老齡化家兔左心房重構(gòu)對(duì)房性心律失常的影響*

王 騰， 陳玉婷， 曹 紅， 黃 燕， 劉 韜， 鄒 強(qiáng)

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科，武漢大學(xué)心血管病研究所，湖北 武漢 430060)

老齡化家兔左心房重構(gòu)對(duì)房性心律失常的影響*

王 騰△， 陳玉婷， 曹 紅， 黃 燕， 劉 韜， 鄒 強(qiáng)

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科，武漢大學(xué)心血管病研究所，湖北 武漢 430060)

目的： 探討老齡化左心房(LA)電和結(jié)構(gòu)重構(gòu)對(duì)房性心律失常的影響及機(jī)制。 方法：選用健康雄性新西蘭大耳白兔，分為青齡LA組[兔齡(8±2)月]和老齡LA組[兔齡(25±2)月]。記錄在體左心房肌單相動(dòng)作電位(MAP)和短陣快速刺激方法觀察2組動(dòng)作電位的靜息膜電位(RMP)、幅度(APA)、最大上升速率(dv/dtmax)、平臺(tái)期電位、復(fù)極化到30%、50%和90%時(shí)程(APD30、APD50和APD90)以及心律失常誘發(fā)率和持續(xù)時(shí)間；全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄各組L型鈣電流(ICa,L)；Masson染色觀察各組左心房組織間質(zhì)膠原纖維及其蛋白含量，透射掃描電鏡觀察左心房細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)；Western blot技術(shù)測(cè)定各組左心房組織Cav1.2蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)果：與青齡LA組比較，老齡LA組心房肌動(dòng)作電位的dv/dtmax和平臺(tái)期電位顯著降低，APD30和APD50明顯縮短，APD90顯著延長(zhǎng)(P<0.01)；其房性心律失常的誘發(fā)率明顯增高，持續(xù)時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.01)。在電壓鉗制方式下，與青齡LA組比較，老齡LA組左心房肌細(xì)胞ICa,L密度在各鉗制電壓下均明顯減小，其電流-電壓曲線(xiàn)顯著上抬；當(dāng)鉗制電位為+20 mV時(shí)，老齡LA組心肌細(xì)胞ICa,L密度由青齡LA組的(11.72±1.39) pA/pF減小為(6.08±0.98)pA/pF(P<0.01)。與青齡LA組比較，老齡LA組心肌組織中膠原纖維明顯增多，膠原蛋白含量顯著增加(P<0.01)，心房肌組織排列不規(guī)則。老齡LA組心房肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)異常改變，心房肌細(xì)胞核固縮，線(xiàn)粒體排列雜亂，腫脹或出現(xiàn)空泡，肌小節(jié)損傷嚴(yán)重。老齡LA組織中的Cav1.2蛋白表達(dá)水平明顯小于青齡LA(P<0.01)，其表達(dá)量與老齡LA組ICa,L密度減小呈顯著正相關(guān)(r=0.83，P<0.01)。 結(jié)論：老齡LA發(fā)生了明顯的病理生理特征性改變而增加了老齡化房顫發(fā)生的易損性和易感性，其機(jī)制與老齡化LA的ICa,L減小、超微結(jié)構(gòu)改變和Cav1.2蛋白表達(dá)水平下降密切相關(guān)。

老齡化左心房； 心肌重構(gòu)； Ca2+通道； 房性心律失常發(fā)生

心房顫動(dòng)(atrial fibrillation, AF)簡(jiǎn)稱(chēng)房顫,是臨床上最常見(jiàn)且極易導(dǎo)致患者心衰和腦卒中發(fā)生而成為發(fā)病率和死亡率均很高的心律失常。它的發(fā)生、維持和傳遞與左心房本身解剖結(jié)構(gòu)固有特征和老齡化等密切相關(guān)[1]。左心房細(xì)胞間質(zhì)蛋白較右心房更加易于纖維化，其動(dòng)作電位平臺(tái)期隨年齡增加逐漸減小變?nèi)?，組織間質(zhì)纖維化隨老齡化增加不斷加劇。它還是血小板容易聚集，造成血栓形成，增加AF發(fā)生率，導(dǎo)致AF患者發(fā)生中風(fēng)的危險(xiǎn)組織[2]。左心房電生理和組織結(jié)構(gòu)特征改變?cè)贏F啟動(dòng)和維持中起到關(guān)鍵作用，容易誘發(fā)折返性房性心律失常[3]。

