• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    豬ITGB-5基因外顯子多態(tài)性及其與仔豬腹瀉的關(guān)聯(lián)性研究

    2016-06-30 01:24:25牛曉艷山西省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所山西太原030032
    甘肅畜牧獸醫(yī) 2016年6期
    關(guān)鍵詞:酶切位點整合素外顯子

    牛曉艷(山西省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所,山西 太原 030032)

    ?

    豬ITGB-5基因外顯子多態(tài)性及其與仔豬腹瀉的關(guān)聯(lián)性研究

    牛曉艷
    (山西省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所,山西 太原 030032)

    摘 要:采用PCR—測序的方法對豬ITGB-5基因所有17個外顯子進行擴增測序,經(jīng)多重比對后找到該基因內(nèi)的SNPs。對該基因外顯子內(nèi)所有SNPs進行Snap-shot分型并與黏附表型進行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明:ITGB-5外顯子內(nèi)共發(fā)現(xiàn)10個SNPs,其中有3個SNPs關(guān)聯(lián)分析結(jié)果呈現(xiàn)顯著,分別位于該基因的5號及13號外顯子。結(jié)合該基因的生物學功能以及本試驗的結(jié)果表明:ITGB-5可能是與仔豬腹瀉相關(guān)的基因。

    關(guān)鍵詞:仔豬腹瀉;ITGB-5基因;Snap-shot分型;關(guān)聯(lián)分析

    仔豬腹瀉是導致畜牧業(yè)損失的重要原因之一,由于仔豬腹瀉造成的損失占到畜牧業(yè)總產(chǎn)值的20%左右,腹瀉造成的死亡占仔豬總死亡數(shù)的40%左右。仔豬腹瀉常常導致飼料報酬率下降,生長發(fā)育遲緩,產(chǎn)生僵豬等。在所有腹瀉當中,由ETEC(產(chǎn)腸毒素大腸桿菌)引起的腹瀉是最為常見的一種,這種腹瀉發(fā)生的機理是以大腸桿菌和宿主小腸上皮細胞的黏附為前提,所以可以表達受體蛋白的個體為易感個體,不表達受體蛋白的個體為抗性個體。根據(jù)大腸桿菌表達菌毛的種類,又分為F4ab,F(xiàn)4ac和F4ad三種類型。ETEC粘附于豬小腸上皮細胞后,釋放毒素,導致腸道內(nèi)電解質(zhì)平衡紊亂,從而導致腹瀉。

    豬ITGB-5基因位于豬13號染色體31q41區(qū)段。ITGB-5屬于整合素家族成員,編碼細胞表面糖蛋白,主要功能是參與免疫細胞的黏附作用。該基因在生物進程中具有多種功能,包括細胞生長和創(chuàng)傷修復時的細胞遷移,細胞變異和細胞凋亡,調(diào)節(jié)潛在的一些腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和癌細胞的擴散等。ITGB-5通常以二聚體的形式存在,包括α和β亞基,該異二聚體優(yōu)先結(jié)合在細胞黏附分子上,構(gòu)成細胞外基質(zhì)的成分。該基因已經(jīng)徐如海[1]等經(jīng)抑制消減雜交篩選技術(shù)而得到,可作為研究仔豬腹瀉的候選基因之一。

    本研究基于PCR-測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)豬ITGB-5基因外顯子的SNPs,通過Snap-shot技術(shù)對該基因所有外顯子內(nèi)的SNPs進行分型,再經(jīng)卡方檢驗獲得其與黏附表型之間的關(guān)聯(lián)性。為進一步研究該基因和仔豬腹瀉之間的關(guān)系提供實驗依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1實驗材料

    1.1.1試驗動物 試驗所采用的動物個體來源于中國農(nóng)科院畜牧所。是由大白,長白和松黑三個品種所組成的群體,該群體為兩代半同胞家系,包括366頭子代和77頭父母代個體。根據(jù)黏附表型,選取6頭黏附個體(case:Y)以及6頭非黏附個體(control:NY)作為測序反應(yīng)的試驗樣本,case組與control組之間無親緣關(guān)系。

    1.1.2試驗試劑 PCR引物購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司;超純dNTP,PCR反應(yīng)Buffer(10X),Taq酶,Marker DL2000,6X上樣緩沖液均購自Invitrogen公司;雙蒸水,II型瓊脂糖為實驗室自備。

    SNP基因型分型:Snapshot委托上海捷瑞生物公司進行。

    用于測量黏附表型的菌株分別為:195(F4ab,C83901,O8;K87,豬源),200(F4ac,C83907,O149:K91,豬源),216(F4ad,C83923,O8:K87,豬源),238(C83286,O38:K99,牛源,陰性對照菌)。以上菌株均購自中國獸藥監(jiān)察所。

