NLRP3炎癥小體及其下游炎癥因子在動脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)中的作用

黃巧玲，覃聰，黃廣群

(來賓市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西 來賓 546100)

NLRP3炎癥小體及其下游炎癥因子在動脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)中的作用

黃巧玲，覃聰，黃廣群

(來賓市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西 來賓 546100)

目的探討NLRP3炎癥小體及其下游炎癥因子在動脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)中的作用。方法選擇氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)作用于人單核細(xì)胞系THP-1，經(jīng)Western blot法檢測NLRP3及其下游炎癥因子半胱天冬酶-1(Caspase-1)、白介素-1β(IL-1β)和白介素-18(IL-18)的表達(dá)；并采用SiRNA技術(shù)下調(diào)空白處理組(Blank組)和ox-LDL處理組NLRP3基因表達(dá)，分別檢測以上指標(biāo)。結(jié)果與空白處理組相比，50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L的ox-LDL作用于單核細(xì)胞后可促進(jìn)NLRP3的表達(dá)，NLRP3下游的Caspase-1、IL-1β和IL-18表達(dá)水平與NLRP3表達(dá)一致，表達(dá)也均明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。NLRP3小干擾RNA(SC-45469)轉(zhuǎn)染后，Blank組與ox-LDL組的NLRP3及其下游炎癥因子Caspase-1、IL-1β和IL-18的表達(dá)均有顯著下降(P＜0.05)；而轉(zhuǎn)染后Blank組與ox-LDL組各指標(biāo)下降率組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論NLRP3炎癥小體參與動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的過程，其可能通過改變ox-LDL的表達(dá)水平，誘發(fā)炎癥相關(guān)因子Caspase-1、IL-1β和IL-18的分泌來調(diào)節(jié)，NLRP3炎癥小體具有成為臨床上防治動脈粥樣硬化的新靶點(diǎn)的重要潛力。

動脈粥樣硬化；NLRP3；炎癥小體；氧化低密度脂蛋白；炎癥因子

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是動脈硬化中最常見的一種血管病，以動脈壁的脂質(zhì)沉積、功能紊亂及斑塊形成、慢性炎性細(xì)胞浸潤為主要特征，是冠心病形成及發(fā)展的主要病理過程[1]。研究發(fā)現(xiàn)，膽固醇、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)、感染性微生物、高血壓、吸煙等誘發(fā)因素的共同作用都會誘導(dǎo)慢性炎癥反應(yīng)，從而最終會使得患者的動脈粥樣硬化形成[2]。由于參與動脈粥樣硬化發(fā)生機(jī)制和發(fā)展過程的細(xì)胞因子和基因產(chǎn)物等因素復(fù)雜繁多，導(dǎo)致其在臨床預(yù)防和治療上難度重重，因此發(fā)病率和病死率逐年升高。進(jìn)而，深入探索動脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展的病理生理機(jī)制，尋求臨床治療AS的有效途徑和創(chuàng)新靶點(diǎn)，成為當(dāng)下心血管專家的關(guān)注焦點(diǎn)和研究熱點(diǎn)。為了進(jìn)一步探究AS炎癥反應(yīng)中NLRP3炎癥小體及其下游炎癥因子的作用，本研究通過氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)作用于人單核細(xì)胞系THP-1模擬動脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)，檢測NLRP3、半胱天冬酶-1(Caspase-1)、白介素-1β (interleukin-1β，IL-1β)和白介素-18(interleukin-18，IL-18)的表達(dá)，以闡明NLRP3炎癥小體在AS炎癥反應(yīng)中的作用機(jī)制，為臨床治療AS提供了相關(guān)的理論依據(jù)，同時也提供了新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人單核細(xì)胞系THP-1，購自中國科學(xué)院上海生物細(xì)胞所；ox-LDL，購自北京協(xié)生生物科技有限責(zé)任公司；NLRP3(SC-34411)、Caspase-1 (SC-622)、IL-1β(SC-7884)、IL-18(SC-7954)、β-actin (SC-130656)一抗，羊抗兔IgG，購自美國Santa cruz公司；NLRP3小干擾RNA(SC-45469)，購自美國Santa cruz公司；LipofectamineTM2000 Reagent，購自美國Invitrogen公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 THP-1細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞復(fù)蘇后置入PRIM-1640培養(yǎng)液中，于37℃、5%、CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞生長融合至80%時，胰酶消化并傳代，所有實(shí)驗(yàn)細(xì)胞均選取3～4代進(jìn)行。

