五味子乙素對NAFLD細(xì)胞模型肝脂質(zhì)堆積、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路蛋白及脂肪酸合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

尉捷 董艷敏 王輝 王育林

摘要：目的??觀察五味子乙素（SchB）對非酒精性脂肪肝（NAFLD）肝脂質(zhì)堆積、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路蛋白及脂肪酸合成相關(guān)基因表達(dá)的影響，探討其降脂作用機制。方法??培養(yǎng)正常人L02細(xì)胞株，加入游離脂肪酸的混合物（油酸∶軟脂酸=2∶1），培養(yǎng)24 h誘導(dǎo)肝脂肪變性，建立NAFLD細(xì)胞模型。給予不同濃度SchB干預(yù)細(xì)胞模型，流式細(xì)胞術(shù)檢測脂肪堆積，檢測三酰甘油（TG）含量，Western blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路相關(guān)蛋白Bip、PERK、p-PERK、p-eIF2α、SREBP-1的表達(dá)，RT-PCR檢測脂肪酸合成相關(guān)基因硬脂酰CoA去飽和酶（SCD）、甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶（GPAT）、乙酰CoA羧化酶（ACC）、脂肪酸合成酶（FAS）的表達(dá)。結(jié)果??體外實驗成功建立L02細(xì)胞脂肪堆積模型。與模型組比較，SchB組脂質(zhì)堆積顯著降低（P<0.05），且SchB可劑量依賴性降低TG水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）;模型組較對照組Bip、SREBP-1、p-PERK、p-eIF2α蛋白和ACC、FAS、GPAT基因表達(dá)均上調(diào)，SCD基因表達(dá)下調(diào);與模型組比較，SchB各濃度組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路蛋白和ACC、FAS、GPAT基因表達(dá)均明顯下調(diào)，SCD基因表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論??SchB可能通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路蛋白的表達(dá)，進(jìn)而影響脂肪合成相關(guān)基因表達(dá)，從而降低肝臟TG的堆積。

關(guān)鍵詞：五味子乙素;非酒精性脂肪肝病;細(xì)胞模型;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;L02細(xì)胞株

中圖分類號：R285.5 ???文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ???文章編號：1005-5304（2019）12-0045-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.12.011 ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Effects of Schisandrin B?on Hepatic Lipid Accumulation， Endoplasmic Reticulum Stress Signaling Pathway Protein and Expressions of?Fatty Acid Synthesis-related Genes in Nonalcoholic Fatty Liver Disease Cell Model

YU Jie^1，2， DONG Yanmin³， WANG Hui²， WANG Yulin¹

1. Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China; 2. Beijing City University， Beijing 100083， China; 3.?Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China

Abstract： Objective To observe?the effects of Schisandrin B （SchB）?on hepatic lipid accumulation， endoplasmic reticulum stress signaling pathway and expressions of fatty acid synthesis-related genes in nonalcoholic fatty liver disease （NAFLD）; To explore the mechanism of action of lipid lowering. Methods?NAFLD cell model was induced by incubating a normal human hepatocytes-derived cell line L02 with 1 mmol/L?free fatty acids mixture （oleate and palmitate， 2：1） for 24 hours. This model then was treated with different concentrations of SchB， and?the cellular total lipid accumulation was determined by flow cytometry. Intracellular triglyceride （TG） contents were measured. Endoplasmic reticulum stress signaling pathway-associated proteins?Bip， SREBP-1， PERK， p-PERK，?and p-eIF2α?were detected by Western blot.?Fatty acid synthesis of stearoyl-CoA desaturase （SCD）， glycerin-3-phosphate acyltransferase （GPAT）， acetyl CoA carboxylas （ACC） and fatty acid?synthase （FAS） were detected by?RT-PCR. Results?The L02 cell fat accumulation model was successfully established in vitro.?Compared with the model group，?the lipid accumulation in the SchB group significantly decreased （P<0.05）， and SchB could decrease the TG level in a dose-dependent manner， with statistical significance?（P<0.05， P<0.01）; Compared with the control group， the expressions of Bip， SREBP-1， p-PERK， p-eIF2α protein and ACC， FAS and GPAT genes were up-regulated， and the expression of SCD gene was down-regulated; Compared with the model group， the expressions of endoplasmic reticulum?stress signal pathway protein and ACC， FAS and GPAT genes in SchB concentration groups were significantly down-regulated， and the expression of SCD gene was up-regulated， with statistical significance （P<0.05， P<0.01）.?Conclusion?SchB?may inhibit the accumulation of liver TG by inhibiting the expressions of endoplasmic reticulum stress signaling pathway proteins， thereby affecting the expressions of genes involved in fat synthesis.