    1.1.3引物設(shè)計 通過軟件Primer 3.0對ITGB-5基因的外顯子區(qū)域進行在線引物設(shè)計,用于PCR反應(yīng)的引物如下表所示:

    表1 ITGB-5引物序列

    1.2試驗方法

    1.2.1黏附表型測定 三個品種小腸上皮細胞與大腸桿菌菌毛之間的黏附情況通過顯微鏡觀察后記錄[2]。根據(jù)小腸上皮細胞吸附大腸桿菌的個數(shù),分為黏附(Y)和非黏附(NY)兩種類型。

    黏附標準采用單個小腸上皮細胞:黏附多于5個細菌為黏附。

    1.2.2DNA提取 取大小為1 g的耳組織樣本,放入Eppendorf管中剪碎。耳組織DNA提取過程采用《分子克隆試驗指南》中所提供的酚-氯仿法[3],提取獲得的DNA用雙蒸水溶解后,將樣品在50 ℃下放置1小時,滅DNA酶。

    1.2.3PCR反應(yīng)體系和條件 PCR反應(yīng)體系:DNA模板(50~75 ng/ul):1.5 ul;上游引物(10 μmol/L):0.5 ul,下游引(10 μmol/L):0.5 ul;dNTP(10 μmol/L):1.6 ul;Buffer:2.0 ul;Taq酶(5 U/ul):0.4 ul;ddH2O:14.1~14.6 ul。

    PCR反應(yīng)條件:94 ℃預變性5 min,94 ℃預變性30 s,55 ℃~65 ℃退火30~45 s,72 ℃延伸30~45 s,72 ℃終末延伸7 min~10 min,20 ℃保存。

    1.2.4測序比對 將PCR產(chǎn)物收集后送至北京三博遠志公司進行測序分析。測序結(jié)果用Chromas軟件判讀。部分片段(F1,F(xiàn)3,F(xiàn)6,F(xiàn)9)由于片段內(nèi)存在高GC含量的區(qū)域(在70%以上),普通測序反應(yīng)無法實現(xiàn),采用克隆測序的方法進行。

    質(zhì)粒小提:質(zhì)粒小提采用試劑盒進行。

    克隆測序:將PCR產(chǎn)物切膠回收后與T-easy載體連接,并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞,將培養(yǎng)獲得的陽性菌落送公司進行克隆測序。

    測序結(jié)束后將所獲得的試驗個體各外顯子的序列采用DNAMAN進行多序列比對,獲得各外顯子內(nèi)SNPs和片段缺失的信息。

    1.2.5Snapshot分型

    對選定區(qū)段的DNA擴增樣本進行混池后采用多重PCR進行分型。加入熒光染料后,在ABI3730核酸檢測儀上進行測序分析,收集熒光信號,并對分型結(jié)果進行總結(jié)。

    1.3統(tǒng)計分析

    統(tǒng)計F4ab和F4ac黏附(Y)以及非黏附(NY)個體在群體內(nèi)的基因型頻率。對各SNPs在群體中進行卡方檢驗,檢驗統(tǒng)計量為:自由度df=k-1,即自由度df=3+3-1=5,經(jīng)檢驗獲得ITGB-5內(nèi)顯著的SNPs。

    2 實驗結(jié)果

    2.1黏附表型檢測

    經(jīng)顯微鏡觀察,得到兩組個體的體外黏附結(jié)果,如表2所示:

    表2 Case-control設(shè)計所選擇的樣本

    2.2測序結(jié)果

    2.2.1ITGB-5基因各外顯子內(nèi)的突變 對ITGB-5進行測序后結(jié)果如下表所示:

    由測序結(jié)果可以看出,在ITGB-5基因的5號,6號,7號以及11,13,16號和17號外顯子內(nèi),均發(fā)現(xiàn)一些SNPs,在17號外顯子內(nèi)還發(fā)現(xiàn)了一個SEXA1的酶切位點。

    表3 ITGB-5外顯子測序結(jié)果

    2.2.2酶切位點 通過在線的分子生物學軟件(http://rna.Lundberg.gu.se/cuttter2/)對ITGB-5基因外顯子進行酶切位點預測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),該基因外顯子5,6,7,11,13,16內(nèi)的突變位點為非酶切位點,而17號外顯子中存在酶切位點SEXAI。進一步分析這些酶切位點和黏附表型間的關(guān)系,檢測了7個黏附型個體和7個非黏附型個體,但這些個體的酶切基因型和黏附表型之間并沒有關(guān)聯(lián)關(guān)系,所以認為試驗檢測到的酶切位點并非因果突變。

