公豬精液常溫液態(tài)保存的研究進(jìn)展

李 琦，李雁冰，黃大鵬，魏國生*，李井春*

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

專論綜述

公豬精液常溫液態(tài)保存的研究進(jìn)展

李 琦，李雁冰，黃大鵬，魏國生*，李井春*

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

由于豬精子對于冷休克的應(yīng)激反應(yīng)較為敏感，使得豬精液的常溫液態(tài)保存比冷凍保存得到了較快得發(fā)展。本文就豬常溫精液的定義及外界影響因素、稀釋液中的添加物質(zhì)以及稀釋粉（液）配方的設(shè)計(jì)等幾個(gè)方面進(jìn)行了總結(jié)，闡述了影響豬常溫精液保存效果的幾個(gè)主要因素，探討了豬常溫精液保存研究中的一些問題并做了展望。

豬精子；常溫保存；影響因素；精液品質(zhì)

在2011年1月1日實(shí)行的《豬常溫精液生產(chǎn)與保存技術(shù)規(guī)范》國標(biāo)中定義豬的常溫精液為“經(jīng)稀釋后在16～18℃下短期保存，仍具有受精能力的精液”。國家相關(guān)技術(shù)規(guī)范的制定有利于豬精液常溫保存技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用。

與其他動(dòng)物精液冷凍保存相比，豬精子由于其膜的磷脂酰膽堿含量較低，而磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂含量較高，膽固醇在質(zhì)膜上分布不對稱，并且膽固醇/磷脂比率顯著低于其他哺乳動(dòng)物精子，這就使得豬精子對低溫的敏感程度較其他動(dòng)物要高。正是由于豬精子對于冷休克的應(yīng)激反應(yīng)較為敏感，所以在豬精液的冷凍保存方面應(yīng)用較少[1]。目前，國內(nèi)使用人工授精技術(shù)的豬場95%以上應(yīng)用的精液是常溫液態(tài)保存的。現(xiàn)將豬精液常溫保存的研究進(jìn)展做一綜述。

1 豬常溫精液保存的物理影響因素

豬精液的常溫保存常受到溫度、pH值、滲透壓等的影響。由于豬精子自身?xiàng)l件的限制，在常溫條件下如何提高精液的保存時(shí)間以及保存質(zhì)量，這將會(huì)給今后種豬繁育事業(yè)帶來廣闊的應(yīng)用前景。

1.1 溫度

低溫會(huì)導(dǎo)致豬精子產(chǎn)生冷休克現(xiàn)象，而且這種現(xiàn)象是不可逆的。所以在精液稀釋前常將精液置于室溫或30℃條件下數(shù)小時(shí)，使精子對低溫產(chǎn)生一定的耐受能力，這將對延長精子的保存時(shí)間、保證精子的存活率和頂體的完整性有一定積極的作用，但機(jī)理有待進(jìn)一步研究[2]。通過相關(guān)學(xué)者不斷地摸索與研究，逐漸確立15～20℃為豬精液液態(tài)保存的最適范圍，而16～18℃在生產(chǎn)中應(yīng)用最為普遍[3]。精液的在較高溫度下，其質(zhì)量與精子質(zhì)膜上的熱休克蛋白有關(guān)[4]。溫度低于14℃或超過20℃則會(huì)降低精液的保存時(shí)間以及精液的品質(zhì)。

1.2 pH值和滲透壓

新鮮豬原精的pH值在7.2～7.5之間，適當(dāng)?shù)牡蚿H值可以降低精子的代謝和運(yùn)動(dòng)水平。在附睪內(nèi)精子可以存活30～60 d，這與附睪內(nèi)環(huán)境呈弱酸性（6.2～6.8）有很大的聯(lián)系[5]。一系列的研究證明，偏酸性的環(huán)境有利于精子的保存。在稀釋液添加NaHCO3、檸檬酸鈉等緩沖劑有利于平衡精子以及細(xì)菌的代謝產(chǎn)物，維持一個(gè)動(dòng)態(tài)的相對平衡的酸堿環(huán)境，可以防止因保存液的過度酸化而導(dǎo)致精子成活率下降等問題的發(fā)生。當(dāng)精液保存液的pH為5.7～6.4時(shí)，精子的頂體發(fā)生異常的情況會(huì)增加[6]。除上述的緩沖劑外，一般還會(huì)在保存液中添加一些具有金屬螯合能力的兩性緩沖劑，如HEPES等。

