胰島素受體-1在尼羅羅非魚不同組織中的表達(dá)及其對注射葡萄糖的響應(yīng)

劉含亮王紀(jì)亭?萬文菊孫敏敏孟 曉徐蒙蒙

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，泰安 271000；2.泰山醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，泰安 271000）

胰島素受體-1在尼羅羅非魚不同組織中的表達(dá)及其對注射葡萄糖的響應(yīng)

劉含亮1王紀(jì)亭1?萬文菊2?孫敏敏1孟 曉1徐蒙蒙1

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，泰安 271000；2.泰山醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，泰安 271000）

本試驗旨在研究胰島素受體-1（IR-1）在尼羅羅非魚不同組織中的表達(dá)及其對注射葡萄糖的響應(yīng)。利用PCR擴(kuò)增的方法從尼羅羅非魚肌肉中克隆IR-1的cDNA片段，并通過半定量PCR檢測，比較IR-1在肌肉、肝臟和心臟中的表達(dá)差異。選取體重約為100 g的尼羅羅非魚160尾，隨機(jī)分2組，每組4個重復(fù)，每個重復(fù)20尾。試驗組腹腔注射葡萄糖（每100 g體重30 mg），對照組以相同劑量腹腔注射0.7%的無菌生理鹽水。在注射前（0 h）和注射后的1、3、6和12 h分別進(jìn)行采樣，測定血漿葡萄糖和胰島素含量，并通過實時熒光定量PCR檢測IR-1在肌肉、心臟和肝臟中的mRNA相對表達(dá)量。結(jié)果顯示：1）克隆出的IR-1 cDNA片段，其GenBank登陸號為JN967750，大小為1 979 bp，編碼548個氨基酸。序列分析發(fā)現(xiàn)，尼羅羅非魚的IR-1與其他物種比較具有很高的保守性，并具有豐富的酪氨酸激酶特征性序列。2）IR-1在尼羅羅非魚肌肉、心臟和肝臟中均有較高的表達(dá)量，其中在肝臟和肌肉中的表達(dá)量基本一致，而在心臟中的表達(dá)量相對較低。3）試驗組血漿葡萄糖含量在注射葡萄糖1 h后達(dá)到最高，并顯著高于對照組（P＜0.05），而后開始下降，3 h后恢復(fù)到正常水平；試驗組血漿胰島素含量在葡萄糖注射3 h后達(dá)到最高，并顯著高于對照組（P＜0.05），而后開始下降，12 h后恢復(fù)到正常水平。試驗組肌肉和肝臟中IR-1 mRNA的相對表達(dá)量在注射葡萄糖后6 h時達(dá)到最高，顯著高于對照組（P＜0.05），在12 h時恢復(fù)到正常水平；試驗組心臟中IR-1 mRNA的相對表達(dá)量在注射葡萄糖后的12 h內(nèi)沒有發(fā)生顯著變化（P＞0.05）。結(jié)果表明，注射葡萄糖后即刻升高了尼羅羅非魚的血漿葡萄糖含量，相對于血漿葡萄糖含量的升高，血漿胰島素含量的升高相對延遲，而肌肉和肝臟中IR-1 mRNA相對表達(dá)量的提高又延遲于血漿胰島素含量的升高，從而加重了尼羅羅非魚對葡萄糖的代謝負(fù)擔(dān)。