    在第17號外顯子中存在SEXA1酶切位點,其PCR和酶切結(jié)果如下圖所示,酶切序列(5'…A/ CCWGGT…3'/3'…TGGWCC/A…5'),經(jīng)分析,這個突變不是影響基因功能的突 變:

    圖1 ITGB-5基因17號外顯子SEXA1酶切位點

    2.3ITGB-5外顯子內(nèi)SNPs的卡方檢驗結(jié)果

    采用卡方檢驗的方法對ITGB-5內(nèi)所發(fā)現(xiàn)的9個SNPs進行分析,取顯著性閾值X2(5)0.05=11.07,X2(5)0.01= 15.09??ǚ綑z驗結(jié)果如表4所示。

    表4 對于ITGB-5內(nèi)各SNPs的卡方檢驗結(jié)果

    由卡方檢驗結(jié)果可知:F4ac檢驗結(jié)果均不顯著,F(xiàn)4ab號外顯子的2個SNPs與黏附表型存在顯著關(guān)聯(lián)(P<0.05),13號外顯子的1個SNP與F4ab黏附表型存在極顯著關(guān)聯(lián)(P<0.01)。但這些突變與腹瀉之間的關(guān)系,還需要進一步的基因功能驗證。

    3 討論

    3.1ITGB-5可能是導致黏附的候選基因

    ITGB-5蛋白由α和β兩個亞基組成,這兩個亞基在宿主細胞表面表達,該蛋白是由整合素所編碼的,玻璃體蛋白Vn可以和整合素的β亞基結(jié)合,而大腸桿菌又可以和Vn結(jié)合,它們共同構(gòu)成復合體通過小腸上皮細胞侵入宿主細胞,形成包涵體的形式。在這個過程中,整合素發(fā)揮了重要的橋梁作用。

    ITGB-5在細胞內(nèi)具有多重功能,該蛋白屬于跨膜蛋白家族成員,可以和RGD序列相結(jié)合。該序列是整合素蛋白所特有的序列,包含了一系列的氨基酸序列,整合素屬于跨膜受體,可以結(jié)合在RGD氨基酸的多肽當中。整合素介導了細胞分化,遷移,擴增,形態(tài)改變以及細胞死亡過程。與整合素結(jié)合的配體氨基酸包括Arg-Gly-Asp序列,這個序列可以通過整合素蛋白進行識別,而該蛋白是RGD依賴的蛋白,該整合素蛋白是B3整合素家族的成員。Maki ISHII等檢測了整合素家族的兩個成員在小鼠性腺細胞中的表達模式,并認為它們和該基因中的RGD序列有關(guān),該研究檢測了ITGB-5在不同日齡,主要是10.5~13.5天內(nèi)的表達模式,結(jié)果表明該基因在性腺細胞中廣泛表達[4]。R.Pasqualini等研究了ITGB-5在不同組織中的表達模式,也證明了ITGB-5與器官發(fā)育,炎癥,組織修復以及細胞的穩(wěn)態(tài)維持有關(guān),黏附過程是通過玻璃體蛋白以及纖維蛋白所介導的[5,6]。上述這些研究都說明了ITGB-5在細菌侵入細胞過程中的介導作用,但除此之外,ITGB-5還具有信號轉(zhuǎn)導等一系列功能。通過對該基因外顯子序列的測序分析發(fā)現(xiàn)了9個SNPs,其中5號外顯子內(nèi)的2個SNPs和13號外顯子內(nèi)的1個SNPs與黏附表型存在顯著關(guān)聯(lián)。

    ITGB-5和MUC4具有相似的結(jié)構(gòu)、基因大小和功能,并在染色體上處于相近位置[7]。但對于它們的功能以及黏附表型與腹瀉關(guān)系的研究還停留在基本的統(tǒng)計分析階段,并不能真正的揭示其與腹瀉的關(guān)系。