年齡在房性心律失常發(fā)生中亦起著重要作用，隨著年齡增加，老齡化心房結(jié)構(gòu)發(fā)生“去分化”，左心房?jī)?nèi)徑比右心房?jī)?nèi)徑明顯擴(kuò)大，心壁變薄，組織結(jié)構(gòu)中膠原蛋白沉積并增加[4]；老齡化心房電沖動(dòng)傳導(dǎo)速度下降，動(dòng)作電位形態(tài)發(fā)生異常，心房肌細(xì)胞L型鈣電流(L-type calcium current，ICa,L)減少，允許Ca2+通過(guò)的L型鈣通道α1C亞基(Cav1.2)表達(dá)下降，造成基于ICa,L形成的動(dòng)作電位發(fā)放、傳導(dǎo)和形態(tài)改變而易于AF發(fā)生[5]。所以，當(dāng)人體進(jìn)入老齡階段并隨著老齡程度進(jìn)一步發(fā)展時(shí)，老齡化左心房(left atrium，LA)在AF發(fā)生發(fā)展中可能顯得更加突出，只是具體原因和可能機(jī)制還沒(méi)有完全知曉和確定[6]。本文將利用細(xì)胞電生理和組織病理學(xué)以及分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)記錄和觀察青齡和老齡家兔左心房電與結(jié)構(gòu)重構(gòu)，深入探討老齡化LA易于AF發(fā)生的病理生理機(jī)制，旨在為臨床預(yù)防和治療老齡化AF發(fā)生提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康雄性新西蘭大耳白兔，選購(gòu)于武漢生物制品研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心。動(dòng)物購(gòu)回后飼養(yǎng)于本院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)在青齡左心房組(young left atrium group, young LA group)和老齡左心房組(aged left atrium group, aged LA group)中展開(kāi)，每組25只。青齡兔為性成熟成年個(gè)體，兔齡(8±2)月[體重為(2 580±65) g，心臟重量為(8.9±1.4) g]；老齡兔齡(25±2)月[體重為(4 500±150) g，心臟重量為(20.5±2.7) g][7]。整個(gè)飼養(yǎng)過(guò)程充分提供動(dòng)物所需要的濕度、溫度和光線(xiàn)，自由進(jìn)食和飲水，2周后進(jìn)入相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器 16導(dǎo)電生理記錄和分析系統(tǒng)(AD Instruments)；刺激器(Grass S88)；膜片鉗放大器和Pulse+PulseFit程控系統(tǒng)(HEKA)；倒置顯微鏡(Olympus)；數(shù)據(jù)擬合軟件(Igor Pro)；病理圖像數(shù)字分析系統(tǒng)(NIH Image 1.6)；超薄切片機(jī)(Bromma)；-80 ℃冰箱(Sanyo)；酶標(biāo)儀(Bio-tek)；垂直電泳儀(Bio-Rad)；Western blot電泳儀(Invitrogen)；雙通道熒光掃描儀(Li-Cor)；紫外凝膠成像系統(tǒng)(Vilber)。

1.3 主要溶液及試劑 Tyrode液(mmol/L)： NaCl 135.0, KCl 5.4, CaCl21.8, MgCl21.0, NaH2PO40.33, HEPES 10.0, glucose 10.0, pH用NaOH 調(diào)至7.35。無(wú)Ca2+Tyrode 液和含有0.2 mmol/L Ca2+的Tyrode液分別為T(mén)yrode 液中無(wú)CaCl2和僅加0.2 mmol/L CaCl2。ICa,L細(xì)胞外液(mmol/L)： CsCl 5.4, MgCl21.0, BaCl22.0, HEPES 5.0, glucose 11.0, pH用CsOH調(diào)至7.4；ICa,L細(xì)胞內(nèi)液(mmol/L)： CsCl 100, TEA-Cl 30, EGTA 10, HEPES 5，pH用CsOH調(diào)至7.4。河豚毒素(tetrodotoxin, TTX)購(gòu)自河北省水產(chǎn)研究所；膠原酶Ⅰ、蛋白酶E、小牛血清白蛋白、4-氨基吡啶(4-aminopyridine，4-AP)、HEPES、EGTA、維拉帕米、TBST緩沖液和脫脂奶粉均購(gòu)自Sigma；兔抗人Cav1.2單克隆抗體、兔抗人GAPDH單克隆抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的II抗均購(gòu)自Epitomics。