1.2.2 Western blot法檢測NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18、β-actin蛋白表達(dá)情況 取對數(shù)生長期細(xì)胞2×108/L接種于6孔培養(yǎng)板中，分為4組，空白對照組和分別加入終劑量為50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L ox-LDL的給藥組，于37℃、5%、CO2條件下培養(yǎng)24 h后用細(xì)胞裂解液提取總蛋白，BCA蛋白定量，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉。NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18、β-actin一抗(1:1 000)過夜，洗膜，孵育二抗(1:50 000)，洗膜，加入ECL試劑，曝光，顯影，定影，分析。

1.2.3 NLRP3小干擾 RNA轉(zhuǎn)染 無血清PRIM-1640培養(yǎng)基稀釋小干擾RNA，參照說明書將300 μL轉(zhuǎn)染復(fù)合物(小干擾RNA與LipofectamineTM2000以1:4混合)靜置15 min后，與THP-1細(xì)胞空白對照組和ox-LDL組(100 mg/L)于37℃、5%、CO2條件下共同孵育6 h，去除培養(yǎng)基更換新鮮培養(yǎng)基，再次檢測以上指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，NLRP3小干擾RNA轉(zhuǎn)染下各指標(biāo)及下降率比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ox-LDL誘導(dǎo)下人單核中NLRP3及其下游炎癥因子的表達(dá)變化 50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L的ox-LDL分別作用于單核細(xì)胞后可促進(jìn)NLRP3的表達(dá)，較空白處理組明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，并具有濃度依賴性；NLRP3下游的Caspase-1、IL-1β和IL-18表達(dá)水平與NLRP3表達(dá)一致，表達(dá)也均顯著升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。

表1 ox-LDL誘導(dǎo)下人單核NLRP3及其下游炎癥因子的表達(dá)變化(±s)

表1 ox-LDL誘導(dǎo)下人單核NLRP3及其下游炎癥因子的表達(dá)變化(±s)

注：與Blank組比較，aP＜0.05。

組別NLRP3caspase-1IL-1βIL-18 Blank組ox-LDL 50 mg/L組ox-LDL 100 mg/L組ox-LDL 150 mg/L組F值P值1.03±0.25 1.52±0.31a1.97±0.29a2.25±0.33a8.332 0.031 1.02±0.27 2.54±0.42a3.24±0.37a4.21±0.45a8.348 0.029 1.05±0.21 2.35±0.38a3.29±0.41a4.40±0.45a8.42 0.026 1.04±0.22 2.25±0.34a3.30±0.39a3.61±0.29a8.451 0.023

2.2 NLRP3小干擾RNA轉(zhuǎn)染對NLRP3及其下游炎癥因子表達(dá)的影響 NLRP3小干擾RNA (SC-45469)轉(zhuǎn)染后，Blank組與ox-LDL組的NLRP3及其下游炎癥因子Caspase-1、IL-1β和IL-18的表達(dá)均有顯著下降(P＜0.05)；而轉(zhuǎn)染后Blank組與ox-LDL組各指標(biāo)下降率組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。

表2 NLRP3小干擾RNA轉(zhuǎn)染對NLRP3及其下游炎癥因子表達(dá)的影響(±s)

表2 NLRP3小干擾RNA轉(zhuǎn)染對NLRP3及其下游炎癥因子表達(dá)的影響(±s)

注：與本組轉(zhuǎn)染前比較，aP＜0.05。

組別Blank組ox-LDL組時間轉(zhuǎn)染前轉(zhuǎn)染后轉(zhuǎn)染前轉(zhuǎn)染后NLRP3 1.02±0.31 0.50±0.35a2.46±0.37 1.53±0.35aCaspase-1 1.04±0.30 0.41±0.32a3.10±0.42 1.31±0.38aIL-1β 1.01±0.39 0.45±0.36a3.03±0.47 1.14±0.37aIL-18 1.05±0.28 0.55±0.44a2.93±0.51 1.32±0.31a

3 討論

動脈粥樣硬化會對大中動脈內(nèi)膜及中層等結(jié)構(gòu)產(chǎn)生重要的影響，最終發(fā)展成為冠心病，也是心腦血管疾病的重要致病因素[3]，而血管壁功能的紊亂以及斑塊形成是動脈粥樣硬化的主要特點(diǎn)。冠心病作為發(fā)達(dá)國家死亡患者的首要原因，已被越來越多的研究學(xué)者所重視，越來越多的研究表明，動脈粥樣硬化歸根究底也是一種慢性炎癥，炎癥的情況會伴隨著動脈粥樣硬化的各個階段，在這整個過程中炎癥細(xì)胞因子起到了重要的作用[4-5]。根據(jù)相關(guān)研究證實(shí)，先天免疫模式識別受體(pattern-recognition receptors，PRRs)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)對動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展起到了重要的作用，同時發(fā)揮著橋梁作用[6]。PRPs主要包括位于胞膜表面的Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)和胞漿內(nèi)的NOD樣受體(NLRs)[7-8]，在NLRs中，NLRP3炎癥小體逐漸被發(fā)現(xiàn)可能參與AS炎癥反應(yīng)。