    圖5 Vn與整合素結(jié)合,侵染宿主細胞的過程

    3.2與腹瀉有關(guān)的其他基因

    黏液素家族成員(MUC4,MUC13,MUC20)等是細胞膜上表達的蛋白,Jorgensen等2003,2006年所發(fā)表的文章中認為MUC4是導致黏附以及腹瀉的重要候選基因,該基因7號內(nèi)含子中存在一個XbaI的酶切位點,通過RFLP,在相關(guān)群體中得到驗證,并在表型為黏附及非黏附的個體中進行關(guān)聯(lián)分析,該關(guān)聯(lián)分析可以得到基本吻合的結(jié)果[8]。該突變被認為是一個可能的分子標記并在2004年申請了專利。但MUC4本身屬于一個多能性基因,在消化道表面表達,形成黏液,該基因所表達的蛋白可以形成屏障,防止病原微生物侵入消化道。除此之外,該基因還具有多種功能,并與胰腺癌的發(fā)生有關(guān),在人類中,該基因的mRNA具有多個轉(zhuǎn)錄本。而黏液素家族的系列基因MUC13,MUC20等都具有類似功能。MUC4位于消化道和呼吸道的內(nèi)表面,一般由消化道和呼吸道內(nèi)表面的腺體所分泌,它可以維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)以及維持細胞的生存。其結(jié)構(gòu)和生化組成可以為細胞表面提供保護并且使細胞處于穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境中,不僅如此,MUC4還可以防止細胞的癌變[9]。

    對于MUC13和MUC20,國內(nèi)黃路生等對該基因cDNA序列內(nèi)所存在的突變進行了測序研究。并在MUC13 2 679 bp的cDNA序列內(nèi)發(fā)現(xiàn)三個突變(c.576C>T,c.908C>G,c.935A>C)。并且比較了豬和人該基因序列的差異,對于550 bp的cDNA進行了純化以及擴增的過程,并通過3'以及5'RACE,獲得該基因的全長以及基因內(nèi)部的各個功能元件。并通過UTRSCAN尋找該基因內(nèi)部的SNPs。通過RTPCR,檢測了該基因在不同組織中的表達情況,并且在黏附以及非黏附兩組個體中找到位于外顯子內(nèi)的多態(tài)(SNPs)以及進行傳遞不平衡研究(TDT)[10]。

    對于MUC20,該研究小組也對該基因內(nèi)的多態(tài)進行了研究,研究方法與MUC20相似,通過擴增得到該基因全長的mRNA,在ORF處鑒別出兩個18 bp片段的缺失,該區(qū)段包含一個1 527 bp的開放閱讀框,并編碼532個氨基酸。RT-PCR分析表明,該基因在腎臟,前列腺,上皮以及膀胱中的表達量最高。SNP分析顯示,該基因內(nèi)存在7個多態(tài),分別是內(nèi)含子5中g(shù).191C>T,以及外顯子6中c.1 600C>T,通過TDT分析可以得到這兩個多態(tài)與黏附表型之間存在顯著的關(guān)聯(lián)關(guān)系[11]。

    4 結(jié)論

    上述研究通過對ITGB-5基因外顯子的測序和突變分析,在基因的外顯子部分區(qū)段(外顯子5,6,7 和11,13,16和17)檢測得到突變,其中17號外顯子350 bp處存在SEXAI酶切位點。通過Snap-shot分型后發(fā)現(xiàn)3個SNPs與F4ab的黏附表型之間具有顯著關(guān)聯(lián),但這些突變是否是與仔豬腹瀉相關(guān)的因果突變,還有待進一步試驗證實。從生物學功能上分析,ITGB-5很可能是影響?zhàn)じ降暮蜻x基因。本研究為從分子水平研究仔豬腹瀉的機制提供試驗依據(jù)。

    參考文獻:

    [1]徐如海,胡錦平,翁經(jīng)強等.抑制消減雜交篩選仔豬ETEC K88ab/ac受體候選基因[C].中國動物遺傳育種研究進展——第十五次全國動物遺傳育種學術(shù)討論會論文集.

    [2]李玉華.仔豬大腸桿菌F4受體基因的精細定位.2006博士學位論文.

    [3]J.薩姆布魯克,D.W.拉塞爾著.[M].分子克隆實驗指南,科學出版社.2003年.

    [4]Maki I,T.W.Tay,Masamichi K et.al.Expression parttern of avB3 and avB5 Integrin mrna in mouse fetal gonads.[J]. Journal of Reproduction and development.Vol 52,No 3.2006.

    [5]Pasqualini.R,Bodorova J,Ye S et.al.A study of the structure,function and distribution of B5 integrins using novel anti-B5 monoclonal antibodies.[J].Journal of Cell Science 105,101-111,1993.

    [6]Memmo.L.M & McKeown-Longo.P.The alpha v beta 5 integrin functions as an endocytic receptor for vitronecin.[J].Cell Sci.111,425-433.1998.

    [7]Antonio R,Jacoben M.J.,Joller D.et.al.The receptor locus for Escherichia coli F4ab/F4ac in the pig maps distal to the MUC4-LMLN region.[J].Mammalian Genome.Nov.2010.

    [8]Jorgensen C.B.,Cirera S.,Anderson S.I.et.al.Linkage and comparative mapping of the locus controlling susceptibility towards E.coli F4ab/ac Diarrhoea in pigs.[J].Cytogenetic Genome Research.102:157-162,2003.