2 方法

2.1 在體單相動(dòng)作電位(monophasic action potential，MAP)記錄 將兔(每組10只)仰臥固定于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物臺(tái)上，臺(tái)面用溫控電熱毯將兔體溫維持在37 ℃，用16導(dǎo)電生理記錄系統(tǒng)監(jiān)測(cè)Ⅱ?qū)碾妶D。3%戊巴比妥鈉麻醉(300 mg/kg)，開(kāi)胸，開(kāi)瞼器撐開(kāi)胸廓充分暴露心臟，剪開(kāi)心包膜，用接觸式雙極微電極記錄自律心率下左心耳前壁MAP，該電位由膜電位放大器放大后經(jīng)數(shù)模轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換并由濾波器(0.3 Hz～1 kHz)濾過(guò)，輸入到計(jì)算機(jī)形成并保存，后用系統(tǒng)自帶兔的分析模塊對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行測(cè)量、分析和統(tǒng)計(jì)。觀察MAP主要參數(shù)包括靜息膜電位(resting membrane potential，RMP)、動(dòng)作電位幅度(action potential amplitude，APA)、動(dòng)作電位最大上升速率(dv/dtmax)、動(dòng)作電位平臺(tái)期電位(action potential plateau，Plateau)以及動(dòng)作電位復(fù)極化到30%、50%和90%的時(shí)間(APD30、APD50和APD90)。

2.2 短陣快速刺激誘發(fā)房性心律失常記錄 將刺激電極置于兔(每組10只)右心房心外膜，由刺激器發(fā)放刺激，用短陣快速刺激法(burst-pacing)[8]，以刺激波寬2 ms，刺激強(qiáng)度50 Hz，持續(xù)時(shí)間20 s，對(duì)兔進(jìn)行刺激，觀察各組兔誘發(fā)房性心律失常，包括房性早搏、房性心動(dòng)過(guò)速或AF。圖形存于計(jì)算機(jī)，后用系統(tǒng)自帶兔的分析模塊對(duì)圖形進(jìn)行測(cè)量和分析，監(jiān)測(cè)指標(biāo)包括房性心律失常誘發(fā)率和持續(xù)時(shí)間。當(dāng)各組在體電生理記錄完成后，將存活的兔用于分離左心房肌細(xì)胞，開(kāi)展膜片鉗實(shí)驗(yàn)(每組記錄12個(gè)細(xì)胞)。

2.3 LAs心肌細(xì)胞的分離 將上述各組存活兔麻醉和肝素化，手術(shù)摘下整體心臟，插入主動(dòng)脈套管，用正常Tyrode液行Langendorff灌流(流速18～20 mL/min，37 ℃，100% O2飽和)。心臟恢復(fù)跳動(dòng)后，改為無(wú)Ca2+的Tyrode液灌流5 min，再用含0.33 mmol/L膠原酶Ⅰ、0.25 mmol/L蛋白酶E和0.25 g/L BSA無(wú)Ca2+Tyrode液循環(huán)灌流心臟10 min，最后用無(wú)Ca2+Tyrode液沖洗3 min終止反應(yīng)，剪取左心房組織，置于含0.2 mmol/L的Ca2+Tyrode 液燒杯中剪碎、振蕩和過(guò)濾，得到含單個(gè)左心房細(xì)胞懸液，以500 r/min的低速離心10 min，棄上清液，用含0.25 g/L牛血清白蛋白和2×105U/L氨芐青霉素的Tyrode液將細(xì)胞密度調(diào)整至5×108/L，供膜片鉗實(shí)驗(yàn)用。