尼羅羅非魚；葡萄糖；胰島素；胰島素受體-1

胰島素是糖代謝的核心物質(zhì)，可以嚴(yán)格控制葡萄糖的利用［1］。起初的研究認(rèn)為，魚類對高碳水化合物的低效利用是由于血清中低含量的內(nèi)源性胰島素所致［2-4］。但隨著胰島素放射免疫測定方法的發(fā)展，越來越多的試驗結(jié)果表明魚類血清中胰島素含量相似于甚至高于哺乳類動物［5-6］。有研究表明，羅非魚胰島素mRNA在胰島β細(xì)胞的基礎(chǔ)表達(dá)量是哺乳動物相應(yīng)表達(dá)量的3.7倍［7］。胰島素是依靠與細(xì)胞表面特定受體接觸而發(fā)揮作用的，胰島素與其受體之間形成二硫鍵，促使胰島素發(fā)揮最大效能［8］。對于鳥類和哺乳動物而言，胰島素受體能夠介導(dǎo)胰島素對脂肪合成和葡萄糖攝取的作用［9］，于是，人們進(jìn)行了胰島素受體數(shù)量及受體與胰島素親和力的探討［10］。胰島素受體的研究多集中在哺乳動物，而在魚類上的相關(guān)研究［11-13］很少。目前已檢測到多種魚類組織中表達(dá)胰島素受體，包括肝臟、骨骼肌、心臟和脂肪組織［13-17］。 羅非魚外周組織（如骨骼肌）也擁有功能性胰島素受體［17-18］。但目前有關(guān)魚類胰島素受體數(shù)量的研究表明，魚類胰島素受體數(shù)量較哺乳動物少得多［19］。Ablett等［20］認(rèn)為高糖能促進(jìn)胰島素受體數(shù)量的增多，也就是說飼料糖水平低，被激活的胰島素受體數(shù)量就少。胰島素受體數(shù)量不足也可能是魚類對糖利用能力較低的原因之一。Mommsen等［21］根據(jù)前人研究結(jié)果進(jìn)行推斷，魚類對葡萄糖的低耐受性可能是由于魚體中胰島素與受體的交互作用不同于哺乳動物的互作系統(tǒng)所致。Ablett等［20］引進(jìn)了另一種方法研究胰島素的分泌，研究人員測定了標(biāo)記胰島素與肝細(xì)胞、肌細(xì)胞膜上受體的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)虹鱒胰島素受體數(shù)量與胰島素含量之間有一定相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)，虹鱒心肌中胰島素受體數(shù)量與激素含量成反比［22］，而在脂肪組織、骨骼肌和肝臟中的情況正好相反［23-24］。 Planas等［25］認(rèn)為胰島素受體數(shù)量與激素含量之間的關(guān)系可能與組織的功能特征有關(guān)。本試驗選擇尼羅羅非魚（Oreochromis nilotica）作為試驗對象，測定其在注射葡萄糖后血漿葡萄糖和胰島素含量的變化，并以胰島素受體-1（IR-1）作為研究對象，探討IR-1在尼羅羅非魚不同組織中的表達(dá)及其對注射葡萄糖的響應(yīng)，為羅非魚葡萄糖代謝機(jī)理提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗用尼羅羅非魚購于當(dāng)?shù)啬崃_羅非魚養(yǎng)殖場，在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地暫養(yǎng)2周后，挑選健康、規(guī)格整齊、平均體重為100 g左右的魚作為試驗用魚。試驗用葡萄糖購于上海索萊寶生物科技有限公司，將葡萄糖溶于無菌蒸餾水中配制成30 mg/mL的針劑，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗設(shè)計

將160尾尼羅羅非魚隨機(jī)分配到8個水族箱（水族箱水容量為0.4 m3）中，對照組、試驗組各設(shè)4個重復(fù)，每個水族箱為1個重復(fù)，每個水族箱投放羅非魚20尾。試驗魚飼喂常規(guī)的尼羅羅非魚基礎(chǔ)飼料，其組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗開始時先將2組魚分別禁食24 h，用MS-222（每1 m3水20 g）麻醉魚體后，試驗組依照每100 g體重30 mg的劑量腹腔注射葡萄糖［26］，對照組以相同的劑量腹腔注射0.7%的無菌生理鹽水。在注射前（0 h）和注射后的1、3、6和12 h分別進(jìn)行采樣。每個水族箱每次取樣4尾，同樣用MS-222麻醉魚體后，尾靜脈采血，血 樣用肝素 抗凝，在 4℃ 下3 000 r/min離心10 min制備血漿，將血漿移入凍存管存于液氮中備用。每次采完血的尼羅羅非魚，取其肝胰臟、心臟和背部肌肉，并凍存于液氮中備用。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet（air-dry basis） %

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 血漿葡萄糖和胰島素含量測定

血漿中葡萄糖含量在美國貝克曼Cx-4型自動生化分析儀上測定。胰島素含量使用R＆D Systems公司提供的魚胰島素測定試劑盒，采用固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）測定吸光度（OD）值，由試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)物的胰島素含量與OD值得出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，將樣品中胰島素的OD值代入方程，計算出樣品中胰島素的含量，若是稀釋后的樣品，再乘以稀釋倍數(shù)即為樣品中胰島素的實際含量。

