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    羊體外受精技術(shù)研究概況

    2017-02-28 12:37:45豆興堂
    黑龍江動物繁殖 2017年1期
    關(guān)鍵詞:卵裂體外受精卵母細(xì)胞

    豆興堂

    (遼寧省畜牧科學(xué)研究院, 遼寧 遼陽 111000)

    羊體外受精技術(shù)研究概況

    豆興堂

    (遼寧省畜牧科學(xué)研究院, 遼寧 遼陽 111000)

    本文較系統(tǒng)地總結(jié)了羊體外受精技術(shù)研究狀況,包括卵母細(xì)胞體外成熟、體外受精等技術(shù)環(huán)節(jié),并提出了需要解決的技術(shù)問題。

    羊;卵母細(xì)胞;精子;體外受精;胚胎

    近年來,我國山羊飼養(yǎng)業(yè)發(fā)展迅速,但也存在一些問題,主要表現(xiàn)在山羊良種化程度不高、世代間隔較長、遺傳改良速度較慢。優(yōu)良種公、母羊數(shù)量少難以滿足大量低產(chǎn)山羊的改良需求,而一些生物技術(shù)如母羔超排、體外受精、胚胎移植等技術(shù)可以最大限度地發(fā)揮具有優(yōu)秀生產(chǎn)性能的種公、母羊遺傳資源,滿足我國養(yǎng)羊業(yè)對良種的巨大需求。因此研究解決羊體外受精等重要相關(guān)技術(shù)瓶頸就成為迫切任務(wù)之一。

    哺乳動物體外受精研究已經(jīng)有幾十年的歷史,已相繼在130余種哺乳動物上獲得成功[1]。1985年Hanada等[2]在世界上首次實(shí)現(xiàn)山羊體外受精。1990年我國錢菊汾等[3]成功獲得一只“試管山羊”。1996年劉東軍等[4]經(jīng)體外受精胚胎移植得到了“試管山羊”。2004年王公金[5]等經(jīng)過胚胎移植成功產(chǎn)下了“試管山羊”。成國祥等[6]用超排山羊卵巢排卵后第1天的98枚卵巢卵母細(xì)胞,體外成熟體外受精卵裂率為21.43%,21枚2細(xì)胞胚移植5頭受體,獲2只羔羊。大量研究證明,經(jīng)體外受精技術(shù)生產(chǎn)的胚胎,通過胚胎移植給代孕受體羊完全可以正常生產(chǎn)羔羊。

    1 卵母細(xì)胞獲取與體外成熟

    1.1 卵母細(xì)胞的獲取方法

    主要有離體采集和活體采集。離體采集利用卵母細(xì)胞數(shù)有限,不可重復(fù)使用,且其種質(zhì)一般都相對較差。活體采集能獲得大量種質(zhì)優(yōu)良山羊的卵母細(xì)胞用于體外受精生產(chǎn)胚胎,可反復(fù)進(jìn)行且對供體山羊的生產(chǎn)性能和生殖機(jī)能無不良影響。因此,活體采卵技術(shù)成為體外受精一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)。

    活體采卵有手術(shù)法、B型超聲波法和腹腔鏡法。手術(shù)法采集卵母細(xì)胞操作簡便,容易觀察卵巢情況,回收率較高。許杰等[7]研究表明,抽吸法得到的平均卵母細(xì)胞數(shù)最多,刺破法較為適合回收山羊的卵巢卵母細(xì)胞。

    腹腔鏡法隨著體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展,近些年逐漸得到應(yīng)用。Berlinguera等[8]報道了LOPU采集卵母細(xì)胞的操作方法,可以參照操作。Graft等[9]認(rèn)為,腹腔鏡活體采卵技術(shù)容易觀察卵泡,在抽卵時可以對卵巢頻繁地進(jìn)行沖洗,可能會減少粘連的發(fā)生。

    B型超聲波法。1987年Callesen等[10]首先報道了B超應(yīng)用于卵母細(xì)胞采集。Graft等[9]報道了此技術(shù)在羊上的具體操作方法,但可見卵泡數(shù)較少,最終獲卵數(shù)也較少。

    1.2 卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)

