酯型茶黃素酶促氧化制備條件研究

王佛生，武永福

(隴東學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院，甘肅慶陽745000)

酯型茶黃素酶促氧化制備條件研究

王佛生，武永福

(隴東學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院，甘肅慶陽745000)

茶黃素是一類具有苯并卓酚酮結(jié)構(gòu)的植物酚性色素，具有較強的生物活性和多種藥理功能，尤其是酯型茶黃素[1]。為了系統(tǒng)研究酯型茶黃素酶促氧化形成的影響因素及其機理，應(yīng)用馬鈴薯作為多酚氧化酶(PPO)的酶源制取茶黃素，以期為酯型茶黃素的酶促氧化制備提供新的工業(yè)化生產(chǎn)高效途徑。對酯型茶黃素酶促氧化形成條件實驗表明，兒茶素4g、反應(yīng)pH值5.5、反應(yīng)時間60min、反應(yīng)溫度35℃、粗酶液25g、檸檬酸緩沖液100ml的反應(yīng)體系，酯型茶黃素形成量較高，由此可見在工業(yè)生產(chǎn)茶黃素時可加入馬鈴薯粗酶液以降低成本，提高其產(chǎn)率及其品質(zhì)。

酯型茶黃素；酶促氧化；兒茶素；多酚氧化酶

酶促氧化制取茶黃素主要是利用茶葉本身或外源多酚氧化酶(PPO)和過氧化物酶(POD)的氧化特性來有目的地生產(chǎn)茶黃素。其機理是PPO對兒茶素進行氧化導(dǎo)致醌類形成，再經(jīng)非酶性次級氧化變化，從而生成茶黃素。酶促氧化方面的研究較早、方法新穎且成果顯著，如茶鮮葉勻漿懸浮發(fā)酵、雙液相系統(tǒng)酶化學(xué)技術(shù)和固定化酶技術(shù)等，都得到了深入研究，取得了很好的效果。但是由于受到酶制劑的安全性及成本限制，工業(yè)化制備酯型茶黃素成本仍然較高，每克茶色素中酯型茶黃素含量不超過90mg[1-11]。本試驗利用馬鈴薯多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)來氧化綠茶兒茶素，以期獲得工業(yè)化制備酯型茶黃素的最佳氧化條件，使酯型茶黃素的定向生物合成具有更高的收率。同時，以茶黃素各單體的積累量為指標，優(yōu)化氧化條件，探索pH值、時間、溫度、酶添加量、底物添加量對茶黃素各單體合成的影響，能更好地調(diào)控兒茶素定向合成生物活性更高的茶黃素制品，為茶黃素的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供一定的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

馬鈴薯(慶陽市售新鮮)；兒茶素(實驗室浸提，高效液相分析其組分為EGC 4.237%，DL-C 6.403%，EC 9.513%，EGCG 26.608%，GCG 2.567%，ECG 24.087%)。高效液相色譜系統(tǒng)(島津LC-20AT，日本島津公司，SCL20AT控制系統(tǒng)，SPD-20A檢測器，LC-20AT泵，Class-Vp色譜工作站)；格蘭仕WP800A微波爐。

1.2 實驗方法

1.2.1 粗酶液制備

將30g馬鈴薯加入100ml pH值為5.5的預(yù)冷檸檬酸—磷酸氫二鈉緩沖液中(含適量PVP，其安全有效價廉，也可用其他緩沖液，但價格較高，效果相當(dāng))，于組織搗碎機中搗碎5min后，紗布擠壓過濾，于冷凍離心機中4℃離心20min(6000r/min)，得上清液為粗酶液。

1.2.2 最佳反應(yīng)時間選擇

稱取1.00g兒茶素溶解于100ml pH值為5.6的馬鈴薯多酚氧化酶酶液中，通入氧氣(也可通入凈化空氣或劇烈攪拌)，在恒溫振蕩器中35℃條件下，分別反應(yīng)40min、50min、60min、70min、80min，取15ml反應(yīng)液微波爐中加熱30s終止反應(yīng)，定容至15ml，再從中取5ml稀釋至50ml，樣品2次重復(fù)，高效液相色譜檢測，對各物質(zhì)各階段的峰面積作橫向比較。以含量最高時的數(shù)據(jù)作為分析數(shù)據(jù)，測定不同時間下酯型茶黃素的含量。

1.2.3 最佳反應(yīng)pH值選擇

選擇溶液pH值分別為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，其他條件同上，測定不同pH值下酯型茶黃素的含量。