1.3.2IR-1的cDNA克隆和序列分析

取50～100 mg尼羅羅非魚肌肉組織，加液氮研磨至粉末狀，參照 Trizol Reagent（Invitrogen公司）說明書的步驟提取總RNA，然后再用該公司提供的DNaseⅠ進(jìn)行純化，純化后的RNA在TaKa-Ra公司提供的反轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV Reverse Transcriptase）的作用下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，參照美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站公布的虹鱒（Gen-Bank登錄號：AF062496.1）、比目魚（GenBank登錄號：AB065096.1）、金魚（GenBank登錄號：AF218355.1）和 銀 鮭 魚 （GenBank登 錄 號：AF021040.1）的基因序列設(shè)計引物1和2（表2）；使用天根公司提供的PCR（2×Taq PCR）試劑盒，克隆獲得尼羅羅非魚IR-1的序列片段，反應(yīng)條件為：94℃ 5 min，（94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃1 min）×35個循環(huán)，72℃ 5 min，而后使用MBI公司生產(chǎn)的pTZ-57R/T載體連接試劑盒，將所得片段連入pTZ-57R/T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌（E.coli）DH 5α，培養(yǎng)菌液，將鑒定好的菌液寄往北京天根生物工程公司測序。之后根據(jù)獲得的片段序列設(shè)計引物3與錨定引物BRL-A2進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得IR-1的3′端序列，同時根據(jù)獲得的片段序列設(shè)計引物6與錨定引物SmartP1進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得IR-1的5′端序列，反應(yīng)條件均為：94℃ 5 min，（94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃1 min）×35個循環(huán)，72℃ 5 min，同樣將所得片段連入 pTZ-57R/T載體，培養(yǎng)菌液后測序。使用DNAMAN軟件對獲得的序列進(jìn)行比對和分析，進(jìn)化樹由MEGA 5.0軟件設(shè)計而成。

1.3.3 半定量PCR檢測組織中IR-1的表達(dá)

采取飼喂常規(guī)飼料的尼羅羅非魚的肌肉、肝臟和心臟，參照Trizol Reagent（Invitrogen）說明書的步驟，分別從這3種組織中提取總RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，而后使用天根公司提供的2×Taq PCR反應(yīng)液進(jìn)行半定量PCR檢測，根據(jù)本試驗克隆獲得的IR-1（GenBank登錄號：JN967750）序列設(shè)計引物7和8（表2）用于IR-1表達(dá)的檢測，PCR反應(yīng)條件均為：94℃ 5 min，（94℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃1 min）×36個循環(huán)，72℃ 5 min。同樣，參照NCBI網(wǎng)站公布的羅非魚 β-肌動蛋白（β-actin）（Gen-Bank登錄號：EF026001.1）序列設(shè)計引物11和12（表2）用于β-actin表達(dá)的檢測，PCR反應(yīng)條件為：94℃ 5 min，（94℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72℃1 min）×32個循環(huán)，72℃ 5 min。最后，通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳，使用Bio-Rad全自動凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行照相，測定各組織中各基因的相對表達(dá)量。

1.3.4 實時熒光定量PCR檢測IR-1的表達(dá)

取1 μg總RNA，參照TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV Reverse Transcriptase）的說明書合成cDNA第1鏈，然后置于-20℃保存。采用SYBR GreenⅠ熒光染料在7500 Real Time PCR System（Bio-Rad）上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別檢測注射葡萄糖后1、3、6和12 h時IR-1在肌肉、心臟和肝臟中的mRNA相對表達(dá)量。

在8聯(lián)管（Axygen）中分裝以下反應(yīng)體系：10 μL 2×SYBRPremix Ex TaqTM，0.4 μL 50× ROX Reference DyeⅡ（TaKaRa），6.8 μL dH2O，正、反向引物（10 μmol/mL）各0.4 μL，模板cDNA 2 μL。陰性對照則以等量 R Nase-free水代替，補充RNase-free水至20 μL。根據(jù)本試驗克隆獲得的IR-1（GenBank登錄號：JN967750）序列設(shè)計引物9和10（表2）用于IR-1 mRNA相對表達(dá)量的檢測，PCR反應(yīng)條件為：94℃ 30 s，（94℃ 5 s，60℃34 s）×40個循環(huán)，最后在55～95℃制作熔解曲線。反應(yīng)完成后，用ABI 7500 System分析軟件分析結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。目的基因的mRNA相對表達(dá)量以尼羅羅非魚β-actin為內(nèi)參，以對照組的基因mRNA表達(dá)量為基準(zhǔn)，應(yīng)用2△△Ct方法計算肌肉、肝臟和心臟中IR-1 mRNA的相對表達(dá)量。采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，先對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），若組間差異顯著，再用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，以P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 注射葡萄糖后尼羅羅非魚血漿葡萄糖和胰島素含量的變化