    [9]Hollingsworth M.A.and Swanson B.J.Mucins in cancer:protection and control of the cell surface.[J].Nature.Review Cancer.Jan.Vol.4.45-57.2004.

    [10]Zhang B,Ren J & Huang H.Investigation of the porcine MUC13 gene:isolation,expression,polymorphisms and strong association with susceptibility to E.coli F4ab/ac.[J].Animal Genetics.June.Vol 39(3):258-266,2008. [11]M.Schroyen,E.Cox and N.Buys.Susceptibility of piglets to ETEC is not related to the expression of MUC13 and MUC20.[J]Animal Genetics.April 4,2011.

    (編輯:晏兵兵)

    中圖分類號:S828

    文獻標識碼:B

    文章編號:1006-799X(2016)06-0089-04

    作者簡介:牛曉艷(1984-),女,山西太原人,助理研究員,主要從事海貍色獺兔育種工作。

    猜你喜歡
    酶切位點整合素外顯子
    外顯子跳躍模式中組蛋白修飾的組合模式分析
    基于兩種質(zhì)譜技術(shù)檢測蛋白酶酶切位點的方法
    外顯子組測序助力產(chǎn)前診斷胎兒骨骼發(fā)育不良
    環(huán)狀定點誘變技術(shù)在載體構(gòu)建中的應(yīng)用
    整合素α7與腫瘤關(guān)系的研究進展
    2019新型冠狀病毒S蛋白可能存在Furin蛋白酶切位點
    生物信息學(2020年2期)2020-07-09 01:27:56
    外顯子組測序助力產(chǎn)前診斷胎兒骨骼發(fā)育不良
    酶切型穩(wěn)定同位素標記肽段為內(nèi)標用于藥物代謝酶的絕對定量分析
    分析化學(2015年10期)2015-11-03 07:38:01
    整合素αvβ6和JunB在口腔鱗癌組織中的表達及其臨床意義
    人類組成型和可變外顯子的密碼子偏性及聚類分析
    成年av动漫网址| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 国产伦理片在线播放av一区| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产永久视频网站| 3wmmmm亚洲av在线观看| 高清av免费在线| 日本av手机在线免费观看| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 在现免费观看毛片| 中文字幕制服av| 老女人水多毛片| 国产色爽女视频免费观看| 久久久精品免费免费高清| 国产有黄有色有爽视频| 午夜福利网站1000一区二区三区| 两个人的视频大全免费| 亚洲av.av天堂| 视频区图区小说| 亚洲av男天堂| 观看美女的网站| 婷婷色综合www| 欧美丝袜亚洲另类| 久久婷婷青草| 色94色欧美一区二区| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲欧洲国产日韩| 午夜免费鲁丝| 亚洲精品第二区| av线在线观看网站| 国产精品.久久久| 一级,二级,三级黄色视频| av网站免费在线观看视频| 免费av不卡在线播放| 22中文网久久字幕| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 欧美少妇被猛烈插入视频| 一区二区三区四区激情视频| 九色亚洲精品在线播放| av在线老鸭窝| 亚洲经典国产精华液单| 街头女战士在线观看网站| 少妇丰满av| 日韩精品有码人妻一区| 久久影院123| 插阴视频在线观看视频| 老熟女久久久| 欧美+日韩+精品| 国产免费福利视频在线观看| 国产 一区精品| 中文精品一卡2卡3卡4更新| av国产精品久久久久影院| 女性被躁到高潮视频| 亚洲av不卡在线观看| kizo精华| 交换朋友夫妻互换小说| 日本wwww免费看| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲人与动物交配视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲经典国产精华液单| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 美女主播在线视频| 亚洲国产精品一区三区| 人妻人人澡人人爽人人| av线在线观看网站| 亚洲成色77777| 国产精品一国产av| av一本久久久久| 午夜福利影视在线免费观看| 高清在线视频一区二区三区| 久久久久久久久久久免费av| 国产熟女午夜一区二区三区 | 青春草国产在线视频| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 两个人免费观看高清视频| .国产精品久久| 18在线观看网站| 精品一区二区免费观看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 久久久久精品性色| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 欧美日本中文国产一区发布| 2022亚洲国产成人精品| 五月玫瑰六月丁香| 免费黄色在线免费观看| 人妻 亚洲 视频| 久久久国产精品麻豆| 99精国产麻豆久久婷婷| 桃花免费在线播放| 午夜91福利影院| 少妇熟女欧美另类| 国产午夜精品一二区理论片| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 视频区图区小说| 午夜免费鲁丝| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 欧美日韩精品成人综合77777| 欧美另类一区| 亚洲精品日本国产第一区| 