2.4ICa,L及其電流-電壓(I-V)曲線(xiàn)的記錄 將分離的左心房心肌細(xì)胞懸液加入倒置顯微鏡載物臺(tái)上的細(xì)胞記錄槽中，等細(xì)胞靜置沉底貼壁，用ICa,L細(xì)胞外液循環(huán)灌流10 min(37 ℃)，后進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄，在Pulse+PulseFit軟件控制下，指令程序和記錄信號(hào)經(jīng)放大器轉(zhuǎn)換和放大，并通過(guò)充灌ICa,L電極內(nèi)液玻璃微電極與細(xì)胞封接，直到電阻達(dá)1 GΩ以上，補(bǔ)償快電容，施加負(fù)壓吸破細(xì)胞膜并作慢電容和漏電容補(bǔ)償，形成膜片鉗記錄模式。以鉗制電位-40 mV，指令電位從-40 mV到+60 mV，躍階10 mV，持續(xù)時(shí)間300 ms，可記錄到一緩慢的內(nèi)向電流，此電流能被鈣通道阻滯劑維拉帕米(20 μmol/L)阻斷，表明此電流為ICa,L。為消除Na+和K+電流的干擾，需要在ICa,L細(xì)胞外液中加入TTX(50 μmol/L)阻斷INa和 BaCl2(100 μmol/L)阻斷IK1。記錄ICa,L的數(shù)據(jù)經(jīng)Pulse軟件采集并存儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)，后用Igor Pro分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)圖形進(jìn)行擬合分析處理并應(yīng)用到論文。為消除細(xì)胞大小對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果造成誤差，ICa,L單位用電流密度(pA/pF)表示。ICa,L的I-V曲線(xiàn)繪制是以各自指令電位為橫坐標(biāo)，相對(duì)應(yīng)的電流密度為縱坐標(biāo)完成。

2.5 免疫組織化學(xué)和超微結(jié)構(gòu)觀察 將各組剩下5只兔手術(shù)開(kāi)胸，摘下心臟，置入冰凍生理鹽水中洗凈殘血，旋即剪取1 cm×1 cm×1 cm左心房組織置于4%甲醛液中固定應(yīng)用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)，另取1 mm×1 mm×1 mm置于預(yù)先冷凍的0.1 mol/L磷酸緩沖液+戊二醛中固定用于超微結(jié)構(gòu)檢查，剩下的保存于-80 ℃冰箱中供Western blot實(shí)驗(yàn)使用。首先將用于免疫組織化學(xué)的LA經(jīng)梯度乙醇系列脫水，常規(guī)石蠟包埋切片(留取第30～32張切片為實(shí)驗(yàn)用切片，厚度4 μm)，行心臟膠原Masson染色。光學(xué)顯微鏡下選取切片中血管以外的區(qū)域觀察膠原分布和著色情況，利用圖像采集分析系統(tǒng)拍片保存并測(cè)定心肌間質(zhì)膠原面積。切片中間質(zhì)膠原纖維被染成藍(lán)綠色，其定量計(jì)算是以單位測(cè)量面積中的膠原所占百分比作為間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)。用作超微切片檢查的組織是將標(biāo)本在0.1 mmol/L磷酸緩沖液中漂洗3次，再用1%鋨酸固定，后經(jīng)梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，用超薄切片機(jī)切片，醋酸雙氧鈾+枸櫞酸鉛染色，最后用透射電鏡觀察左心房細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

2.6 Western blot法檢測(cè)Cav1.2的表達(dá)水平 將LA組織加入到冰凌包繞并預(yù)存有1 mL組織蛋白裂解液和20 μL蛋白酶抑制劑的EP管中(10 mg組織加入100 μL裂解液)，用勻漿器勻漿，12 000 r/min、4 ℃條件下離心并保存待用。按聚丙烯酰胺凝膠電泳法灌制10%凝膠，用Teflon梳子在凝膠上制備上樣孔，把Marker和待測(cè)LA提取液各50 μL加入到上樣孔中，接通電源電泳、標(biāo)記、轉(zhuǎn)膜，后用考馬斯亮藍(lán)檢測(cè)、TBST液浸洗和5%脫脂奶粉封閉，最后加入兔抗人Cav1.2單克隆抗體和兔抗人單克隆抗GAPDH抗體并振蕩和孵育過(guò)夜，與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔Ⅱ抗(1∶5 000)各0.6 μL混合振蕩和孵育，完后滴加DAB試劑顯色，用紫外凝膠共聚成像系統(tǒng)掃描觀察和攝像，把目的蛋白表達(dá)水平與GAPDH水平在同一張膜上比較后擬合繪圖和定量。Cav1.2定量方法是將目的條帶與內(nèi)參條帶積分吸光度(IA)值比較得出相對(duì)IA值作為Cav1.2的表達(dá)水平[9]。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