Keywords：Schisandrin B; nonalcoholic fatty liver disease; cell model; endoplasmic reticulum?stress; cell line L02

非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種常見肝病，以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變和脂肪蓄積為病理特征。近年來，NAFLD在我國發(fā)病率大幅提高，我國成年人NAFLD發(fā)病率達(dá)12%～15%^[1]。迄今臨床尚無批準(zhǔn)的治療NAFLD的特效藥物，因此相關(guān)藥物研究已成為熱點。五味子乙素（Schisandrin B，SchB）是五味子中主要的木脂素類活性成分，前期研究發(fā)現(xiàn)，五味子乙素對NAFLD小鼠具有治療作用^[2]。有研究顯示，肝脂質(zhì)堆積與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路具有相關(guān)性^[3]，為進(jìn)一步探究SchB的藥理作用，本研究以游離脂肪酸（FFA）共培養(yǎng)人胚胎肝細(xì)胞L02，誘導(dǎo)體外NAFLD細(xì)胞模型。通過流式細(xì)胞技術(shù)、組織細(xì)胞酶法評價SchB對肝脂質(zhì)堆積和三酰甘油（TG）含量的影響，采用Western blot和RT-PCR分別檢測與NAFLD發(fā)病相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路相關(guān)蛋白和FFA合成相關(guān)基因的表達(dá)，探討SchB降脂的作用機制。

1 ?材料與方法

1.1 ?細(xì)胞株

人胚胎肝細(xì)胞L02細(xì)胞株，購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 ?藥物與試劑

SchB，成都普瑞法公司，批號130620。油酸、軟脂酸、尼羅紅、二甲基亞砜、牛血清白蛋白（BSA），Sigma公司;DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶溶液，美國GIBCO公司;胎牛血清（FBS）、0.1 mol/L PBS，美國Hyclone公司;BCA法蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒、RIPA蛋白裂解液和ECL發(fā)光試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司;TG酶法測定試劑盒，北京普利萊基因技術(shù)有限公司;Trizol試劑，Invitrogen公司;GoScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒，Promega公司;蛋白酶抑制劑，Pierce公司;磷酸酶抑制劑，Roche公司;兔抗人SREBP-1抗體、PERK抗體、Bip抗體、p-eIF2α抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG，Cell Signaling公司;NC膜，PALL公司;其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 ?主要儀器

Varioskan flash全波長掃描式多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo Scientific），NanoDrop2000紫外微量分光光度計（美國Thermo Scientific），EPICS-XL型流式細(xì)胞儀（美國Beckman-Coulter），電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（上海天能科技有限公司﹚，PCR儀（美國Bio-Rad），垂直電泳系統(tǒng)MINI-PROTEAN 3（美國Bio-Rad），BYCp-31D電泳槽（北京市六一儀器廠），凝膠成像系統(tǒng)（美國UVP）。

1.4 ?細(xì)胞培養(yǎng)及給藥

將L02細(xì)胞用含10%胎牛血清DMEM于37 ℃、5%CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)，傳代。于6孔板中加入L02細(xì)胞，培養(yǎng)至融合80%，加入含有1%BSA、1 mmol/L的FFA混合物（油酸∶軟脂酸=2∶1）的DMEM培養(yǎng)基，構(gòu)建脂肪肝細(xì)胞模型。同時設(shè)置對照組、模型組和給藥組（1、5、10、50 μmol/L SchB組），對照組加2 mL DMEM，其他組加含F(xiàn)FA的DMEM培養(yǎng)基2 mL，其中給藥組分別加入1、5、10、50 mmol/L SchB貯存液（SchB粉末溶于二甲基亞砜配制）2 μL，于37 ℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，進(jìn)行指標(biāo)測定。每組設(shè)4個復(fù)孔，分別用于檢測脂質(zhì)堆積、TG含量、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路蛋白及脂肪酸合成相關(guān)基因，實驗重復(fù)3次。