1.2.4 最佳反應(yīng)溫度選擇

設(shè)置溫度分別為15℃、25℃、35℃、45℃和55℃，其他條件同上，測定不同溫度下酯型茶黃素的含量。

1.2.5 最佳底物濃度選擇

稱取1.00g、2.00g、3.00g、4.00g、5.00g兒茶

素溶解于100ml pH值5.5的馬鈴薯多酚氧化酶酶液中，其他條件同上，測定不同底物濃度下酯型茶黃素的含量。

1.2.6 最佳粗酶液用量選擇

稱取粗酶液用量10g、20g、30g、40g、50g，加入緩沖液100ml制成不同濃度的粗酶液，其他條件同上，測定不同底物濃度下酯型茶黃素的含量。

1.2.7 高效液相色譜法檢測

色譜條件如下：

色譜柱：waters C18(250mm×4.6mm，0.25μm)；柱溫：35℃；流動相：流動相A為2%醋酸，流動相B為乙腈∶乙酸乙酯=21∶3(V/V)，使用前經(jīng)微孔濾膜(0.45μm)過濾；體積流速：0.9ml/min；檢測波長：280nm；進樣量：10μl。

表1 梯度洗脫表

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯PPO酶促氧化形成酯型茶黃素的反應(yīng)時間曲線

兒茶素在馬鈴薯多酚氧化酶酶促氧化過程中，茶黃素類物質(zhì)變化的時間曲線如圖1所示。在反應(yīng)前60min內(nèi)，茶黃素類物質(zhì)均呈顯著增加趨勢，是茶黃素合成的線性增長期。TF在60min時積累量最大，之后略有減少。TF-3-G的生成量在發(fā)酵全過程始終處于主導(dǎo)地位，明顯高于其它3種茶黃素單體，在70min時積累量最大，但與60min時的生成量相比無明顯增加。TF-3′-G和TFDG的生成量較小，在反應(yīng)過程中均呈先增加后減少的趨勢，且在60min至70min時間內(nèi)含量無明顯增加，70min后4類物質(zhì)都有所減少。因此，確定茶黃素類物質(zhì)的最佳反應(yīng)時間是60min。

圖1 反應(yīng)時間對酯型茶黃素形成的影響

圖2 樣品粗提物的HPLC分析譜圖

酯型茶黃素反應(yīng)時間(min) 40 50 60 70 80 TF?3?G(mAu?s)234055255960285722273817271020TF?3′?G(mAu?s)33093371387437133675TFDG(mAu?s)26202748306829402910

2.2 pH對馬鈴薯PPO酶促氧化形成酯型茶黃素的影響

反應(yīng)體系pH值通過對酶活性和底物及產(chǎn)物穩(wěn)定性兩方面來影響茶黃素合成。從表3可以看出，隨著反應(yīng)體系pH值逐漸增加，茶黃素各單體的積累量也呈逐漸增長趨勢，在pH值5.5時，各單體積累量均達最大值。其中，TF-3′-G受pH值變化的影響較其它三種更大。當(dāng)反應(yīng)體系pH值大于5.5時，各單體的積累量均有所減少。

表3 pH對酯型茶黃素合成的影響

圖3 水洗脫液HPLC分析譜圖

2.3 溫度對馬鈴薯PPO酶促氧化形成酯型茶黃素的影響

溫度對茶黃素各單體的影響結(jié)果如表4所示，即在15～35℃范圍內(nèi)，各單體隨反應(yīng)體系溫度的上升，積累量也不斷增加，在35℃時達最大值；當(dāng)溫度進一步升高，則積累量有所下降，說明馬鈴薯PPO酶促氧化形成酯型茶黃素的最適溫度是35℃。

2.4 底物用量對馬鈴薯PPO酶促氧化形成酯型茶黃素的影響

從反應(yīng)平衡的角度出發(fā)，反應(yīng)體系中底物濃度越高，產(chǎn)品的積累量也越高。從表5我們可以看出，隨著底物濃度的逐漸增加，茶黃素各單體積累量也不斷增加，當(dāng)?shù)孜锾砑恿窟_到4g后，產(chǎn)物積累量的增速明顯減緩，所以用馬鈴薯PPO酶促氧化形成酯型茶黃素的最佳底物添加量為4g，另外還可以發(fā)現(xiàn)四種單體的變化規(guī)律一致。

表4 溫度對酯型茶黃素形成的影響

表5 兒茶素用量對酯型茶黃素形成的影響

2.5 粗酶液用量對茶黃素形成的影響

試驗結(jié)果如表6所示，即在10～30g范圍內(nèi)隨著粗酶液用量逐漸增加，茶黃素各單體形成量逐漸增加，其中TF和TF-3-G在粗酶液用量為30g時，積累量最高，此后逐漸降低。TF-3′-G和TFDG在粗酶液用量超過20g時，積累量的增速放緩，當(dāng)粗酶液用量為30g時，積累量達最大值。而當(dāng)粗酶液用量超過30g，各茶黃素單體的含量保持相對穩(wěn)定。因此，我們選擇粗酶液用量為30g。