從圖1可以看出，與注射前（0 h）相比，試驗組尼羅羅非魚在注射葡萄糖1 h后血漿葡萄糖含量達(dá)到最高，并顯著高于對照組（P＜0.05），而后開始下降，6 h后恢復(fù)到正常水平。從圖2可以看出，試驗組血漿胰島素含量在注射葡萄糖3 h后達(dá)到最高，并顯著高于對照組（P＜0.05），而后開始下降，在12 h后降低至接近正常水平。

圖1 注射葡萄糖后尼羅羅非魚血漿葡萄糖含量的變化Fig.1 Changes of plasma glucose content of Nile tilapia after glucose injection

圖2 注射葡萄糖后尼羅羅非魚血漿胰島素含量的變化Fig.2 Changes of plasma insulin content of Nile tilapia after glucose injection

2.2 尼羅羅非魚IR-1序列片段的克隆

通過PCR擴(kuò)增克隆獲得了尼羅羅非魚IR-1的部分cDNA序列（GenBank登錄號：JN967750），經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測這一序列片段大小為1 979 bp，由548個氨基酸組成（圖3），與所預(yù)測的片段大小基本一致。將鑒定好的菌液寄往北京天根生物工程公司測序，用DNAMAN軟件將所得片段序列與來源于其他動物的同源序列進(jìn)行序列比較，發(fā)現(xiàn)該片段為所要克隆的目的基因的序列片段。

圖3 尼羅羅非魚與其他魚類IR-1氨基酸序列的比對結(jié)果Fig.3 Alignment result ofIR-1 amino acid sequences between Nile tilapia and other fish species

2.3 尼羅羅非魚IR-1的氨基酸序列分析

通過與其他魚類比對可以看出，尼羅羅非魚的IR-1的氨基酸序列具有很高的保守性，具有胰島素受體的特征性序列（圖3），并具有豐富的酪氨酸激酶特征性序列。在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上，與其他脊椎動物的胰島素受體相比較（圖4），可以看出，尼羅羅非魚的IR-1和其他的脊椎動物的胰島素受體在同一簇上，這些脊椎動物包括比目魚和大菱鲆，而與其他脊椎動物的非IR-1胰島素受體類型不在同一簇上；此外，魚類的胰島素受體分布在一個簇上，哺乳動物的胰島素受體分布在一個簇上。

在氨基酸水平上，尼羅羅非魚的IR-1與比目魚和大菱鲆的IR-1同源性非常高，分別達(dá)到89.9%和89.1%，與尼羅羅非魚胰島素受體-2（IR-2）的同源性為73.0%，與哺乳動物胰島素受體的同源性在66.7%～68.8%（表3）。通過比較鑒定可以得出，羅非魚IR-1具有第1類別胰島素受體的保守序列，同時具有胰島素受體的特征性序列。

圖4 不同來源IR-1的聚類分析Fig.4 Cluster analysis of IR-1 from different sources

表3 在核苷酸和氨基酸水平上IR-1與其他物種的同源性比較Table 3 Homologous comparison ofIR-1 between Nile tilapia and other animal species on nucleotide and amino acid levels %

續(xù)表3

2.4 尼羅羅非魚IR-1在不同組織中的表達(dá)

從在23～25℃的水溫中飼養(yǎng)、飼喂常規(guī)飼料的尼羅羅非魚中采取肌肉、肝臟和心臟，而后分別提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后通過半定量PCR檢測和比較IR-1在這3種組織的表達(dá)量，結(jié)果（圖5）顯示，IR-1在尼羅羅非魚的肌肉、心臟和肝臟中均有很高的表達(dá)量，由此可以得出尼羅羅非魚的肌肉、心臟和肝臟中都有胰島素受體的存在，并且對尼羅羅非魚注射葡萄糖6 h后3個組織中IR-1都達(dá)到最高表達(dá)量，通過后續(xù)實時熒光定量PCR的結(jié)果來看，IR-1在肝臟和肌肉中的表達(dá)量基本一致，而在心臟中的表達(dá)量相對較低（圖6）。