NLRP3在冠狀動脈硬化早期就開始發(fā)揮作用，LDL可使患者血管壁沉積大量的膽固醇結(jié)晶。當(dāng)巨噬細(xì)胞吞噬這些膽固醇結(jié)晶后，自然而然轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞。而泡沫細(xì)胞通過破壞溶酶體釋放活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)和蛋白酶激活NLRP3，同時進(jìn)一步促使炎癥因子誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞浸潤和活化。而這些活化的細(xì)胞又促進(jìn)IL-1、IL-18等炎癥因子生成，從而引起更多的血管平滑肌細(xì)胞壞死，形成惡性循環(huán)。而在細(xì)胞外的膽固醇和纖維素隨著時間的延續(xù)，不停的進(jìn)行堆積，使得磷酸鈣結(jié)晶，而后沉積，同時又使得巨噬細(xì)胞中溶酶體進(jìn)一步快速破裂[9-11]。本研究指出，NLRP3炎癥小體參與動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的過程，可能是通過改變ox-LDL的表達(dá)水平，誘發(fā)炎癥相關(guān)因子Caspase-1、IL-1β和IL-18的分泌來調(diào)節(jié)的。而我們通過NLRP3小干擾RNA(SC-45469)轉(zhuǎn)染，干預(yù)NLRP3的高水平表達(dá)，從而有效降低了炎癥小體及其下游炎癥因子的表達(dá)水平，本研究指出NLRP3炎癥小體具有成為臨床上防治動脈粥樣硬化的新靶點(diǎn)的重要潛力。但本研究僅局限在ox-LDL的誘導(dǎo)上，動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展還受其他更多的脂質(zhì)體和細(xì)胞因子等調(diào)控，因此在接下來的研究中，筆者需要通過調(diào)節(jié)不同的脂質(zhì)體和其他細(xì)胞因子來模擬動脈粥樣硬化的生理病理過程，并擴(kuò)大炎癥小體的研究范圍，從更全面的角度和視野探索出最佳的治療途徑和方法。

綜上所述，NLRP3炎癥小體參與動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的過程，其可能通過改變ox-LDL的表達(dá)水平，誘發(fā)炎癥相關(guān)因子Caspase-1、IL-1β和IL-18的分泌來調(diào)節(jié)，NLRP3炎癥小體具有成為臨床上防治動脈粥樣硬化的新靶點(diǎn)的重要潛力。

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Roles of NLRP3 inflammasome and its downstream inflammatory cytokines in inflammatory response of atherosclerosis.

HUANG Qiao-ling,QIN Cong,HUANG Guang-qun.Department of Clinical Laboratory,Laibin City Hospital of Traditional Chinese Medicine,Laibin 546100,Guangxi,CHINA

ObjectiveTo investigate the roles of NLRP3 inflammasome and its downstream inflammatory cytokines in inflammatory response of atherosclerosis.MethodsNLRP3 and its downstream inflammatory cytokines of Caspase-1,interleukin-1 beta(IL-1β)and interleukin-18(IL-18)expression were detected by western blot with oxidized low-density lipoprotein(ox-LDL)in human monocytic THP-1 cell line.SiRNA technology was applied to down-regulate the expression of NLRP3 gene in blank treatment group(blank group)and ox-LDL treatment group, and the above indicators were detected.ResultsCompared with the blank group,ox-LDL(50 mg/L,100 mg/L and 150 mg/L)in the mononuclear cells can significantly promote the expression of NLRP3,as well as its downstream in-flammatory cytokines of Caspase-1,IL-1β and IL-18(P＜0.05).After transfection of SiRNA(SC-45469),the expression of NLRP3 and Caspase-1,IL-1β and IL-18 in blank group and ox-LDL treament group were significantly decreased(P＜0.05),but the inhibition rate of each index showed no significant difference between the two groups(P＞0.05).ConclusionNLRP3 inflammasome is involved in the development of atherosclerosis by changing the expression of ox-LDL and inducing the secretion of inflammation-related factors(Caspase-1,IL-1β and IL-18),which has potential to become the new target for the prevention and treatment of atherosclerosis.

Atherosclerosis;NLRP3;Inflammasome;Oxidized low-density lipoprotein;Inflammatory cytokines

R541.4

A

1003—6350（2017）01—0086—03

2016-06-01)

黃巧玲。E-mail：qiaolhuang@163.com

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.01.026