    1.2.1 卵母細(xì)胞成熟

    卵母細(xì)胞的成熟被稱為卵母細(xì)胞獲能。該過程包括恢復(fù)減數(shù)分裂并進(jìn)入到第2次減數(shù)分裂中期(MⅡ)的核成熟和經(jīng)歷一系列復(fù)雜生理生化變化的細(xì)胞質(zhì)成熟[3]。卵母細(xì)胞成熟過程中細(xì)胞核發(fā)生生發(fā)泡破裂(germinal vesicle breakdow,GVBD)、染色質(zhì)濃縮和排出第1極體等一系列形態(tài)學(xué)的變化,當(dāng)減數(shù)分裂完成時,標(biāo)志著卵母細(xì)胞核的成熟。人工采集的卵母細(xì)胞大都完成了生長,進(jìn)入成熟期,其經(jīng)歷了第2次減數(shù)分裂間期而達(dá)到中期(MⅡ)[2]。卵母細(xì)胞體外成熟是以卵丘細(xì)胞擴(kuò)張、第1極體排出作為形態(tài)上的標(biāo)志。卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)是以 GVBD 為判斷標(biāo)準(zhǔn)的,第1極體的排放是卵母細(xì)胞成熟的標(biāo)志[11]。

    1.2.2 卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)主要因素

    1.2.2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)液

    卵母細(xì)胞體外成熟基礎(chǔ)液有TCM199、Ham’s F-12、Menezo’s B2、NUSC23和MEM等,以TCM199應(yīng)用最為廣泛。劉靈等[12]研究表明,TCM199和Ham’s F-12都是山羊卵母細(xì)胞體外成熟合適的培養(yǎng)基。林峰等[13]以TCM199為基礎(chǔ)培養(yǎng)液,添加10 IU/mL PMSG、10 IU/mL hCG和FCS等體外成熟培養(yǎng)卵母細(xì)胞,結(jié)果15% FCS組卵母細(xì)胞成熟率為67 %。

    1.2.2.2 培養(yǎng)環(huán)境條件系統(tǒng)

    溫度對卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)有很大影響。研究表明,一般家畜的卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)溫度均采用38~39℃,5% CO2空氣、飽和濕度[14]。氣相環(huán)境中的CO2濃度由于目前培養(yǎng)液中NaHCO3濃度多為25~30 mmol/L,故一般都采用5%的CO2。另有氣相環(huán)境為:5%CO2、5%O2、90%N2。但Azambujaa等[15]研究結(jié)果表明,5%CO2、5%O2、90%N2下成熟培養(yǎng)的卵母細(xì)胞,桑椹胚和囊胚發(fā)育率明顯低于含5%CO2的空氣。一般采用微滴培養(yǎng)和四孔板培養(yǎng)。

    1.2.2.3 激素

    卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)中常用的激素有FSH、LH、E2等。王海濱等[16]研究認(rèn)為,體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞時必須添加FSH,F(xiàn)SH維持顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞間的聯(lián)系,有利于卵母細(xì)胞發(fā)育成熟。Kobayashi等[17]研究結(jié)果表明,LH或hCG可以誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟分裂能力的恢復(fù)。Zuelke等[18]證實(shí),在無血清時LH用于體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞成熟,能提高卵母細(xì)胞成熟后的胚胎發(fā)育能力。雌二醇(E2)可促進(jìn)卵母細(xì)胞在體外成熟過程中受精和胚胎發(fā)育。劉靈等[12]研究表明,卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液中添加1 μg/mL E2,成熟率(79.4 %)顯著高于對照組(55.6 %),說明成熟液添加E2對其成熟是有益的。因此E2目前被廣泛用于卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)。

    1.2.2.4 血清

    卵母細(xì)胞體外成熟液通常都添加血清。常用的血清有FCS、OCS和SS,眾多研究結(jié)果表明,以FCS效果最好。Sanbusissho和Threlfall[19]比較了不同發(fā)情階段母牛血清,結(jié)果表明,發(fā)情盛期的母牛血清要優(yōu)于其他發(fā)情周期階段的血清。張涌等[20]研究結(jié)果表明,卵母細(xì)胞體外成熟同種動物的血清要優(yōu)于異種動物血清。血清成分較為復(fù)雜,效果不夠穩(wěn)定,因此近年開展許多血清替代物研究,可能是卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)一種方向。