圖5 尼羅羅非魚IR-1在不同組織中的表達(dá)Fig.5 Expression ofIR-1 from different tissues of Nile tilapia

2.5 注射葡糖糖后尼羅羅非魚不同組織中IR-1 mRNA的相對表達(dá)量變化

通過實時熒光定量PCR檢測尼羅羅非魚注射葡萄糖后12 h內(nèi)不同組織IR-1 mRNA的相對表達(dá)量的變化。試驗結(jié)果（圖6）顯示，試驗組肌肉中IR-1 mRNA的相對表達(dá)量在注射葡萄糖后3 h時有所升高，在6 h時達(dá)到最高水平，與對照組差異顯著（P＜0.05）；與對照組相比，試驗組心臟中IR-1 mRNA的相對表達(dá)量在注射葡萄糖后的12 h內(nèi)沒有表現(xiàn)出顯著性的變化（P＞0.05），但是隨時間的延長呈現(xiàn)出了先上升后下降的趨勢，在6 h時達(dá)到最高水平；試驗組肝臟中IR-1 mRNA的相對表達(dá)量變化與肌肉中十分相似，即在注射葡萄糖后3 h時有所升高，在6 h時達(dá)到最高水平，與對照組差異顯著（P＜0.05）。

3 討 論

3.1 尼羅羅非魚IR-1的基因序列分析

從序列、系統(tǒng)發(fā)生學(xué)和組織分布來分析，本試驗所克隆獲得的基因片段屬于胰島素受體家族中的IR-1。尼羅羅非魚的IR-1在序列和結(jié)構(gòu)上與其他魚類的IR-1十分相似，其與哺乳動物胰島素受體的同源性在66.7%～68.8%，與其他魚類胰島素受體的同源性在45.3%～89.9%。通過對蛋白質(zhì)序列分析的結(jié)果可以看出，與其他魚類相比，尼羅羅非魚的IR-1的氨基酸序列具有很高的保守性，并且胰島素受體的酪氨酸激酶位點十分豐富。從氨基酸序列的比對結(jié)果來看，除了一少部分的氨基酸替代外，本試驗從尼羅羅非魚肌肉中克隆獲得的序列具備了IR-1的普遍特征。魚類胰島素受體在進(jìn)化上的這種主要結(jié)構(gòu)的保守性表明，這種高選擇壓力下的高保守性可能源于需要保持胰島素受體的一般特征和其信號的傳導(dǎo)功能。

本研究利用Chan等［27］克隆大馬哈魚胰島素受體的引物，獲得了2條胰島素受體的片段，通過序列比對和分析，其中一條與本研究克隆的序列完全相符，而另外一條與Cheng等［28］對莫桑比克羅非魚克隆的一段胰島素受體片段（GenBank登錄號：AF493794）完全相符。數(shù)據(jù)顯示本試驗克隆出的尼羅羅非魚IR-1與IR-2只有73.0%的同源性，如此低的同源性表明尼羅羅非魚的胰島素受體由2個基因來表達(dá)，對此本試驗可以確定尼羅羅非魚的胰島素受體存在著2種亞型。通過氨基酸序列對比發(fā)現(xiàn)，IR-1和IR-2與人類胰島素受體的同源性分別為68.8%和66.1%，表明在進(jìn)化的過程中胰島素受體具有很高的保守性。魚類胰島素受體在結(jié)構(gòu)和功能上與人類的胰島素受體十分相似，因此，其研究結(jié)果可直接運用到哺乳動物中［29］。

圖6 注射葡萄糖后尼羅羅非魚不同組織中IR-1 mRNA的相對表達(dá)量變化Fig.6 Changes ofIR-1 mRNA relative expression level in different tissues of Nile tilapia after glucose injection