国产精品久久久久久精品电影小说| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 黄色一级大片看看| 中文欧美无线码| 91久久精品国产一区二区三区| 高清欧美精品videossex| 免费黄网站久久成人精品| 亚洲欧美成人精品一区二区| 女人久久www免费人成看片| 国产精品国产三级专区第一集| 亚洲国产av影院在线观看| 视频中文字幕在线观看| 国产精品一二三区在线看| 男女无遮挡免费网站观看| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚州av有码| 国国产精品蜜臀av免费| 曰老女人黄片| 日韩视频在线欧美| 久久免费观看电影| a级毛片免费高清观看在线播放| 精品一区二区三区视频在线| 久久狼人影院| 人体艺术视频欧美日本| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 久久综合国产亚洲精品| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产成人精品一,二区| 久久久久久久久久久免费av| 亚洲综合色惰| 日韩伦理黄色片| 久久综合国产亚洲精品| 妹子高潮喷水视频| 精品少妇黑人巨大在线播放| 精品人妻偷拍中文字幕| 啦啦啦在线观看免费高清www| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 一区二区三区乱码不卡18| 亚洲av不卡在线观看| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 欧美一级a爱片免费观看看| 91成人精品电影| 免费看光身美女| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 久久久久久伊人网av| 一二三四中文在线观看免费高清| 成年av动漫网址| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 蜜臀久久99精品久久宅男| a级毛片免费高清观看在线播放| a级毛片黄视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 久久精品久久精品一区二区三区| 纯流量卡能插随身wifi吗| 中国美白少妇内射xxxbb| 视频在线观看一区二区三区| 亚洲国产精品一区三区| 丰满饥渴人妻一区二区三| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 国产白丝娇喘喷水9色精品| 街头女战士在线观看网站| 欧美另类一区| 日本黄色片子视频| 午夜福利,免费看| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 久久综合国产亚洲精品| 国产视频内射| av专区在线播放| 在线看a的网站| 亚洲精品乱久久久久久| 好男人视频免费观看在线| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产又色又爽无遮挡免| 免费人妻精品一区二区三区视频| 久久青草综合色| 国产黄色视频一区二区在线观看| 日韩在线高清观看一区二区三区| 一级,二级,三级黄色视频| 少妇的逼好多水| 亚洲av免费高清在线观看| videos熟女内射| 麻豆成人av视频| 制服诱惑二区| 亚洲色图综合在线观看| 18禁动态无遮挡网站| 中文字幕亚洲精品专区| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 大香蕉97超碰在线| 黄色欧美视频在线观看| 男的添女的下面高潮视频| 激情五月婷婷亚洲| 美女视频免费永久观看网站| 久久女婷五月综合色啪小说| 777米奇影视久久| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 99久久人妻综合| 国产在线视频一区二区| 一区二区av电影网| av不卡在线播放| 国产免费又黄又爽又色| 男的添女的下面高潮视频| 久久久精品94久久精品| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产精品一国产av| 在线观看免费高清a一片| 内地一区二区视频在线| 满18在线观看网站| 夫妻午夜视频| 在线观看www视频免费| 国产一区二区三区综合在线观看 | 一级毛片 在线播放| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 国产片内射在线| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 黄色一级大片看看| 有码 亚洲区| 最近的中文字幕免费完整| 亚洲欧美成人精品一区二区| 久久久久精品久久久久真实原创| a级毛片黄视频| h视频一区二区三区| 少妇被粗大猛烈的视频| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 男女无遮挡免费网站观看| 男女啪啪激烈高潮av片| 日韩成人av中文字幕在线观看| 亚洲av成人精品一区久久| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国国产精品蜜臀av免费| 欧美成人精品欧美一级黄| 欧美最新免费一区二区三区| 国产精品欧美亚洲77777| 高清欧美精品videossex| 中国美白少妇内射xxxbb| 久久精品国产自在天天线| 一区二区三区乱码不卡18| 一级爰片在线观看| 超色免费av| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 免费大片黄手机在线观看| 精品久久蜜臀av无| 国产日韩欧美视频二区| 国产精品.