符合正態(tài)分布和方差齊性的計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間均數(shù)的比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用百分比表示，組間比較采用2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析用Pearson相關(guān)系數(shù)(r)法；統(tǒng)計(jì)分析用Origin 6.0軟件完成。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 兩組LA的MAP變化

與青齡LA組比較，老齡LA組dv/dtmax和Pla-teau顯著降低(P<0.01)，APD30和APD50明顯縮短(P<0.05)，APD90顯著延長(zhǎng)(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 兩組LA MAP主要參數(shù)的比較

*P<0.05,**P<0.01vsyoung LA group.

2 兩組LA誘發(fā)房性心律失常比較

與青齡LA組比較，老齡LA組被誘發(fā)房性心律失常的誘發(fā)率明顯增高，持續(xù)時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.01)。從同步記錄體表心電圖和MAP發(fā)現(xiàn)，青齡LA組只有較少標(biāo)本被誘發(fā)房性早搏或短陣心動(dòng)過(guò)速，且很快轉(zhuǎn)為正常竇性心律，MAP上表現(xiàn)為短陣自發(fā)性局部觸發(fā)電活動(dòng)(4 s)；而老齡LA組家兔很容易被誘發(fā)陣發(fā)性AF，MAP上表現(xiàn)為觸發(fā)性異位電活動(dòng)，且持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間(16 s)后，才自行轉(zhuǎn)為竇性心律及形態(tài)規(guī)整的MAP，見(jiàn)圖1、表2。

Figure 1.The changes of induced atrial arrhythmias and trigger activity with brust-pacing in young (A) and aged (B) LA groups.

圖1 兩組LA經(jīng)burst-pacing誘發(fā)房性心律失常及其觸發(fā)電活動(dòng)的變化

表2 兩組LA在burst-pacing刺激下誘發(fā)房性心律失常的比較

*P<0.05,**P<0.01vsyoung LA group.

3 兩組LA心肌細(xì)胞ICa,L及其I-V曲線(xiàn)的比較

在電壓鉗制方式下，青齡和老齡LA細(xì)胞ICa,L隨鉗制電壓的增加而增加，在+20 mV左右達(dá)到最大值，隨后出現(xiàn)反轉(zhuǎn)并減小。與青齡LA組比較，老齡LA組ICa,L在各鉗制電壓下均明顯減少，當(dāng)鉗制電壓為+20 mV時(shí)，老齡LA細(xì)胞ICa,L最大密度由青齡LA的(11.72±1.39) pA/pF減少為(6.08±0.98) pA/pF(P<0.01)。相同的結(jié)果從擬合I-V曲線(xiàn)也能發(fā)現(xiàn)，老齡LA組ICa,L的I-V曲線(xiàn)明顯抬高于青齡LA組，兩者最大電流密度在+20 mV左右，I-V曲線(xiàn)的整個(gè)形態(tài)和峰值方向均沒(méi)有發(fā)生明顯變化，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The difference ofICa,L(A) and current-voltage curve (B) in the myocytes of young and aged LA group. Mean±SD.n=12.