3.2 尼羅羅非魚IR-1的組織表達(dá)分布特征

胰島素受體是一種跨膜糖蛋白，具有典型的變構(gòu)酶性質(zhì)，廣泛分布于全身各組織細(xì)胞膜［30］。在哺乳動物上，用于胰島素調(diào)節(jié)血糖的外周靶細(xì)胞的胰島素受體主要存在于肌肉和脂肪組織內(nèi)，然而很少有證據(jù)證明在魚體內(nèi)也同樣如此，但是魚類（包括尼羅羅非魚）的肌肉和心臟具有功能性的胰島素受體，這確是一個不爭的事實［31］。Mounier等［32］研究發(fā)現(xiàn)，胰島素受體在哺乳動物的肝臟和脂肪組織中具有很高的表達(dá)量，這些組織中的胰島素受體和胰島素相互作用，使得葡萄糖維持在一個相對平衡的水平。胰島素受體在魚類的各種組織中也都有表達(dá)［16］，其中包括肌肉、肝臟、鰓和大腦等組織［33］。本研究結(jié)果顯示，IR-1在尼羅羅非魚的肌肉、心臟和肝臟中均有較高的表達(dá)量，其中肌肉和肝臟中IR-1的表達(dá)量基本一致，而心臟中的表達(dá)量相對較低。

3.3 注射葡萄糖對尼羅羅非魚IR-1表達(dá)的影響

胰島素作為體內(nèi)唯一的降糖激素，它的分泌受血糖水平的調(diào)節(jié)控制，血糖水平升高即引起胰島β細(xì)胞釋放胰島素入血，到達(dá)其主要的靶器官——肝臟、肌肉和脂肪，而胰島素特異性受體在許多魚類的肝臟和肌肉中被發(fā)現(xiàn)，雖然它們的數(shù)量在不同的魚類中有所差異［34］。Ba?os等［35］用含有易消化的膨化小麥飼喂虹鱒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)飼喂高糖飼料（37%的膨化小麥）與低糖飼糧（21%的膨化小麥）的虹鱒均表現(xiàn)出較高的生長率，血漿中的葡萄糖和胰島素含量升高，同時肌肉中胰島素受體的數(shù)量增加。研究表明，長期攝食不同糖水平飼料的魚類對外源胰島素敏感性也不同，這可能是因為長期攝食不同糖水平飼料的魚類被激活的胰島素受體數(shù)量不同的緣故。同時，影響胰島素受體數(shù)量的因素也可以影響胰島素受體的親和力，而無論胰島素受體數(shù)量的降低還是親和力的降低，均可以降低胰島素與其受體的結(jié)合而引起機(jī)體葡萄糖含量的升高［36］。 蔡春芳等［37］對異育銀鯽進(jìn)行了外源胰島素敏感性試驗，結(jié)果表明外源胰島素具有顯著的降血糖作用，異育銀鯽對外源胰島素敏感性強(qiáng)，而且飼料糖水平也影響其敏感性，造成敏感性差異的原因可能與胰島素受體數(shù)量不同有關(guān)。不同魚類胰島素與其受體的結(jié)合力不同，Ba?os等［35］研究表明，鯉魚紅肌中胰島素與其受體的結(jié)合力大于虹鱒，同時魚類不同組織中胰島素與其受體的結(jié)合力也不同，心肌胰島素與其受體的結(jié)合力較其他組織高［38］。本研究結(jié)果顯示，尼羅羅非魚在注射葡萄糖后的12 h內(nèi)，心臟中IR-1 mRNA的相對表達(dá)量沒有發(fā)生顯著變化，而肌肉和肝臟中IR-1mRNA的相對表達(dá)量在注射葡萄糖后6 h時達(dá)到最高，12 h時恢復(fù)到正常水平。綜合以上試驗結(jié)果，血漿葡萄糖含量在注射葡萄糖后1 h時達(dá)到最高，而在高血漿葡萄糖含量的刺激下血漿胰島素含量卻在注射葡萄糖后3 h時達(dá)到最高，同時基于胰島素的壓力，肌肉和肝臟中的IR-1表達(dá)量增多，但是其表達(dá)量在注射葡萄糖后6 h時才達(dá)到最高，胰島素含量及其受體（IR-1）表達(dá)量相對于血漿葡萄糖含量的滯后性表明，IR-1在調(diào)節(jié)尼羅羅非魚血漿葡萄糖含量上并沒有發(fā)揮作用，至于胰島素受體的另一個亞型（IR-2）的作用如何，有待于下一步深入研究。