    1.2.2.5 生長因子

    EGF是一種單鏈的多肽,對顆粒細(xì)胞等多種細(xì)胞具有促進(jìn)分裂的作用。王艾平等[21]研究結(jié)果表明,EGF對山羊COCs體外成熟和卵裂發(fā)育具有明顯的促進(jìn)作用,成熟液中EGF優(yōu)選濃度為50 μg/mL,COCs成熟率(75.45 %~75.18 %)和卵裂率(72.4%~74.1%)均顯著高于其它組。劉丑生等[22]研究EGF對綿羊卵母細(xì)胞成熟及卵裂的影響表明,50 μg/mL的EGF的成熟率和卵裂率分別為71.2%和45.5%,顯著高于對照組與其他組;當(dāng)EGF濃度達(dá)到100 μg/mL時成熟率和卵裂率最高,分別為72.9 %和45.7 %。羊卵母細(xì)胞成熟液中的常用量為10~50 ng/mL。

    1.2.2.6 其他

    卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)時間,山羊一般為24~26 h,不同動物其培養(yǎng)時間不同。劉靈等[12]研究表明,山羊卵母細(xì)胞成熟24 h、25 h和26 h,成熟率為(78.3 %、80.0 %和80.6 %)沒有差異。李穎等[23]研究了結(jié)果表明,山羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)20 h、22 h、24 h,成熟率顯著高于培養(yǎng)18 h、26 h、,30 h(P<0.05)。王超[24]研究顯示,山羊卵母細(xì)胞37℃ 下的成熟率顯著低于38.5℃、39.0℃下的成熟率,培養(yǎng)24 h和培養(yǎng)26 h的成熟率極顯著高于培養(yǎng)18 h和20 h。卵母細(xì)胞的成熟潛力還與采卵季節(jié)相關(guān),繁殖季節(jié)獲取的卵母細(xì)胞成熟率較高。

    2 精子獲能與體外受精

    2.1 精子獲能

    精子體外獲能處理是體外受精技術(shù)的重要環(huán)節(jié)。Austin發(fā)現(xiàn)并定義了哺乳動物精子獲能(Capacitation)現(xiàn)象?,F(xiàn)已弄清精子在體內(nèi)的獲能過程如下:哺乳動物生殖道內(nèi)的獲能因子中和精子表面的去能因子,并促使精子質(zhì)膜的膽固醇外流,導(dǎo)致膜的通透性增加。而后Ca2+進(jìn)入精子內(nèi)部,激活腺苷酸環(huán)化酶,抑制磷酸二酯酶,誘發(fā)cAMP的濃度升高,進(jìn)而導(dǎo)致膜蛋白重新分布,膜的穩(wěn)定性進(jìn)一步下降,精子的獲能即完成[3]。因此,可以通過脫除精子被膜蛋白,增加通透性和Ca2+內(nèi)流的處理方法誘發(fā)精子獲能。

    2.2 精子獲能處理方法

    精子體外獲能方法可分為兩步,首先是精子洗滌,篩選活精子;其次進(jìn)行精子獲能處理。

    精子經(jīng)一次或多次離心后除去雜質(zhì)、死精子、凍精保護(hù)液及稀釋液等,從而篩選活力好的精子。懸浮法是篩選高活力精子最為有效的一種方法。Parrish等[25]首次采用懸浮法分離牛的精子進(jìn)行體外受精,結(jié)果表明,可使受精率由46%提高到59%。Purvis和Egdetveit[26]研究表明,如將懸浮的試管傾斜30°,則能提高精子的可利用數(shù)量50 %~100 %。山羊多用mDM液和不含BSA的BO液。

    其次進(jìn)行精子的獲能處理。主要使用鈣離子載體、肝素和BSA等,以促使Ca2+進(jìn)入精子頂體,并刺激精子內(nèi)部pH升高,從而誘發(fā)精子獲能。

