 6， 0.02 mol/L），加入50 μg 熒光微球，渦旋混勻后加入5 μL EDC溶液（1 mg/mL）。磁力攪拌下，緩慢加入11D8D4抗體，反應(yīng)2 h， 11000 r/min離心20 min，取上清液，用BCA試劑盒測上清中的游離抗體含量，按公式（2）計算抗體偶聯(lián)率（Conjugating ratio， CR）。沉淀以1 mL PB緩沖液重懸，加入100 μL 5%酪蛋白封閉1 h。11000 r/min離心20 min，棄上清液，沉淀用100 μL 重懸液（0.02 mol/L Na2HPO3，pH 7.4； 3%海藻糖； 1% 酪蛋白； 3%蔗糖； 0.1% 疊氮化鈉； 1% Tween20）重懸， 4℃保存。

CR=c1-c2c1×100%（2）

式中， c1為加入抗體量， c2為上清液中游離抗體量。

2.4.2標(biāo)記參數(shù)的優(yōu)化在不同pH條件下制備免疫熒光微球（Immunofluorescent microspheres， IFMs），測量抗體偶聯(lián)率，然后以制備的IFMs檢測豬霍亂沙門氏菌（1.52×106和1.52×107 CFU/mL）； 分別按抗體/熒光微球=100， 200， 300， 400， 500和600 μg/mg（w/w）的比例加入單抗11D8D4制備IFMs，并測量抗體偶聯(lián)率，然后以制備的IFMs檢測豬霍亂沙門氏菌。

2.5FMLFA的優(yōu)化與評價

2.5.1熒光微球免疫層析試紙條的組裝NC膜上分別噴涂抗豬霍亂沙門氏菌單抗5F11B11和驢抗鼠IgG（1.0 mg/mL）作為檢測線（T 線）和質(zhì)控線（C線），30 ℃真空干燥4 h。將樣本墊、結(jié)合墊、NC膜、吸水紙依次粘貼在PVC底板上，組裝成試紙條。

2.5.2T線抗體濃度的優(yōu)化分別以0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 mg/mL的5F11B11抗體噴涂T線，取100 μL 豬霍亂沙門氏菌（1.52 ×107，3.8 × 106和1.9 × 106 CFU/mL）與2 μL IFMs預(yù)反應(yīng)5 min，然后用熒光微球免疫層析試紙條檢測，10 min后用熒光讀取儀測定T線信號值。

2.5.3FMLFA的特異性分析1株豬霍亂沙門氏菌和13株非豬霍亂沙門氏菌被用于試紙條的特異性實驗。分別取100 μL待檢菌菌液（1×107 CFU/mL）和2 μL免疫熒光微球預(yù)反應(yīng)5 min，然后用熒光微球免疫層析試紙條檢測，10 min后用熒光讀取儀測定T線信號。

2.6基于IMS的FMLFA的建立與評價

2.6.1基于IMS的FMLFA的建立向1 mL 豬霍亂沙門氏菌菌液中加入100 μg免疫磁珠，室溫下反應(yīng)1 h，磁分離，棄上清液，沉淀以100 μL PBS重懸，90℃水浴10 min，洗脫磁珠上的目標(biāo)菌[24]，磁分離后用FMLFA檢測。

2.6.2FMLFA與基于IMS的FMLFA在不同基質(zhì)中靈敏度的比較取PBS梯度稀釋豬霍亂沙門氏菌（0， 7.6×104， 1.52×105， 7.6×105， 1.52×106， 3.8×106， 7.6×106和1.52×107 CFU/mL），分別按照2.5.3和2. 6.1節(jié)的方法進(jìn)行檢測。

取100 μL豬霍亂沙門氏菌加標(biāo)的牛奶（終濃度為0， 7.6×104， 1.52×105， 7.6×105， 1.52×106， 3.8×106， 7.6×106， 1.52×107 ， 1.52×108和3.14×108 CFU/mL），按照2.5.3節(jié)的方法進(jìn)行檢測。取1 mL豬霍亂沙門氏菌加標(biāo)的牛奶（終濃度為0， 7.6×104， 1.52×105， 7.6×105， 1.52×106， 3.8×106， 7.6×106和1.52×107 CFU/mL），按照2.6.1節(jié)的方法進(jìn)行檢測。