圖2 兩組LA細(xì)胞的ICa,L及其I-V曲線(xiàn)比較

4 兩組LA組織形態(tài)學(xué)特征的變化

如圖3所示，與青齡LA組比較，老齡LA組中被染成藍(lán)色的膠原纖維明顯增多，膠原纖維之間的心房肌組織排列不規(guī)則，被條狀的結(jié)締組織分開(kāi)，部分心房肌細(xì)胞成簇狀或島狀散落于結(jié)締組織中；老齡LA組織膠原蛋白的CVF顯著增加(P<0.01)。觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，青齡LA組細(xì)胞核染色質(zhì)分布均勻，周?chē)g隙寬大，空曠，布有大量排列規(guī)整線(xiàn)粒體，線(xiàn)粒體帶有厚實(shí)、緊密的嵴；肌小節(jié)排列有序、稠密，相互間布有一些糖原顆粒。老齡LA組細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)分布不均，集中在核膜周邊，周?chē)g隙變小，充斥著少量排列雜亂線(xiàn)粒體，線(xiàn)粒體形狀特異、腫脹并帶有蓬松嵴，有些出現(xiàn)空泡；肌小節(jié)稀疏增寬，少許甚至斷裂。

5 兩組Cav1.2定量表達(dá)及與ICa,L相關(guān)性比較

如圖4所示，青齡LA組心房肌細(xì)胞Cav1.2電泳條帶明顯變濃變粗，老齡LA組則顯著變淡變窄；與青齡LA組比較，老齡LA組Cav1.2相對(duì)IA值明顯減小(P<0.01)。從兩組LA的Cav1.2表達(dá)量與對(duì)應(yīng)各組ICa,L密度進(jìn)行相關(guān)性比較發(fā)現(xiàn)，青齡LA組Cav1.2表達(dá)量與ICa,L密度呈顯著正相關(guān)(r=0.87，P<0.01)；老齡LA組Cav1.2含量與ICa,L密度亦呈顯著正相關(guān)(r=0.83，P<0.01)。

討 論

AF是最普遍常見(jiàn)心律失常，隨著年齡增加，它在人群中的發(fā)病率和死亡率也逐漸增加，在超過(guò)65歲人口中，發(fā)生AF超過(guò)5%，同時(shí)左心房組織又是好發(fā)AF主要場(chǎng)所，在AF啟動(dòng)和維持中有特別意義，當(dāng)合并老齡化病理生理特征改變，這種誘發(fā)AF發(fā)生率更高，追根求源，是老齡LA電生理和組織結(jié)構(gòu)不同于成年人群而發(fā)生了明顯電和結(jié)構(gòu)重構(gòu)[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，老齡LA動(dòng)作電位的dv/dtmax和Plateau嚴(yán)重降低，APD30和APD50明顯縮短，APD90顯著延長(zhǎng)，說(shuō)明老齡LA電生理特征發(fā)生了明顯電重構(gòu)，表現(xiàn)在動(dòng)作電位形成和下傳放緩、受抑制或間斷；dv/dtmax和Plateau降低可能引起左心房舒張間期更寬的時(shí)間窗口，減緩電壓依賴(lài)性復(fù)極化K+電流激活，引起老齡LA有更多逐步延長(zhǎng)3相復(fù)極化電位[11]，即本實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察到的APD90顯著延長(zhǎng)，而這種異常電生理特征為折返性房性心律失常發(fā)生提供了條件和途徑，使得老齡LA對(duì)AF的發(fā)生具有顯著的易感性[12]，從而在額外刺激下，老齡LA非常容易誘發(fā)房性心律失常。本實(shí)驗(yàn)老齡LA在遭受激烈電刺激時(shí)，很容易被誘發(fā)出陣發(fā)性AF，且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，很難轉(zhuǎn)為竇性心律。進(jìn)一步表明老齡LA電活動(dòng)具有非常不穩(wěn)定性，間斷性，不利于正常電沖動(dòng)按順序傳導(dǎo)，從而易于誘發(fā)AF[13]。

Figure 3.Alterations of the morphological characteristics. A: Massion staining (×400) and collagen volume fraction in young and aged LA groups; B: ultrastructure in young and aged LA groups. Mean±SD.n=5.**P<0.01vsyoung LA group.

圖3 兩組形態(tài)學(xué)特征變化的比較

Figure 4.The protein expression levels of Cav1.2 in the myocytes of young and aged LA groups. Mean±SD.n=5.**P<0.01vsyoung LA group.