    鈣離子載體A23187獲能處理。馬恒東等[27]研究表明,鈣離子載體的添加量在0.3 μmol/L時,利用去透明帶金黃地鼠卵穿卵試驗(yàn),穿透率達(dá)到68.2%;咖啡因與肝素、鈣離子載體具有明顯的協(xié)同作用。將獲能的精子與山羊卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精孵育17 h,也獲得了60%以上的受精率。葉華虎等[28]比較不同獲能誘導(dǎo)劑對山羊精子體外獲能及受精能力的影響,結(jié)果表明,0.1 μmol/L, 0.4 μmol/L,0.7 μmol/L IA均能提高精子獲能率,其中0.4 μmol/L處理組精子獲能率最高為56.2%;IA組的卵裂率明顯高于肝素組(P<0.05),IA表現(xiàn)出更強(qiáng)的促卵裂發(fā)生效果。

    肝素獲能處理。大多數(shù)研究者體外受精中肝素的濃度為10~50 μg/mL。錢紅娟等[29]認(rèn)為,用肝素誘導(dǎo)山羊精子體外獲能10 Lg/mL的濃度最有利。呂麗華等[30]山羊卵母細(xì)胞體外受精的研究表明,肝素(50 μg/mL)組和鈣離子載體(0.1 μmol/mL)組受精率分別為56.0%和67.0%,顯著高于咖啡因(10 mmol/L)組的21.0%;肝素組卵裂率(51.1%)顯著高于鈣離子載體組(36.3%)和咖啡因組(19.0%);囊胚率肝素組(17.8%)與鈣離子載體組(11.7%)差異不顯著,表明肝素處理精子獲能受精比較穩(wěn)定。

    精子獲能檢測。近年來,Moller[31]和Aarons[32,33]等報道采用考馬斯亮藍(lán)(CBB)染色法來檢測小鼠精子頂體反應(yīng)。CBB G250是常用的蛋白染料,它對頂體膜或頂體內(nèi)含物具有特異親和性。AR發(fā)生后,頂體內(nèi)的蛋白酶流失,CBB G250結(jié)合量明顯減低,因而頂體著色較淡。反之,未發(fā)生AR的精子,頂體著色較深。江一平等[34]通過用3.5%高氯酸水溶液配制0.05%考馬斯亮藍(lán)(R250)染色液浸染人精子30 min,頂體完整者頂體區(qū)染成紫藍(lán)色,頂體反應(yīng)者則不染。建立了一種檢測人精子頂體反應(yīng)的簡便實(shí)用新技術(shù),方法學(xué)檢驗(yàn)證明新技術(shù)結(jié)果可靠。卓丹心等[35]在先前報道[32]基礎(chǔ)上,將CBB液加以改良建立了一種哺乳動物精子AR檢測較通用簡便的技術(shù)。研究結(jié)果表明,經(jīng)CBB染色后,頭部呈現(xiàn)出兩種類型染色特征———A型和B型。A型未獲能精子頂體區(qū)成紫藍(lán)色,頂體后區(qū)淺紫色;B型獲能精子頂體區(qū)不染色或染淺紫色,頂體后區(qū)與A型相似。經(jīng)方法學(xué)實(shí)驗(yàn)表明,CBB染色批內(nèi)變異系數(shù)低,說明可重復(fù)性好,結(jié)果可靠,可用于AR的檢測實(shí)驗(yàn)。葉華虎等[36]的研究證實(shí),考馬斯亮藍(lán)(CBB)染色技術(shù)可用于哺乳動物精子頂體狀態(tài)的準(zhǔn)確評價。陸海一等[37]也驗(yàn)證了CBB染色技術(shù)可作為檢測人精子形態(tài)和頂體反應(yīng)的可靠而實(shí)用的方法。與傳統(tǒng)的瑞-吉染色法相比,CBB-G250染色法不僅操作簡單、試劑配制方便,而且染色時間較短、不受染液pH的影響。

    2.3 精子與卵母細(xì)胞體外受精方法

    2.3.1 體外受精系統(tǒng)