豬精子的滲透壓在290～300 mosM，可耐受的滲透壓為240～380 mosM。精子可以在附睪中存活較長的時(shí)間，還與附睪中的滲透壓偏高有關(guān)。附睪中的滲透壓為400 mosM，使精子發(fā)生脫水現(xiàn)象，導(dǎo)致精子缺乏運(yùn)動(dòng)所需最低水分，使得精子不能運(yùn)動(dòng)，但在體外條件下精子卻無法承受這種高水平的滲透壓，可能與精子是否獲能有關(guān)。稀釋液的離子濃度對維持滲透壓沒有太大的作用，但離子濃度過高會(huì)造成精子表面蛋白溶解和脫落，給精子造成損傷。

1.3 微生物

在精液的體外保存過程中不可避免會(huì)受到細(xì)菌等微生物的影響。豬精液常溫保存稀釋劑中 一般含有葡萄糖，其作用是為精子的生命活動(dòng)供能，但在精液常溫保存的溫度條件下葡萄糖會(huì)被絕大多數(shù)微生物細(xì)菌所利用。其作用方式包括競爭營養(yǎng)物質(zhì)導(dǎo)致精子活力下降、含有凝集因子使精子聚集、降低環(huán)境滲透壓造成頂體腫脹以及無氧發(fā)酵使糖分產(chǎn)酸，從而導(dǎo)致p H降至酸性（5.7～6.4）等。一般排除特殊環(huán)境的影響，精液中的微生物主要以腸桿菌和少量的葡萄球菌屬和絲狀真菌為主。大腸桿菌等革蘭氏陰性菌對精液保存的影響較大，會(huì)造成精液質(zhì)量下降[7]。多種微生物污染的精液，精子活力會(huì)嚴(yán)重下降，有效保存時(shí)間縮短，使用這樣的精液進(jìn)行人工授精會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。負(fù)面效應(yīng)包括母豬受孕率降低、母豬豬群生產(chǎn)性能降低、造成母豬子宮內(nèi)膜炎、病原感染，從而進(jìn)一步增加母豬淘汰率。

為了將這種損害降到最低，人們在精液的稀釋液中添加不同種類的的抗生素如青霉素、鏈霉素等。一般青霉素鈉的添加量為0.6 g/L，硫酸鏈霉素的添加量為1 g/L。添加抗生素可以殺死或抑制有害細(xì)菌，延長精液的保存時(shí)間，提高受精能力。但是，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌耐藥性不斷增強(qiáng)。青霉素在稀釋精液中12 h效價(jià)降低50%，精子保存時(shí)間和效果均無法達(dá)到理想效果。可見，過去常在精液稀釋液中添加的青霉素和鏈霉素已無法有效抑制細(xì)菌微生物生長繁殖。隨著青霉素在稀釋精液中作用的減弱，不斷有學(xué)者研發(fā)新的抗生素。由于磺胺類抗生素的抗菌譜較廣，毒副作用輕，對常見細(xì)菌、螺旋體和某些放線菌均能表現(xiàn)出抑制作用，被廣泛應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)各環(huán)節(jié)[8]。其他種類的抗生素還有，比如恩諾沙星、阿奇霉素、林肯霉素，氨苯磺胺等，但有關(guān)各種抗生素在稀釋精液中的抑菌效果還有待進(jìn)一步研究。

2 稀釋液的添加物質(zhì)

在常溫保存的過程中，精液質(zhì)量還受到微生物、過氧化物濃度、抗氧化能力以及其他精子保護(hù)成分的影響。精液的稀釋液主要為精子提供一個(gè)穩(wěn)定的體外生存環(huán)境，維持精子各項(xiàng)功能的正常。常見的稀釋液BTS和Modena中都含有能量物質(zhì)、緩沖物質(zhì)、無機(jī)鹽、抗生素等組分，來為精子提供能量、合適的pH、合適的滲透壓、合理的離子濃度以及相對無菌的環(huán)境。有研究發(fā)現(xiàn)，在豬精液的3種稀釋液Modena、BTS、GEPS中保存效果較好的是Modena[9]。

