不同品種谷子醇提物抗氧化活性比較

王凌云，宋小清，王曉明，范光宇，趙治海，趙 艷，劉穎慧*

(1.河北北方學(xué)院，河北 張家口 075000; 2.張家口農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河北 張家口 075000)

不同品種谷子醇提物抗氧化活性比較

王凌云1，宋小清1，王曉明2，范光宇2，趙治海2，趙 艷1，劉穎慧1*

(1.河北北方學(xué)院，河北 張家口 075000; 2.張家口農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河北 張家口 075000)

為了解谷子的抗氧化功效，以5個谷子品種為研究對象，測定了谷子醇提物中抗氧化活性物質(zhì)的含量，比較了不同谷子品種醇提物的抗氧化能力，并分析了抗氧化能力與活性成分含量的相關(guān)性。結(jié)果顯示，5個谷子品種總酚、黃酮、α-生育酚含量分別為369.9～793.1、162.1～459.3、7.1～17.1 mg/kg；谷子醇提物的DPPH自由基清除率、OH自由基清除率、還原力的IC50值分別為0.09～0.24、0.41～0.74、0.98～2.35 mg/mL。其中，張雜谷9號的黃酮含量最高，總酚、α-生育酚含量最低，DPPH自由基清除能力最強(qiáng)；8311總酚和α-生育酚含量最高，黃酮含量最低，OH自由基清除能力最強(qiáng)；張雜谷3號提取物的還原力高于其他4個品種。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，谷子提取物對DPPH自由基的清除能力與總酚、α-生育酚含量呈顯著正相關(guān)，與黃酮含量呈顯著負(fù)相關(guān)；對OH自由基的清除能力與總酚、α-生育酚含量呈顯著負(fù)相關(guān)，與黃酮含量呈顯著正相關(guān)；還原力與α-生育酚含量呈顯著負(fù)相關(guān)。

谷子； 醇提取物； 活性成分； 抗氧化作用

氧化是人類新陳代謝的一部分。自由基學(xué)說建立以來，人們發(fā)現(xiàn)自由基對DNA、生物膜以及內(nèi)臟器官都有一定的損傷[1-2]，并且與多種疾病有著密切聯(lián)系[3]。人工合成的抗氧化劑能夠清除自由基，但其工藝復(fù)雜、成本昂貴且對人體有毒害作用，一直無法應(yīng)用于臨床[4]。天然抗氧化劑由于取材于天然的食藥材，對人體毒害作用較小而備受關(guān)注。天然抗氧化成分主要包括多酚類、黃酮類、多糖類及維生素類[5-6]，因具有獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)而能夠清除自由基，進(jìn)而起到抗氧化的作用[7-11]。劉清等[12]研究發(fā)現(xiàn)，大麥提取物具有良好的體外抗氧化作用，而且與提取物中的多酚濃度呈量效關(guān)系。郝亞楠等[13]研究了薏米醇提物對大鼠潰瘍性結(jié)腸的作用，證實薏米提取物具有一定的抗氧化作用。

谷子是重要的農(nóng)作物，營養(yǎng)價值豐富，且具有降血壓、安眠等功效，被譽為“百谷之長”[14-16]。如何充分利用谷子吃出健康，一直是人們探討的話題。目前對于谷子的研究多局限于產(chǎn)量及抗病蟲害等方面[17-19]，對谷子抗氧化功效的研究鮮有報道?！皬堧s谷”是張家口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院歷經(jīng)半個世紀(jì)培育的優(yōu)良雜交谷子系列品種[20]，憑借優(yōu)良的種植效果和優(yōu)異的品質(zhì)、產(chǎn)量以及抗逆特性，近幾年在全國及非洲地區(qū)推廣種植面積迅速擴(kuò)大[21]。為了探究“張雜谷”系列谷子中活性物質(zhì)的抗氧化能力，以常規(guī)品種8311為對照，提取并測定了“張雜谷”系列谷子品種的抗氧化成分(總酚、黃酮和α-生育酚)含量，并比較了其體外抗氧化特性，探討了谷子抗氧化物質(zhì)含量與抗氧化活性的關(guān)系，旨在增進(jìn)人們對谷子抗氧化能力的了解，為人們合理食用谷子以及品種篩選提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試谷子品種分別為張雜谷3號、張雜谷5號、張雜谷9號、張雜谷10號和常規(guī)品種8311，均由張家口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。谷子脫殼去皮獲得小米，于45 ℃烘箱中烘干，粉碎。本試驗以烘干粉碎后的小米為研究對象。

試劑：DPPH、福林試劑、蘆丁、α-生育酚均購自于美國sigma公司；總抗氧化能力試劑盒購自蘇州科銘生物有限公司；甲醇為色譜純；硫酸亞鐵、水楊酸、乙醇、抗壞血酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、葡萄糖等均為分析純。