    卵母細(xì)胞體外受精培養(yǎng)系統(tǒng)主要有微滴法和四孔培養(yǎng)板法。微滴法是一種應(yīng)用最廣的培養(yǎng)系統(tǒng)。該法的優(yōu)點(diǎn)是受精液及精液的用量均較少,體外受精的效果亦較好。四孔板培養(yǎng)法是采用四孔板為體外受精器皿,每孔加入500 μL受精液和100~150枚體外成熟的卵母細(xì)胞,然后加入獲能處理的精子,在培養(yǎng)箱中孵育20~24 h。該法的優(yōu)點(diǎn)是操作相對比較簡單,受精結(jié)果不受石蠟油質(zhì)量的影響。精卵體外受精一般在38.5℃、5%CO2的空氣、飽和濕度下進(jìn)行。

    2.3.2 受精體系

    用于體外受精的基礎(chǔ)液通常為SOF液、TALP液和BO液,主要成分為無機(jī)鹽離子,不含復(fù)雜的氨基酸和維生素等成分。張鎖鏈等[38]用BO液將精液稀釋、離心洗滌后,用含有20 mg/ mL BSA(Sigma)和5 mg/mL肝素調(diào)整精子密度為(20~30)×106個/mL,用精子懸浮液做成微小滴,將成熟培養(yǎng)后的卵母細(xì)胞移入該微小滴中進(jìn)行受精處理6 h后,將卵子移入以TCM199為基礎(chǔ)液的發(fā)育用培養(yǎng)液中繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng),卵裂率為40%~49.6%,囊胚率為15.8%~18.8%。劉新峰等[39]對不同受精液對山羊卵母細(xì)胞體外受精的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,BO液的受精率(62.2%)顯著高于TCM199液(44.7%),且卵裂率(21.6%)顯著高于TALP液(9.1%),極顯著高于TCM199(0.0%)。武建朝[40]對比了BO液和TALP液受精結(jié)果,表明TALP受精液受精率和卵裂率顯著高于BO液(55.88% : 33.33%,42.11% : 30.00%),但桑堪胚、囊胚率差異不顯著。說明TALP液比BO液更適合性成熟前山羊卵母細(xì)胞的體外受精。近年來,出現(xiàn)了將SOF液用于體外受精的受精液。陳曉勇[41]以SOF液為基礎(chǔ)液,比較了羔山羊卵母細(xì)胞與成年山羊卵母細(xì)胞體外受精與胚胎發(fā)育能力,結(jié)果顯示,羔羊卵母細(xì)胞在卵裂率(59.0%)和桑椹胚率(17.4%)方面都極顯著性低于成年羊卵裂率(82.4%)和桑椹胚率(46.4%)。

    2.3.3 精卵作用時間

    精卵作用時間對體外受精的效果非常重要,過短不足以保證受精率,過長又容易引起多精入卵。同時精卵孵育時間也受受精液中輔助獲能物質(zhì)的影響。精卵孵育作用時間也依受精液而不同,BO受精液[42]精卵作用6~8 h,TALP受精液精卵作用18~20 h,SOF受精液精卵作用22~24 h。

    2.3.4 其他

    體外受精效果還受精卵比率、溫度、水質(zhì)等因素的影響。精子濃度若過高易引起多精入卵,若過低又影響受精率,通常適宜體外受精的精子濃度為(1.0~1.5)×106個/mL,精卵比率為10 000~20 000∶1。溫度對體外受精效果有很大影響。戴榮亮[11]研究結(jié)果顯示,在37℃、38℃和39℃下,卵母細(xì)胞成熟率及其受精率差異不顯著,但39℃下的受精率(14.7%)高于 38℃(13.4%)和 40℃(12.8%)受精率。水質(zhì)是體外受精的一個重要影響因素,對體外受精的成功與否至關(guān)重要。水質(zhì)量對IVF有明顯影響,配制受精液的水應(yīng)該為超純水,是通過離子交換柱去除水中雜質(zhì)和離子,水在配制前應(yīng)經(jīng)過高溫高壓滅菌。陳曉勇等[43]研究表明,小尾寒羊胚胎發(fā)育液中添加10 μmol/L EDTA,16細(xì)胞以上胚胎率(100%)極顯著高于對照組(46.97%)。