1.5 ?流式細(xì)胞儀測定L02細(xì)胞脂肪堆積

上述培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化，1000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌2次×10 min，重懸于1 μmol/L尼羅紅染液1 mL，室溫避光振蕩染色30 min。隨后以預(yù)冷PBS洗滌2次，重懸于500 μL PBS，流式細(xì)胞儀490 nm excitation/570 nm emission隨機計數(shù)10 000個細(xì)胞，檢測其熒光強度，各處理組熒光強度與對照組比較，計算倍數(shù)變化。

1.6 ?三酰甘油含量檢測

上述培養(yǎng)的細(xì)胞分別進(jìn)行胰酶消化，200×g離心5 min，收集細(xì)胞，分別取約1×10⁶個細(xì)胞。參照組織細(xì)胞酶法測定試劑盒說明書方法測定TG含量，參考BCA法蛋白定量檢測試劑盒說明書測定細(xì)胞蛋白濃度，TG含量表示為μmol/L/μg蛋白，各處理組TG含量與對照組比較，計算倍數(shù)變化。

1.7 ?Western blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

胰酶消化上述培養(yǎng)的細(xì)胞，以RIPA裂解液裂解細(xì)胞并收集蛋白，BCA法測定蛋白濃度。將提取的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，每孔上樣50 μg蛋白，隨后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素（NC）膜，以含5%脫脂奶的TBST緩沖液37 ℃封閉30 min，分別加入1∶1000稀釋的相應(yīng)一抗，4 ℃孵育過夜。TBST漂洗3次后加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，漂洗3次。在NC膜上滴加ECL發(fā)光液，暗室壓片、顯影。

1.8 ?RT-PCR檢測脂肪酸合成相關(guān)基因的表達(dá)

收集上述培養(yǎng)的細(xì)胞，加1 mL Trizol，按說明書流程提取RNA，以Nanodrop分光光度計測定RNA濃度。隨后使用Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后，按20 μL體系[2×PCR buffer 10 μL、cDNA 1 μL、上下游引物各1 μL（見表1）、ddH₂O 7 μL]進(jìn)行PCR擴(kuò)增，操作步驟：95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，47 ℃、0 s（β-actin），57 ℃、30 s（ACC），61 ℃、30 s（FAS），55 ℃、30 s（GPAT），55 ℃、30 s（SCD），72 ℃、30 s，30個循環(huán);72 ℃、10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，紫外透視分光儀觀察。

1.9 ?統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5 Demo軟件進(jìn)行分析。實驗數(shù)據(jù)以x（—）±s表示，組間比較采用student-t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 ?結(jié)果

2.1 ?五味子乙素對L02細(xì)胞肝脂肪堆積的影響

尼羅紅是一種親脂性惡嗪類熒光染料，可與FFA、磷脂和膽固醇特異性結(jié)合，在543 nm激發(fā)光激發(fā)下，顯示桔紅色熒光，用流式細(xì)胞儀檢測的尼羅紅熒光強度，與細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量成正比。FFA與L02細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，脂質(zhì)堆積明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，SchB各濃度組L02細(xì)胞脂質(zhì)均減少，1、10 μmol/L SchB組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見圖1。

2.2 ?五味子乙素對L02細(xì)胞三酰甘油含量的影響

與對照組比較，模型組L02細(xì)胞TG含量明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，SchB各濃度組L02細(xì)胞TG含量均降低，除1 μmol/L SchB組外差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），呈劑量依賴性。結(jié)果見圖2。

2.3 ?五味子乙素對L02細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路蛋白表達(dá)的影響

模型組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路活化關(guān)鍵蛋白Bip表達(dá)增加，給予SchB后，隨著SchB濃度增加，Bip表達(dá)量下降，呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，SchB各濃度組L02細(xì)胞p-PERK、p-eIF2α、SREBP-1表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見圖3、表2。