圖4 Cav1.2在青年和老齡LA組中的表達(dá)

決定老齡LA動(dòng)作電位Plateau下降、APD30和APD50縮短的機(jī)制可能與去極化ICa,L減小有關(guān)[14-15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦提示，老齡LA細(xì)胞的ICa,L明顯減小，I-V曲線(xiàn)顯著上抬，說(shuō)明老齡LA在隨著歲月變遷后，經(jīng)心房肌細(xì)胞膜上L型鈣通道產(chǎn)生的鈣電流在變小，開(kāi)放數(shù)量、速度在減弱，允許細(xì)胞外Ca2+通過(guò)ICa,L進(jìn)入胞漿內(nèi)數(shù)量減少，使得心房肌細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i降低，從而調(diào)動(dòng)肌漿網(wǎng)鈣池中儲(chǔ)備的Ca2+釋放于胞漿，引起Ca2+觸發(fā)的Ca2+釋放，造成心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，產(chǎn)生Ca2+振蕩，引起觸發(fā)性早期和/或延遲后除極，即局灶性異位房性心律失常，所以老齡LA心肌細(xì)胞ICa,L下降可能是增加老齡化 AF易感性的電生理基礎(chǔ)[16]。

與成年哺乳動(dòng)物左心房不同，老齡化哺乳動(dòng)物左心房隨著年齡增加，組織結(jié)構(gòu)發(fā)生退行性改變，即結(jié)構(gòu)重構(gòu)，表現(xiàn)在老齡LA結(jié)締組織本身和分布改變[17]。本研究結(jié)果提示，老齡LA組織中膠原纖維明顯增多、增粗，膠原纖維之間的心房肌組織排列不規(guī)則，部分心房肌細(xì)胞成簇狀或島狀散落于間質(zhì)纖維化中；定量分析發(fā)現(xiàn)老齡LA組織中膠原蛋白含量顯著增加。所以老齡LA細(xì)胞之間相互偶聯(lián)程度減少，其接受期前刺激產(chǎn)生動(dòng)作電位在下傳過(guò)程中因形成動(dòng)作電位平臺(tái)期的最大膜去極化ICa,L減小，以及阻礙動(dòng)作電位傳導(dǎo)的阻抗增加，引起動(dòng)作電位傳導(dǎo)減慢、減弱和/或間斷,使得老齡LA結(jié)構(gòu)改變成為折返性房性心律失常發(fā)生病理基礎(chǔ)，其實(shí)質(zhì)是老齡LA細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，體現(xiàn)在心房肌細(xì)胞核松散異形，線(xiàn)粒體減少、蓬松和空泡，肌小節(jié)稀疏增寬，甚至斷裂。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，老齡LA結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著的重構(gòu)，從而為AF啟動(dòng)和維持提供了病理解剖基礎(chǔ)，增加了老齡化AF發(fā)生易損性，其病理機(jī)制可能與老齡LA心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)退行性改變密切相關(guān)[18]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，老齡LA肌細(xì)胞膜上Cav1.2表達(dá)水平顯著降低，并且與老齡LA肌細(xì)胞ICa,L減少具有明顯正相關(guān)性[19]。Cav1.2是Ca2+通道蛋白形成中最重要的多肽亞單位，調(diào)控著Ca2+流動(dòng)，擔(dān)負(fù)著電壓依賴(lài)性Ca2+通道開(kāi)放，選擇性允許Ca2+進(jìn)出細(xì)胞內(nèi)外。老齡LA心肌細(xì)胞膜上Cav1.2表達(dá)水平下降，一方面提示老齡LA心肌細(xì)胞ICa,L減小，I-V曲線(xiàn)上抬可能來(lái)自于細(xì)胞膜上Cav1.2表達(dá)水平下調(diào)；另一方面，可能暗示著老齡LA心肌細(xì)胞數(shù)量減少和/或細(xì)胞形態(tài)、體積以及質(zhì)量下降。因此，隨著哺乳動(dòng)物老齡化增加，心房中Cav1.2表達(dá)水平將會(huì)逐漸較少，最終導(dǎo)致電活動(dòng)生理功能進(jìn)行性減弱，引起動(dòng)作電位形成和傳遞受抑制，細(xì)胞膜上離子通道的密度和分布逐漸較少，心房肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生代償性損傷[20]?？傊?，老齡LA電生理和組織結(jié)構(gòu)病理生理特征性改變?yōu)锳F發(fā)生提供了易感性；而動(dòng)作電位圖形改變，膠原纖維增加，ICa,L減小，超微結(jié)構(gòu)改變?yōu)锳F發(fā)生提供了易損性[21]。對(duì)老齡LA電重構(gòu)、結(jié)構(gòu)重構(gòu)以及蛋白表達(dá)水平認(rèn)識(shí)，并對(duì)其易于誘發(fā)AF機(jī)制加以探討，利于臨床在診治老齡化AF發(fā)生中正確認(rèn)識(shí)其發(fā)病基礎(chǔ)、選擇藥物和采取預(yù)防措施。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effects of cardiac remodeling on atrial arrhythmogenesis in aged rabbit left atrium