主要儀器：723N可見分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)、UV-1800島津紫外可見分光光度計(日本島津公司)、JXFM110型錘式旋風(fēng)磨(上海嘉定糧油儀器有限公司)、H2050R型高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)、萬分之一天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)、液相色譜儀HP1100(Agilent 公司)、冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)、恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)、RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 試驗方法

1.2.1 谷子活性成分的提取 將不同品種谷子脫殼粉碎，過0.150 mm篩后脫脂備用。采用70%乙醇溶液作為溶劑[22]，以料液比1∶10充分提取2次后，5 000 r/min離心10 min，之后將濾液置于45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，濃縮液冷凍干燥至干粉得到谷子提取物。再用70%乙醇溶液將干粉溶解得到待測樣品溶液[23]。

1.2.2 谷子提取物中活性成分含量的測定

1.2.2.1 總酚含量 采用福林酚法測定，精密移取各品種谷子醇提物待測提取液1 mL于10 mL容量瓶中，加入1 mL Folin-Ciocalteu顯色劑，搖勻后再加入2 mL 15%碳酸鈉溶液，用水定容至10 mL，室溫下反應(yīng)2 h，再在760 nm處測定吸光度值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總酚的沒食子酸當(dāng)量，總酚含量以每1 kg小米粉的沒食子酸當(dāng)量(mg)表示[22]。

1.2.2.2 黃酮含量 精密移取待測液3 mL于25 mL容量瓶中，加入1 mL 5%亞硝酸鈉，混勻，室溫下靜置6 min，再加入1 mL 10%硝酸鋁，混勻后于室溫下靜置6 min，再加入10 mL 4% NaOH溶液，用蒸餾水定容，靜置15 min，然后在500 nm波長下測其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總黃酮的蘆丁當(dāng)量。總黃酮含量以每1 kg小米的蘆丁當(dāng)量(mg)表示[24]。

1.2.2.3 α-生育酚含量 采用外標(biāo)法以α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，對醇提物中α-生育酚的含量進(jìn)行測定，色譜柱采用安捷倫C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇(色譜級)-水(95/5)，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL，柱溫為30 ℃，紫外檢測器波長為280 nm，在此條件下測定谷子α-生育酚含量。采用等度洗脫，在16 min左右出峰。

1.2.3 谷子提取物的抗氧化活性測定

1.2.3.1 DPPH自由基清除率 分別精密量取質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.5、0.8、1.0 mg/mL的谷子提取物2 mL，分別加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液，混勻后放置暗處靜置30 min，以無水乙醇作為參照溶液，以Vc為陽性對照，于517 nm處測定吸光值，按下列公式計算清除率(SE)。

SE=[1-(A1-A2/A0)]×100%

式中，A1為2 mL樣品溶液+2 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液的吸光度，A2為2 mL樣品溶液+2 mL無水乙醇的吸光度，A0為2 mL無水乙醇+2 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液的吸光度[25]。

1.2.3.2 OH自由基清除率 分別精密量取質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、2.0 mg/mL的谷子提取物1 mL，分別加入1 mL 9 mmol/L硫酸亞鐵溶液和1 mL 9 mmol/L水楊酸乙醇溶液，最后加入1 mL 8.8 mmol/L H2O2啟動反應(yīng)，于37 ℃恒溫水浴箱反應(yīng)15 min。用蒸餾水做空白溶液，以Vc為陽性對照，在510 nm處測吸光值，清除率公式如下所示。

清除率=[Ai-(Aj-Aji)]×100%

式中，Ai為空白溶液吸光度，Aj為加入待測溶液后的吸光度，Aji為待測溶液本底吸光度[26]。

1.2.3.3 還原力 分別精密量取質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、2.0 mg/mL的谷子提取物，按江蘇科銘生物技術(shù)有限公司試劑盒說明書進(jìn)行還原力測定，以酸性環(huán)境下，還原Fe3+-三吡啶三吖嗪(Fe3+-TPTZ)產(chǎn)生藍(lán)色的Fe2+-TPTZ的能力反映還原力。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)以3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，體外抗氧化活性采用半數(shù)抑制濃度IC50來表示，IC50值越小，抗氧化活性越強(qiáng)。數(shù)據(jù)作圖采用Excel 2010進(jìn)行，相關(guān)性與差異顯著性分析采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種谷子提取物中的活性成分含量分析

由表1可見，總酚含量因谷子品種不同而有差異，介于369.9～793.1 mg/kg，8311總酚含量最高，為793.1 mg/kg；張雜谷9號含量最低，僅為369.9 mg/kg。不同谷子品種中黃酮和α-生育酚含量變異相對較小，分別介于162.1～459.3 mg/kg和7.1～17.1 mg/kg。其中，張雜谷9號黃酮含量最高，為459.3 mg/kg，α-生育酚含量最低，為7.1 mg/kg；品種8311提取物中黃酮含量較低，為162.1 mg/kg，但α-生育酚含量最高，為17.1 mg/kg。經(jīng)統(tǒng)計分析，3種成分含量之間無顯著相關(guān)性。