人們還向稀釋液中添加其他成分如抗氧化劑，以及其他種類的保護(hù)成分來進(jìn)一步保證精子活力以及受精能力。

2.1 無機(jī)鹽離子

一些離子對精子的存活和功能是必需的。較低濃度的K+可維持精子膜上Na+—K+泵運(yùn)轉(zhuǎn),使胞內(nèi)K+濃度大于胞外，產(chǎn)生ATP維持精子的存活和運(yùn)動(dòng)，因此在稀釋液中添加KCl可防止精子耗竭K+而喪失運(yùn)動(dòng)能力。還有一些離子不利于精子保存，如有緩沖作用的HCO3-，若過量就會(huì)使精子質(zhì)膜結(jié)構(gòu)改變，使質(zhì)膜不穩(wěn)定誘發(fā)獲能，因此需要控制濃度。Ca2+跨膜流入胞內(nèi)會(huì)啟動(dòng)精子獲能,引起頂體反應(yīng)，這對完成受精是必需的，但對保存卻是有害的。因此,配制稀釋液常用去離子水，并加入EDTA等鏊合Ca2+和有害重金屬離子。

2.2 抗氧化劑

在精液的常溫保存過程中，精子呼吸代謝會(huì)產(chǎn)生活性氧族（ROS），低濃度的ROS有利于提高精子的活力以及受精能力，但高濃度的ROS會(huì)造成精子脂質(zhì)的過氧化（LOP），改變精子質(zhì)膜的通透性，這會(huì)降低精子的活力以及受精能力。所以常在精液的稀釋液中添加抗氧化劑成分來保證精子的活力以及受精能力。谷胱甘肽（GSH）是一種三肽化合物，可以抑制質(zhì)膜上脂質(zhì)的過氧化。VB12、VE、VC、大棗多糖和葡萄籽原花青素，也都具有抗氧化的作用。有研究表明，在豬的精液稀釋液中添加1 mmol/L的谷胱甘肽對精液有較好的保護(hù)效果，而添加1和5 mmol/L的維生素E對精液常溫保存有害的效果[10]。而添加400 μmol/L的維生素E可以顯著降低保存4 d精液中MDA的含量[11]。在豬精液的稀釋液中添加適量的褪黑素可以提高精液的抗氧化能力和精子運(yùn)動(dòng)學(xué)參數(shù)，保護(hù)精子質(zhì)膜、頂體和DNA 完整性，提高精子的受精能力[12]。

2.3 精子質(zhì)膜保護(hù)劑

精子的質(zhì)膜完整性對于維持精子自身的新陳代謝、精子獲能以及頂體反應(yīng)等都起著至關(guān)重要的作用。海藻糖作為一種非滲透性保護(hù)劑，能夠在精子的細(xì)胞膜外形成一層保護(hù)膜，從而保護(hù)質(zhì)膜的完整性。同時(shí)，海藻糖還具有穩(wěn)定細(xì)胞膜蛋白質(zhì)的作用。稀釋粉配方的設(shè)計(jì)者認(rèn)為，海藻糖在極冷環(huán)境下可以保護(hù)精子的質(zhì)膜，在常溫下對精子的質(zhì)膜同樣能起到保護(hù)作用，該配方通過添加 1 g 海藻糖，使保存 7 d 精液的頂體異常率由原來的20%下降到11%。高建明等[13]，在自己設(shè)計(jì)篩選的100 ml稀釋液中額外添加 0.15 g海藻糖，顯著提高了精液的保存時(shí)間，其保存效果要優(yōu)于添加維生素B12組。精子長效稀釋液中添加AEG和SCP可以有效降低精子代謝活性以及保護(hù)精子質(zhì)膜完整性[14]。除海藻糖之外，其他一些糖類同樣能對精子的膜結(jié)構(gòu)起到一定的保護(hù)作用，如蔗糖、果糖等。