    3 早期胚胎體外發(fā)育培養(yǎng)

    體外受精的早期胚胎發(fā)育存在阻斷現(xiàn)象,并不是都能發(fā)育至囊胚階段。近些年,通過改善體外培養(yǎng)條件,胚胎體外發(fā)育的能力有所提高。體外受精胚胎體外培養(yǎng)液主要有:復(fù)雜的培養(yǎng)液(TCM199等)和成分明確的培養(yǎng)液(SOF、CR1等)?;境煞种饕o機(jī)鹽、氨基酸、維生素、碳水化合物、抗生素、能量底物和蛋白質(zhì)等。呂麗華[44]研究山羊胚胎體外培養(yǎng)結(jié)果表明,顆粒細(xì)胞和輸卵管上皮細(xì)胞共培養(yǎng)胚胎條件下,體外受精胚胎的卵裂率分別為 46.3%和40.8%,顯著高于無共培養(yǎng)體系組 28.1%;發(fā)育到 8~16細(xì)胞的胚胎比率分別為 49.1%和45.0%,極顯著高于無共培養(yǎng)組 5.7%;囊胚數(shù)比率分別為 17.6%、20.0%,極顯著高于對照組;前48 h SOF+BSA后48 h SOF+FCS胚胎培養(yǎng)液更能促進(jìn)胚胎發(fā)育(囊胚率34.7%)。王艾平等[21]向胚胎培養(yǎng)液中添加亞硫磺酸(HTAU) 研究其對山羊體外胚胎發(fā)育的影響,結(jié)果顯示,亞硫磺酸有益于早期胚胎的體外發(fā)育,胚胎培養(yǎng)液中HTAU的優(yōu)選濃度為0.5 mmol/L。張家新等[45]比較了非必需氨基酸(NEAA)、必需氨基酸(EAA)對綿羊體外胚胎的發(fā)育。結(jié)果表明,胚胎培養(yǎng)液單獨(dú)添加NEAA可明顯提高綿羊胚胎的囊胚發(fā)育率;單獨(dú)添加EAA對綿羊桑椹期前的胚胎發(fā)育沒有促進(jìn)作用,但可以促進(jìn)囊胚孵化;0.5×EAA+1×NEAA組合的囊胚率和囊胚孵化率最高,分別為44%和33%。武建朝[40]比較了性成熟前山羊受精卵CR1aa和SOFaa胚胎發(fā)育體系,結(jié)果表明SOFaa培養(yǎng)系統(tǒng)的卵裂率和桑椹胚囊胚率顯著高于CR1aa培養(yǎng)系統(tǒng)(42% :35.56%,12% : 5.71%)。試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),通過改進(jìn)胚胎培養(yǎng)液、培養(yǎng)方法,已大幅提高了胚胎體外發(fā)育能力。

    4 結(jié)語

    經(jīng)過科研人員大量的試驗(yàn)研究,目前體外受精率有所提高,但對部分卵母細(xì)胞和早期胚胎的發(fā)育調(diào)節(jié)機(jī)理不是很清楚,卵母細(xì)胞核質(zhì)成熟是否真正成熟,其影響到受精和胚胎的發(fā)育;精卵受精過程中,不正常受精情況;受精卵發(fā)育阻斷及胚胎持續(xù)發(fā)育能力等都是制約體外受精技術(shù)真正實(shí)現(xiàn)推廣應(yīng)用的瓶頸??傊?,山羊IVF技術(shù)研究已經(jīng)取得了重大的進(jìn)步,還需進(jìn)一步深入研究IVM、精子處理、IVF、IVC等相關(guān)技術(shù)環(huán)節(jié),明確其互相影響機(jī)制,優(yōu)化集成技術(shù),才能使其真正走向養(yǎng)殖業(yè)的推廣應(yīng)用領(lǐng)域。

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    S814.3;S826.3

    B

    1005-2739(2017)01-0007-07

    2016-11-03

    豆興堂(1978-),男,碩士,高級

    畜牧師,主要從事絨山羊繁殖育種與胚胎工程技術(shù)研究與推廣工作。E-mail:dou791120@sina.com

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