表1 不同品種谷子中的總酚、黃酮和α-生育酚含量 mg/kg

2.2 不同品種谷子提取物的抗氧化能力分析

2.2.1 對DPPH自由基的清除作用 由圖1可知，谷子提取物質(zhì)量濃度在0.1～1.0 mg/mL時，其(張雜谷5號除外)對DPPH自由基的清除能力隨著提取物質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，說明谷子提取物對DPPH自由基具有一定的清除作用。與Vc相比，谷子提取物清除DPPH自由基的能力相對較弱。Vc對DPPH自由基的清除率在0.5 mg/mL時已達(dá)到93%，隨著Vc質(zhì)量濃度的增加，清除自由基的能力增長緩慢。5種谷子提取物清除DPPH自由基的能力不同，0.1～0.5 mg/mL時，張雜谷5號清除DPPH自由基的能力高于其他4個品種；當(dāng)提取物質(zhì)量濃度大于0.5 mg/mL時，除了張雜谷5號除外，4種谷子提取物清除自由基的能力基本達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。不同谷子品種提取物清除DPPH自由基的半數(shù)抑制濃度IC50見表2。由表2可知，5種谷子提取物清除DPPH自由基的IC50值均高于Vc，表明谷子提取物均具有一定的清除DPPH自由基的能力，但都弱于Vc。5個谷子品種的提取物對DPPH自由基的清除能力表現(xiàn)為8311<張雜谷10號<張雜谷3號<張雜谷5號<張雜谷9號。

圖1 不同品種谷子提取物對DPPH自由基的清除作用

表2 不同品種谷子提取物清除 DPPH自由基的IC50值 mg/mL

2.2.2 對OH自由基的清除作用 從圖2可以看出，提取物質(zhì)量濃度在0.1～2.0 mg/mL時，谷子提取物對OH自由基的清除能力隨著提取液質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，說明谷子提取物對OH自由基具有一定的清除作用。與Vc相比，谷子提取物清除OH自由基的能力相對較弱，當(dāng)提取物質(zhì)量濃度達(dá)到2.0 mg/mL時，8311和張雜谷5號谷子提取物清除OH自由基的能力與Vc相當(dāng)。5種谷子提取物清除OH自由基的能力不同，其中品種8311提取物清除OH自由基的能力高于其他4個品種。不同品種谷子提取物清除OH自由基的IC50值見表3。由表3可知，谷子提取物清除OH自由基的IC50值均大于Vc， 說明谷子提取物對OH自由基的清除作用弱于Vc。5個谷子品種的提取物清除OH自由基的能力表現(xiàn)為張雜谷9號<張雜谷5號<張雜谷3號<張雜谷10號<8311。

圖2 不同品種谷子提取物對OH自由基的清除作用

表3 不同品種谷子取物清除OH自由基的 IC50值 mg/mL

2.2.3 還原力 由圖3所示，谷子提取物的還原力與提取物質(zhì)量濃度呈良好的量效關(guān)系，說明谷子提取物具有一定的還原力。當(dāng)谷子提取物質(zhì)量濃度大于0.8 mg/mL時，張雜谷3號的還原力高于其他品種。在0.1～2.0 mg/mL時，5個谷子品種中8311的提取物還原力最弱。5個谷子品種還原力的IC50值如表4。由表4可知，5個谷子品種提取物的還原力表現(xiàn)為： 8311<張雜谷5號<張雜谷9號<張雜谷10號<張雜谷3號。

圖3 不同品種谷子提取物的還原力

表4 不同品種谷子提取物還原力的IC50值 mg/mL

2.3 谷子提取物的抗氧化能力與活性成分含量的相關(guān)性分析

由表5可知，谷子提取物對DPPH自由基的清除率與總酚、α-生育酚含量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.850、0.975，而與黃酮含量呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.944)；對OH自由基的清除率與總酚、α-生育酚含量呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.992、-0.877， 與黃酮含量呈顯著正相關(guān)(r=0.991)；谷子提取物的還原力與總酚含量(r=0.622)、黃酮含量(r=0.744)呈顯著正相關(guān)，與α-生育酚含量呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.903)。