2.4 抗菌素

精液保存液中細(xì)菌會(huì)降低精液的保存時(shí)間，使精子更易反生凝集，使pH下降，使頂體發(fā)生異常的情況增加，并在保存的第2天就有體現(xiàn)。應(yīng)用后會(huì)導(dǎo)致母豬的返情率升高，陰道內(nèi)分泌物增多，增加母豬陰道的感染機(jī)率，從而增加母豬的淘汰率[6]。由于抗生素的不正確使用，導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性不斷增強(qiáng)，所以急需研制一種抗生素的替代品，這種替代品不會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，因此抗菌肽進(jìn)入了人們的視線?？咕脑咐ハx體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)而產(chǎn)生的一類具有抗菌活性的堿性多肽物質(zhì)，分子量在2 000～7 000 D左右，由20～60個(gè)氨基酸殘基組成。這類活性多肽多數(shù)具有強(qiáng)堿性、熱穩(wěn)定性以及廣譜抗菌等特點(diǎn)，但部分抗菌肽對真核生物有一定的毒副作用[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，在BTS保存液添加低濃度的環(huán)狀六肽比使用抗生素的對照組要好，并且將添加有低濃度的環(huán)狀六肽的精液通過人工授精技術(shù)輸入到母豬的子宮內(nèi)，其受胎率不會(huì)受到影響，發(fā)現(xiàn)這種環(huán)狀六肽可以作為補(bǔ)充或替換保存液中的抗生素[16]。

2.5 其他保護(hù)成分

牛血清白蛋白（BSA）是一種蛋白類保護(hù)劑，具有穩(wěn)定精子結(jié)構(gòu)，中和精子有害代謝產(chǎn)物，維持精子運(yùn)動(dòng)和減少精子凝集等多種功能，從而起到延長精液保存時(shí)間，提高保存后精液的受精能力的作用。在精液稀釋液中添加4 mg/mL的牛血清白蛋白（BSA），其精液的保存效果最好[17]。但BSA在較高濃度下會(huì)導(dǎo)致精子的獲能，所以添加時(shí)一定注意用量。

中草藥作為我國醫(yī)藥的瑰寶在豬精液的保存方面也有一定的應(yīng)用。在豬精子常溫保存和降溫過程中白藜蘆醇對精子具有一定的保護(hù)作用，能夠清除豬精子內(nèi)的活性氧自由基，減弱氧自由基對精子的損傷,提高精子的品質(zhì)。在常溫保存中最佳保護(hù)濃度為50μmol/L[18]。有研究發(fā)現(xiàn),中草藥何首烏，其主要活性成分TSG是重要的抗氧化劑，具有增強(qiáng)免疫力、抗氧化損傷和抗衰老等作用，也可應(yīng)用在豬精液保存方面。但由于許多中草藥的成分并不明確，以及添加劑量可能隨草藥產(chǎn)地的不同而不同，所以具體的應(yīng)用還有待進(jìn)一步的研究。但隨著科技的發(fā)展以及中草藥低溫萃取技術(shù)的不斷完善，相信在不久的將來中草藥將發(fā)揮越來越重要的作用。

3 結(jié)語及展望

豬精液的液態(tài)保存經(jīng)過幾十年發(fā)展, 應(yīng)用已經(jīng)非常的廣泛，為我國現(xiàn)代養(yǎng)豬行業(yè)的發(fā)展做出重要的貢獻(xiàn)。相信隨著科技進(jìn)步以發(fā)展以及相關(guān)學(xué)者的不斷研究探索，豬精液常溫液態(tài)保存技術(shù)將向保存長久、價(jià)格便宜、高效的方向發(fā)展。

[1]GUO, Chen, WANG et al.Effect of bovine serum albumin on the micellization of poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide)-poly(ethylene oxide) block copolymers in aqueous solutions by fluorescence spectroscopy[J].Science China Chemistry 2006, 49(6)：541-549.

[2]Zou C X, Yang Z M.Evaluation on sperm quality of freshly ejaculated boar semen during in vitro storage under different temperatures[J].Theriogenology 2000, 53(7)：1477-1488.