WANG Teng, CHEN Yu-ting, CAO Hong, HUANG Yan, LIU Tao, ZOU Qiang

(DepartmentofCardiology,RenminHospitalofWuhanUniversity,CardiovascularResearchInstituteofWuhanUniversity,Wuhan430060,China.E-mail:wangteng@whu.edu.cn)

AIM: To investigate the effects of myocardial remodeling of aged left atrium (LA) on atrial arrhythmogenesis in rabbits. METHODS:The male New Zealand rabbits were divided into young LA and aged LA groups. By observing the changes of monophasic action potential (MAP) and burst-pacing in LA of the rabbitsinvivo, the main cardioelectrophysiological parameters such as resting membrane potential (RMP), action potential amplitude (APA), ma-ximum rise veloctiy of action potential (dv/dtmax), plateau potential and action potential duration at 30%, 50% and 90% (APD30, APD50and APD90), as well as the inducibility and duration of atrial arrhythmias were recorded. L-type calcium current (ICa,L) was analyzed via whole-cell patch-clamp technique in enzymatically dissociated single rabbit LA myocytes. The myocardial collagen content was quantified after Masson staining, and the ultrastructure of the LA cells was observed under scanning electron microscope. The expression of Cav1.2 in LA tissue of the 2 groups was detected by Western blot. RESULTS: Compared with young LA group, dv/dtmaxand plateau potential were significantly decreased, APD30and APD50were shortened, and APD90was notably prolongated in aged LA group (P<0.01). The inducibility or duration of atrial arrhythmias was severely increased or prolongated in aged LA group (P<0.01). With voltage clamp model, the density ofICa,Lin aged LA group was significantly decreased, and current-voltage curve was notably moved upward compared with young LA group. When the clamp potential was +20 mV, the density ofICa,Lwas notably modified from (11.72±1.39) pA/pF in young LA group to (6.08±0.98) pA/pF in aged LA group (P<0.01). Compared with young LA group, the protein level of collagen was significantly increased (P<0.01), and the arrange of atrial myocytes was irregular in LA of rabbits in aged LA group. The atrial myocytes of the LA wall in aged LA group exhibited abnormal ultrastructural alterations, such as karyopyknosis, irregular and swelling mitochondria with the presence of vacuoles, and mild and severe sarcomere degeneration. Compared with those in LA tissues of young rabbits, the expression levels of Cav1.2 in the LA tissues of aged rabbits were severely reduced (P<0.01), and had a significant positive correlation with the reduction ofICa,L(r=0.83,P<0.01). CONCLUSION: The pathophysiological characteristics of aged LA are significantly altered, and might contribute to vulnerability and susceptibility of occurrence of atrial fibillation in aged rabbits. The mechanisms might completely attribute to the notable reduction ofICa,L, abnormal alterations of ultrastructures and obvious decrease in the expression of Cav1.2 in the aged LA of aged rabbits.

Aged left atrium; Myocardial remodeling; Ca2+channels; Atrial arrhythmogenesis

1000- 4718(2017)02- 0244- 07

2016- 09- 07

2016- 11- 21

湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2011CDB504)；湖北省衛(wèi)計(jì)委科研基金資助項(xiàng)目(No.JX6B67； No. WJ2015MB088)

R541.7+5； R592； R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.02.009

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△通訊作者 Tel: 027-88041911; E-mail: wangteng@whu.edu.cn