表5 谷子提取物的抗氧化活性與活性成分含量的相關(guān)性分析

注：*代表相關(guān)性在0.05水平顯著。

3 結(jié)論與討論

谷子品種繁多，不同品種的抗氧化物含量和能力也存在一定差異。以“張雜谷”系列谷子品種與常規(guī)品種8311為對象，研究了不同谷子品種的抗氧化物含量和抗氧化能力。通過對谷子提取物的3種體外抗氧化試驗研究發(fā)現(xiàn)，谷子提取物具有一定的體外抗氧化能力。目前，關(guān)于醇提物抗氧化能力與活性成分含量的相關(guān)性研究有不同的報道結(jié)果。何永艷等[27]指出，蕎麥的總酚含量越高，對OH自由基的清除率越高，兩者相關(guān)性顯著。張名位等[28]發(fā)現(xiàn)，黑米抗氧化能力與其提取物中的黃酮含量呈顯著正相關(guān)。李光等[29]通過對蕎麥的研究發(fā)現(xiàn)，其抗氧化活性與黃酮、維生素E含量具有顯著相關(guān)性，與多酚含量不存在相關(guān)性，證實了不同物種提取物中活性物質(zhì)含量與抗氧化能力存在差異。本試驗中，總酚、黃酮、α-生育酚3種成分含量與抗氧化能力的相關(guān)性分析表明，總酚、黃酮和α-生育酚含量與谷子提取物的抗氧化能力均具有顯著相關(guān)性。其中，總酚含量與OH自由基清除率具有顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，但與DPPH自由基清除率呈顯著正相關(guān)，這與徐元元等[30]的研究結(jié)果一致；黃酮含量與DPPH自由基清除率具有顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，與OH自由基清除率、還原力則呈顯著正相關(guān)。造成負(fù)相關(guān)的原因有可能是樣本過少，由于樣本數(shù)量有限，未能達(dá)到統(tǒng)計學(xué)最低樣本數(shù)，也有可能是由于樣品不純造成的。本試驗采用谷子醇提物進(jìn)行抗氧化研究，其表現(xiàn)出復(fù)雜的抗氧化活性，但尚不能明確提取液中哪種成分起作用或者不同成分在同一溶液中的抗氧化作用強(qiáng)度是否存在協(xié)同或拮抗作用，下一步將增加樣本數(shù)量、對抗氧化成分進(jìn)行提純后再進(jìn)行各自的體外抗氧化試驗，以明確谷子提取物中不同成分的抗氧化作用效果。目前，國內(nèi)外對小米提取物的抗氧化作用研究較少，其復(fù)雜的抗氧化作用需要對小米中各個組分進(jìn)行更深入地研究，來進(jìn)一步明確其活性成分的抗氧化作用機(jī)制。

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Comparative Study on Antioxidant Activity of Alcohol Extracts from Different Millet Cultivars

WANG Lingyun1,SONG Xiaoqing1,WANG Xiaoming2,FAN Guangyu2,ZHAO Zhihai2,ZHAO Yan1,LIU Yinghui1*

(1.Hebei North University,Zhangjiakou 075000,China; 2.Zhangjiakou Academy of Agricultural Sciences,Zhangjiakou 075000,China)

In order to study the antioxidant activity of millet,5 millet cultivars were used to determine the content of antioxidative substance,the antioxidant capacity of alcohol extract from different millet cultivars were compared,and the relationship between the antioxidant capacity and the content of antioxidative substance was analyzed.The results showed that the content of the total phenol,flavonoid and alpha tocopherol ranged from 369.9 to 793.1 mg/kg,162.1 to 459.3 mg/kg and 7.1 to 17.1 mg/kg,respectively.The IC50of DPPH free radical scavenging,OH free radical scavenging and the power of reducing ranged from 0.09 to 0.24 mg/mL,0.41 to 0.74 mg/mL and 0.98 to 2.35 mg/mL respectively.Zhangzagu No.9 had the lowest contents of polyphenols,alpha tocopherol,the highest flavonoid content,and the DPPH free radical scavenging capacity was the highest in all test cultivars.8311 had the highest total polyphenols and alpha tocopherol contents,the lowest flavonoid content,the strongest OH free radical scavenging capacity.Zhangzagu No.3 had the highest power of reducing.The correlation analysis showed that the DPPH free radical scavenging capacity was positively correlated with the contents of total polyphenol and alpha tocopherol,negatively correlation with flavonoid content.The OH free radical scavenging capacity was negatively correlated with the contents of total polyphenol and alpha tocopherol,postively correlated with flavonoid content.The reducing power was negatively correlated with alpha tocopherol content.

millet； alcohol extracts； active ingredients； antioxidation

2016-08-19

國家科技重大專項(2014ZX0800909B);河北省科技廳項目(16226310D);張家口市科技局項目(1511076C)

王凌云(1988-)，女，山東萊州人，在讀碩士研究生，研究方向：谷子成分。E-mail:984112812@qq.com

*通訊作者：劉穎慧(1971-)，女，河北承德人，教授，博士，主要從事植物基因工程研究。E-mail:leely519@126.com

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1004-3268(2017)02-0028-05