[3]Martín-Hidalgo D, Barón F J, Bragado M J et al.The effect of melatonin on the quality of extended boar semen after long-term storage at 17 ℃[J].Theriogenology 2011, 75（8）： 1550-1560.

[4]Huang S Y, Kuo Y H, Lee Y P et al.Association of heat shock protein 70 with semen quality in boars[J].Animal Reproduction Science 2000, 63(3-4)：231-240.

[5]王鋒.動(dòng)物繁殖學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社, 2012.

[6]Althouse G C, Kuster C E, Clark S G et al.Field investigations of bacterial contaminants and their effects on extended porcine semen[J].Theriogenology 2000, 53(5)：1167-1176.

[7]Niederberger C.Re： Analysis of the Relationships Between Oxidative Stress, DNA Damage and Sperm Vitality in a Patient Population：Development of Diagnostic Criteria[J].Journal of Urology 2011, 185(6)：2282.

[8]李雪冰, 付浩, 林朋飛，等.pH值對活性炭吸附水中磺胺類抗生素的影響研究[J].中國給水排水 .2015(1)： 56-60.

[9]Lalrintluanga K, Deka B C, Nath K C et al.Effect of Different Extenders on The Quality of Boar Semen During Preservation At 18° C[J].International Journal of Multidisciplinary Approach & Studies 2016, 3(1)：224-232.

[10]Vongpralub T, Thananurak P, Sittikasamkit C, et al.Comparison of Effects of Different Antioxidants Supplemented to Long-term Extender on Boar Semen Quality Following Storage at 17° C[J].The Thai Journal of Veterinary Medicine, 2016, 46(1)： 119.

[11]Mendez M F, Zangeronimo M G, Rocha L G et al.Effect of the addition of IGF-I and vitamin E to stored boar semen[J].animal 2013, 7(5)：1-6.

[12]Jang H Y, Kim Y H, Kim B W et al.Ameliorative effects of melatonin against hydrogen peroxideinduced oxidative stress on boar sperm characteristics and subsequent in vitro embryo development[J].Reproduction in DomesticAnimals 2010, 45(6)：943-950.

[13]高建明, 虞桂平, 邵世義,等.不同稀釋液對豬精液常溫保存效果的影響[J].中國畜牧雜志， 2007, 43(13)：12-14.

[14]Dziekońska A, Fraser L, Majewska A et al.Effect of commercial long-term extenders on metabolic activity and membrane integrityof boar spermatozoa stored at 17 degrees C[J].Polish Journal of Veterinary Sciences 2016, 16(3)：517-525.

[15]Schulze M, Junkes C, Mueller P et al.Effects of cationic antimicrobial peptides on liquidpreserved boar spermatozoa[J].Plos One 2014, 9(6)：e100490-e100490.

[16]Schulze M, Dathe M, Waberski D et al.Liquid storage of boar semen： Current and future perspectives on the use of cationic antimicrobial peptides to replace antibiotics in semen extenders[J].Theriogenology 2016, 85(1)：39-46.

[17]Zhang X G, Yan G J, Hong J Y et al.Effects of Bovine Serum Albumin on Boar Sperm Quality During Liquid Storage at 17℃[J].Reproduction in Domestic Animals 2015, 50(2)：263–269.

[18]范曉騰.白藜蘆醇對豬精子在常溫保存和冷打擊過程中的保護(hù)作用[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào), 2016.

S828.3

A

1005-2739（2017）01-0003-05

2016-12-09

黑龍江省農(nóng)墾總局科研計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：HNK135-04-06；HNK135-04-02-03）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.31402136）；黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)博士啟動(dòng)基金（B2012-06）；黑龍江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（JJ2017ZR0120）；大慶市指導(dǎo)性科技計(jì)劃項(xiàng)目（zd2016-087）。

李琦（1992-），男，在讀碩士研究生。

＊通信作者：魏國生，男，教授。李井春，男，博士，講師，研究方向?yàn)閯?dòng)物繁殖生物技術(shù)。E-mail：ljchun112@163.com