久久久| 亚州av有码| 一级黄片播放器| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲国产欧美在线一区| 麻豆乱淫一区二区| 国产高清不卡午夜福利| 最近最新中文字幕免费大全7| 曰老女人黄片| 国产成人午夜福利电影在线观看| 国产 一区精品| av国产久精品久网站免费入址| 成人二区视频| 亚洲国产日韩一区二区| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产成人av激情在线播放 | 制服丝袜香蕉在线| 国产综合精华液| 日韩视频在线欧美| 中文欧美无线码| 最后的刺客免费高清国语| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 免费看不卡的av| 日韩精品有码人妻一区| 国产精品久久久久成人av| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 欧美日韩视频精品一区| 国内精品宾馆在线| 久久亚洲国产成人精品v| 最近最新中文字幕免费大全7| av女优亚洲男人天堂| 97超碰精品成人国产| 人人妻人人澡人人看| 成年人午夜在线观看视频| 色5月婷婷丁香| 亚洲国产精品专区欧美| 国产日韩欧美视频二区| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 日韩成人av中文字幕在线观看| 老女人水多毛片| 国产黄频视频在线观看| 下体分泌物呈黄色| 女人久久www免费人成看片| 亚洲内射少妇av| 久久精品久久久久久久性| 久久免费观看电影| 国产成人a∨麻豆精品| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 在线看a的网站| 色视频在线一区二区三区| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产精品一国产av| 下体分泌物呈黄色| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 一级毛片电影观看| 国产日韩欧美亚洲二区| 国产国语露脸激情在线看| 国产精品一区www在线观看| av有码第一页| 亚洲av男天堂| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 两个人的视频大全免费| 一区二区三区免费毛片| 国产在线视频一区二区| 人人澡人人妻人| 午夜福利视频在线观看免费| 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲国产色片| 不卡视频在线观看欧美| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 亚洲欧美成人综合另类久久久| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 免费高清在线观看日韩| 午夜免费鲁丝| 国产日韩欧美在线精品| 少妇人妻久久综合中文| 欧美日韩av久久| 99国产精品免费福利视频| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲美女搞黄在线观看| 只有这里有精品99| 欧美日韩av久久| 大香蕉久久网| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 中文字幕制服av| 日韩av不卡免费在线播放| 国产成人免费无遮挡视频| 国产av一区二区精品久久| 只有这里有精品99| 人人澡人人妻人| 欧美97在线视频| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲精品国产色婷婷电影| 新久久久久国产一级毛片| 黄片无遮挡物在线观看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 久久久久久久久久成人| 精品久久久久久久久av| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产黄色免费在线视频| 亚洲av国产av综合av卡| 国产精品久久久久成人av| 色5月婷婷丁香| 在线观看三级黄色| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 久久99一区二区三区| 中文字幕av电影在线播放| 成人午夜精彩视频在线观看| xxx大片免费视频| 少妇精品久久久久久久| 高清av免费在线| 美女中出高潮动态图| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲丝袜综合中文字幕| 欧美另类一区| 99久久精品一区二区三区| 少妇的逼好多水| h视频一区二区三区| 亚洲欧洲日产国产| 熟女av电影| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 亚洲国产精品999| 成人影院久久| 国产伦理片在线播放av一区| 91在线精品国自产拍蜜月| 99re6热这里在线精品视频| 午夜免费鲁丝| 不卡视频在线观看欧美| 国产成人a∨麻豆精品| 久久女婷五月综合色啪小说| 一本大道久久a久久精品| 熟女电影av网| 亚洲综合精品二区| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国产精品久久久久久精品电影小说| 亚洲精品aⅴ在线观看| av电影中文网址| 亚洲中文av在线| 国产精品女同一区二区软件| 久久这里有精品视频免费| 亚洲伊人久久精品综合| 十八禁高潮呻吟视频| 精品久久久久久久久亚洲| 一边摸一边做爽爽视频免费| 人成视频在线观看免费观看| 免费观看性生交大片5| 看免费成人av毛片| 久久ye,这里只有精品| 青春草视频在线免费观看| 极品人妻少妇av视频| 亚洲av不卡在线观看| freevideosex欧美| 亚洲国产色片| 看免费成人av毛片| 国模一区二区三区四区视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 日本av手机在线免费观看| 日韩在线高清观看一区二区三区| 天堂8中文在线网| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| av免费在线看不卡| 亚洲av在线观看美女高潮| 欧美日韩精品成人综合77777| 免费日韩欧美在线观看| 婷婷色麻豆天堂久久| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 欧美最新免费一区二区三区| 黄色毛片三级朝国网站| www.av在线官网国产| 大片电影免费在线观看免费| 乱码一卡2卡4卡精品| 一区二区av电影网| 丝瓜视频免费看黄片| 