3結(jié)果與討論

3.1IMBs抗體標(biāo)記量及IMBs用量的優(yōu)化

如圖1A所示，隨著標(biāo)記抗體投入量的增加，IMBs對豬霍亂沙門氏菌的捕獲率不斷升高，當(dāng)抗體投入量為30 μg/mg磁珠時，捕獲率為93.75%，隨抗體投入量不斷增加，捕獲率趨于穩(wěn)定。這是由于磁珠表面羧基量是一定的，隨著標(biāo)記抗體量的增加，磁珠表面偶聯(lián)的抗體量逐漸增加，并至趨于穩(wěn)定，免疫磁珠對豬霍亂沙門氏菌的捕獲率也趨于穩(wěn)定。因此最優(yōu)抗體投入量選擇為抗體/磁珠=30 μg/mg（w/w）。

如圖1B所示，隨著IMBs用量的增加，IMBs對豬霍亂沙門氏菌的捕獲率逐漸增大，當(dāng)IMBs的用量為100 μg/mL時，捕獲率達(dá)到90%，增加IMBs的用量到200 μg/mL時，捕獲率沒有明顯增加。因此，最優(yōu)IMBs用量選擇為100 μg/mL。

3.2對不同濃度的豬霍亂沙門氏菌的捕獲效率

如圖1C所示，制備的IMBs對2.1×102， 2.1×103， 2.1×104， 2.1×105和2.1×106 CFU/mL的豬霍亂沙門氏菌捕獲率均達(dá)到90%以上，說明制備的IMBs可對濃度102～106 CFU/mL的豬霍亂沙門氏菌進(jìn)行有效富集。

3.3IMBs特異性實驗的結(jié)果

IMBs對1×107 CFU/mL豬霍亂沙門氏菌的捕獲率可達(dá)93%，對1×107 CFU/mL 的13株非豬霍亂沙門氏菌的捕獲率小于5%，表明IMBs捕獲特異性較好。

3.4IFMs標(biāo)記條件的優(yōu)化

3.4.1IFMs標(biāo)記pH值的優(yōu)化pH值對熒光微球的標(biāo)記影響很大，會影響抗體表面可供偶聯(lián)的活性基團(tuán)的數(shù)量和其暴露程度，從而影響偶聯(lián)率，也可能影響抗體和熒光微球的結(jié)合方式，從而影響IFMs的活性[25]。如表1所示，當(dāng)pH=6時，偶聯(lián)率最高。檢測1.52×107 CFU/mL的目標(biāo)菌時，T線的信號值最大。檢測1.9×106 CFU/mL目標(biāo)菌時，只有pH=6的條件對應(yīng)試紙條T線出現(xiàn)信號。因此，最佳標(biāo)記條件選擇pH 6。

AbstractImmunomagnetic separation （IMS） was coupled with fluorescent microspheres lateral flow assay （FMLFA） for rapid detection of S. choleraesuis in this study. The target bacteria were firstly enriched from sample by immunomagnetic beads （IMBs）， then eluted by heat treatment and detected by fluorescent microspheres lateral flow test strip. The IMBs was labeled with 30 μg/mg antibody， and the capture efficiency was greater than 90% against 102-106 CFU/mL of S. choleraesuis with great specificity. The immunofluorescent microspheres were prepared by coupling 300 μg of 11D8D4 monoclonal antibody with 1 mg of fluorescent microspheres at pH 6. Monoclonal antibody 5F11B11 （2.0 mg/mL） and donkey antimouse IgG （1.0 mg/mL） were sprayed on nitrocellulose membrane as test line and control line， respectively. The FMLFA based on IMS was used to detect S. choleraesuis in PBS and milk. The limits of detection in PBS buffer and milk were 1.5×105 CFU/mL and 7.6×105 CFU/mL respectively， which were 10 and 200 times lower than that of traditional fluorescent microspheres lateral flow assay， respectively. The results showed that the method， which could enrich S. choleraesuis in milk effectively， could avoid matrix interference and improve the detection sensitivity， thus had a good application prospect.

KeywordsImmunomagnetic separation； Fluorescent microspheres； Lateral flow assay； S. choleraesuis