2.4 ?五味子乙素對L02細(xì)胞脂肪酸合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

與對照組比較，模型組L02細(xì)胞ACC、GPAT和FAS表達(dá)升高、SCD表達(dá)降低（P<0.05，P<0.01）;與模型組比較，SchB各濃度組L02細(xì)胞ACC、GPAT和FAS表達(dá)降低，SCD表達(dá)上調(diào)，除1 μmol/L SchB組外差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表3。

3 ?討論

NAFLD是目前常見的肝臟疾病，由于肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積，導(dǎo)致肝臟脂肪變性，引起肝臟代謝功能異常，并引起一系列疾病^[4]。目前常用的NAFLD治療主要有保護(hù)肝細(xì)胞藥、抗氧化劑及降脂藥。SchB具有保護(hù)肝臟、降低轉(zhuǎn)氨酶、修復(fù)受損的肝細(xì)胞的作用^[5]。王昌等^[6]篩選了五味子木質(zhì)素類中護(hù)肝的主成分，分別以五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲等成分作用于受損的L02細(xì)胞，結(jié)果表明SchB的護(hù)肝作用最強。蔡晶等^[7]發(fā)現(xiàn)SchB可減輕H₂O₂導(dǎo)致的細(xì)胞氧化損傷，且這種保護(hù)作用隨SchB劑量的升高而增強。為驗證SchB的降脂效果，我們采用FFA作用L02細(xì)胞，建立NAFLD細(xì)胞模型，給予SchB后，采用流式細(xì)胞儀分析脂質(zhì)含量并進(jìn)行TG檢測，驗證SchB降低脂類堆積的能力。結(jié)果顯示，與模型組比較，SchB干預(yù)后肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量降低，但未呈劑量依賴。結(jié)合前期動物實驗結(jié)果，SchB對膽固醇無明顯作用。因尼羅紅可同時與TG和膽固醇結(jié)合，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)檢測存在膽固醇干擾，可能導(dǎo)致SchB對細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的影響無劑量依賴性。后續(xù)實驗進(jìn)一步檢測其對TG含量的影響，發(fā)現(xiàn)SchB可劑量依賴性降低肝細(xì)胞TG含量，說明其主要通過降低TG含量發(fā)揮降脂作用。

有研究顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與NAFLD發(fā)病機制相關(guān)^[8]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，是脂肪酸代謝的第一場所。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激觸發(fā)的非折疊蛋白反應(yīng)（UPR）由3種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)固有分子介導(dǎo)：Ⅰ型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)膜激酶（IRE-Ⅰ）、活性轉(zhuǎn)錄因子6（ATF-6）和PKR樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）。非應(yīng)激情況下，這3種蛋白均與葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（Grp78/Bip）結(jié)合形成復(fù)合體，處于無活性狀態(tài)。應(yīng)激發(fā)生時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白增多，與Bip競爭性結(jié)合，IRE-Ⅰ、ATF-6和PERK與Bip解離，隨即活化下游轉(zhuǎn)錄因子及UPR靶分子等基因轉(zhuǎn)錄。PERK活化后可磷酸化真核翻譯起始因子eIF2α，繼而活化固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白SREBP-1，活化的SREBP-1進(jìn)入核內(nèi)啟動與脂肪酸和TG合成有關(guān)基因ACC、FAS、低密度脂蛋白受體LDLR等的轉(zhuǎn)錄，從而增加肝臟脂肪酸的合成和積聚^[9-10]。本研究結(jié)果顯示，模型組L02細(xì)胞Bip、SREBP-1、p-eIF2α均升高，且下游基因ACC、FAS、GPAT表達(dá)升高，SCD表達(dá)降低，而加入SchB后呈相反的結(jié)果，提示SchB可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路治療NAFLD。

綜上，在NAFLD細(xì)胞模型中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路被激活，而SchB干預(yù)可劑量依賴性抑制該信號通路，進(jìn)而影響脂肪合成相關(guān)基因表達(dá)，從而降低脂質(zhì)堆積。本研究可為進(jìn)一步探討SchB治療脂肪肝的機理和臨床治療NAFLD新藥的研發(fā)提供依據(jù)。

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（收稿日期：2019-07-18）

（修回日期：2019-08-01;編輯：華強）