表6 粗酶液用量對酯型茶黃素形成的影響

圖4 20%酒精洗脫液的HPLC分析譜圖

圖5 60%酒精洗脫液HPLC分析譜圖

圖6 80%酒精洗脫液HPLC分析譜圖

2.6 最佳反應(yīng)條件的確定

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取pH值、溫度、底物濃度、粗酶液用量四個主要因素做四因素三水平正交實驗，實驗方案及結(jié)果分析見表7、表8。

極差分析表明，對于TF-3-G與TF-3’-G而言，各因素影響效果從高到低依次為A>C>B>D，即底物用量對TF-3-G與TF-3’-G的積累量影響最大，其次是酶用量和pH值，影響最小的是溫度。對于TFDG而言，影響最大的因素是底物用量，其次是溫度和pH值，影響最小的是酶用量,即A>D>B>C。結(jié)合K值分析，可以看出對TF-3’-G和TF-3-G而言，最佳的反應(yīng)條件是A2C3B2D2；對于TFDG而言，最佳反應(yīng)條件為A2D1B1C1。

對于總的三種酯型茶黃素而言，最佳反應(yīng)條件為A2C1B2D2。即用4g兒茶素在pH值為5.5、溫度為35℃、25g粗酶液制成的100ml檸檬酸緩沖液中反應(yīng)60min，得到的酯型茶黃素含量最高。

表7 因素水平表

表8 正交實驗

3 結(jié)論與分析

(1)由于紅茶中茶黃素含量低、提取分離純化難、化學(xué)氧化法制取TFs時試劑污染等弊端，并且茶黃素中藥理作用較強的是酯型茶黃素，所以本試驗采用生物PPO酶源氧化制取酯型茶黃素。

(2)對三種酯型茶黃素而言，最佳反應(yīng)條件為A2C1B2D2，即用4g兒茶素在pH值為5.5、溫度為35℃、25g粗酶液制成的100ml檸檬酸緩沖液中反應(yīng)60min，所得的酯型茶黃素含量最高，茶色素中酯型茶黃素含量達到80mg/g,達到其他酶制劑的工業(yè)化氧化合成水平，但是成本大幅降低，可以證明馬鈴薯多酚氧化酶是工業(yè)化生產(chǎn)制備酯型茶黃素的有益途徑。另外，反應(yīng)液在微波中迅速升溫，可迅速鈍化馬鈴薯多酚氧化酶活性，從而終止反應(yīng)進一步進行，有利于提高酯型茶黃素產(chǎn)量和質(zhì)量。

(3)本試驗直接利用馬鈴薯多酚氧化酶制備酯型茶黃素取得了一定效果。外源酶的利用給茶黃素的研究帶來了新的思路，這可能是未來茶黃素生物制取的主要途徑。

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【責(zé)任編輯 趙建萍】

Study on Optimum Condition of the Formation of Ester Type Theaflavins by Enzymatic Oxidation

WANG Fo-sheng, WU Yong-fu

(College of Agriculture and Forestry Science and Technology,Longdong University,Qingyang 745000,Gansu)

Theaflavins is a kind of benzene and phenol ketone structure of plant phenolic pigment, and has strong biological activity and pharmacological functions, especially the ester type theaflavins[1]. In order to research ester type theaflavins influencing factors, mechanism of enzymatic oxidation formation, new industrialized production and efficient way, we test and apply potatoes as a source of polyphenol oxidase (PPO) enzymes to prepare theaflavins. The test on Theaflavins enzymatic oxidation of ester type forming condition experiments shows that ester type theaflavins formation quantity is higher with the catechins 4g, pH 5.5, time 60 min, temperature 35 ℃, thick enzyme fluid 25g, citric acid buffer solution 100 ml. Thus, if we add potato thick enzyme fluid, we can reduce cost and improve the yield and quality in industrial production of theaflavins.

ester type theaflavins; enzymatic oxidation; catechin; polyphenol oxidase

1674-1730(2017)01-0043-05

2016-06-15

隴東學(xué)院博士啟動基金《慶化煉油廠及周邊地表能土壤中重金屬、PAHS富集規(guī)律及健康風(fēng)險評估》(XYBY1606)

王佛生(1957—)，男，甘肅慶陽人，教授，主要從事農(nóng)業(yè)昆蟲研究。

S-02

A