4 結(jié) 論

① 克隆獲得的尼羅羅非魚IR-1基因序列具有很高的保守性，并具有豐富的酪氨酸激酶特征性序列。

②IR-1在尼羅羅非魚肌肉、心臟和肝臟中均有較高的表達(dá)量，在肝臟和肌肉中的表達(dá)量基本一致，而在心臟中的表達(dá)量相對較低。

③注射葡萄糖后尼羅羅非魚肌肉和肝臟中的IR-1 mRNA的相對表達(dá)量在注射葡萄糖后6 h時達(dá)到最高，12 h時恢復(fù)到正常水平。相對于血漿葡萄糖含量，血漿胰島素含量的升高相對延遲，而肌肉和肝臟中IR-1 mRNA的相對表達(dá)量的升高又延遲于胰島素含量的升高，從而加重了羅非魚對葡萄糖的代謝負(fù)擔(dān)。

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Expression of Insulin Receptor-1 in Different Tissues of Nile Tilapia and Its Response to Glucose Injection

LIU Hanliang1WANG Jiting1?WAN Wenju2?SUN Minmin1MENG Xiao1XU Mengmeng1
（1.College of Animal Science and Technology，Shandong Agricultural University，Taian271000，China；2.Department of Basic Medicine，Taishan Medical College，Taian271000，China）

This experiment was conducted to determine the expression of insulin receptor（IR）-1 in different tissues of Nile tilapia（Oreochromis nilotica）and its response to glucose injection.A partial cDNA ofIR-1 was cloned from muscle of Nile tilapia by real-time PCR method.The expression differences ofIR-1 in muscle，liver and heart were compared by semi-quantitative PCR detection.A total of 160 Nile tilapia with the body weight about 100 g were randomly allotted to 2 groups with 4 replicates per group and 20 fish per replicate.In experimental group，glucose with the dose of 30 mg per 100 g body weight was injected intraperitoneally into the fish，while the fish in control group were injected with 0.7%sterile saline water as the same dose and method.Samples were collected and measured before injection（0 h）and at 1，3，6 and 12 h after injection，respectively.The plasma glucose and insulin contents were analyzed，and the relative expression level ofIR-1 mRNA in muscle，heart and liver was measured by quantitative real-time PCR detection.The results show as follows：1）the cloned partial cDNA ofIR-1（GenBank accession No.was JN967750）was 1 979 bp，and encoded 548 amino acids.Sequence analysis showed thatIR-1 of Nile tilapia had high conservation compared with other species，and had a rich tyrosine kinase characteristic sequence.2）The higher expression level ofIR-1 in muscle，heart and liver was found，theIR-1 expression level in liver and muscle was consistent，while that in heart was relatively lower.3）The maximum plasma glucose content of experimental group was observed at 1 h after glucose injection which was significantly higher than that of control group（P＜0.05），and then began to decrease and returned to normal level at 3 h after injection；the maximum plasma insulin content of experimental group was observed at 3 h after glucose injection which was significantly higher than that of control group（P＜0.05），and then began to decrease and returned to normal level at 12 h after injection.The relative expression level ofIR-1 mRNA in muscle and liver at 6 h after glucose injection of experimental group was significantly higher than that of control group（P＜0.05），and then to return to normal level at 12 h after injection；the relative expression level ofIR-1 mRNA in heart had no significant change after glucose injection of experimental group（P＞0.05）.The results suggest that injecting glucose can instantaneously increase the plasma glucose content of Nile tilapia，but the increase of plasma insulin content is relatively delayed compare with plasma glucose content，and the relative expression level ofIR-1 in muscle and liver show a delayed increase relative to plasma insulin content，then the burden of glucose metabolism in Nile tilapia is increased.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2017，29（2）：652-662］

Nile tilapia（Oreochromis nilotica）；glucose；insulin；insulin receptor-1

S963

A

1006-267X（2017）02-0652-11

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.02.035

（責(zé)任編輯 菅景穎）

2016-07-01

國家自然科學(xué)基金項目（31472288）；山東省科技發(fā)展計劃項目（2014GGH210010）；山東省高等學(xué)校科技計劃項目（J09LC05）

劉含亮（1986—），男，山東東平人，碩士研究生，研究方向為魚類營養(yǎng)與免疫。E-mail：liuhanliang666＠163.com

?通信作者：王紀(jì)亭，副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail：jtwang＠sdau.edu.cn；萬文菊，教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail：wjwan＠tsmc.edu.cn

?Corresponding authors：WANG Jiting，associate professor，E-mail：jtwang＠sdau.edu.cn；WAN Wenju，professor，E-mail：wjwan＠tsmc.edu. cn