最黄视频免费看| 亚洲精品第二区| 这个男人来自地球电影免费观看 | 考比视频在线观看| 一级二级三级毛片免费看| 一个人免费看片子| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产69精品久久久久777片| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 久久韩国三级中文字幕| 国产午夜精品一二区理论片| 国产高清国产精品国产三级| 人妻 亚洲 视频| 夫妻午夜视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说 | 国产精品久久久久成人av| 国产精品一区二区在线观看99| 黄色毛片三级朝国网站| 女人久久www免费人成看片| 亚洲欧美清纯卡通| 国产精品久久久久久久电影| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 91精品三级在线观看| 99九九线精品视频在线观看视频| 热99久久久久精品小说推荐| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 亚洲av.av天堂| videos熟女内射| 日日撸夜夜添| 自线自在国产av| 亚洲精品,欧美精品| 国产日韩欧美视频二区| 这个男人来自地球电影免费观看 | 综合色丁香网| av视频免费观看在线观看| 亚洲综合色网址| 黄色毛片三级朝国网站| 欧美精品高潮呻吟av久久| 亚洲av男天堂| 国产色爽女视频免费观看| 久久久午夜欧美精品| 久久精品久久久久久久性| 婷婷色麻豆天堂久久| 欧美xxxx性猛交bbbb| 欧美日韩成人在线一区二区| 三级国产精品片| 在线天堂最新版资源| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲精品久久成人aⅴ小说 | 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲av国产av综合av卡| 久久人人爽人人片av| 欧美最新免费一区二区三区| 搡老乐熟女国产| 国产一区有黄有色的免费视频| 一级毛片电影观看| 久久久欧美国产精品| 激情五月婷婷亚洲| 中国美白少妇内射xxxbb| 多毛熟女@视频| 日韩视频在线欧美| 91久久精品国产一区二区三区| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲国产精品一区三区| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 欧美xxⅹ黑人| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲精品aⅴ在线观看| 热99国产精品久久久久久7| 免费观看av网站的网址| 热99国产精品久久久久久7| 免费观看av网站的网址| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| av在线观看视频网站免费| 久久久精品区二区三区| 插逼视频在线观看| 美女cb高潮喷水在线观看| 人妻夜夜爽99麻豆av| 午夜福利影视在线免费观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 最后的刺客免费高清国语| 久久人妻熟女aⅴ| 亚洲av免费高清在线观看| 男女啪啪激烈高潮av片| 免费看av在线观看网站| 最新中文字幕久久久久| 乱码一卡2卡4卡精品| 99热网站在线观看| 亚洲av成人精品一区久久| 午夜久久久在线观看| 国产成人一区二区在线| 日日摸夜夜添夜夜爱| 久久精品人人爽人人爽视色| 国产国语露脸激情在线看| 成人综合一区亚洲| av天堂久久9| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产精品女同一区二区软件| 国产精品久久久久久久电影| 久久久久网色| 日韩人妻高清精品专区| 中文字幕免费在线视频6| 国产成人91sexporn| 91成人精品电影| 一区二区av电影网| 国产在线一区二区三区精| 一级毛片 在线播放| 亚洲三级黄色毛片| 国产高清国产精品国产三级| 欧美日本中文国产一区发布| 十分钟在线观看高清视频www| 午夜福利视频在线观看免费| 97超视频在线观看视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 观看av在线不卡| 亚洲不卡免费看| 最近最新中文字幕免费大全7| 久久久久久久亚洲中文字幕| av天堂久久9| www.av在线官网国产| 青青草视频在线视频观看| 看免费成人av毛片| 亚洲成人手机| av有码第一页| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产黄频视频在线观看| 久久久久久人妻| 国产成人免费观看mmmm| 免费少妇av软件| 久久久久人妻精品一区果冻| 免费大片黄手机在线观看| 性色avwww在线观看| 伊人亚洲综合成人网| 在线观看www视频免费| 大话2 男鬼变身卡| 久久精品国产亚洲网站| 99热国产这里只有精品6| 最近手机中文字幕大全| 日韩人妻高清精品专区| 飞空精品影院首页| 又大又黄又爽视频免费| 国产在线一区二区三区精| 搡老乐熟女国产| 性高湖久久久久久久久免费观看| 丰满少妇做爰视频| 男的添女的下面高潮视频| av卡一久久| 亚洲精品,欧美精品| 18禁观看日本| 日韩不卡一区二区三区视频在线| tube8黄色片| 18禁在线播放成人免费| 老司机影院毛片| av女优亚洲男人天堂| 午夜av观看不卡| 国产日韩欧美亚洲二区| 久久久久久伊人网av| 久久婷婷青草| 91精品伊人久久大香线蕉| 日韩一本色道免费dvd| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲欧美精品自产自拍| 日韩成人av中文字幕在线观看| 91久久精品电影网| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 精品人妻熟女av久视频| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 欧美激情 高清一区二区三区| 老司机亚洲免费影院| 日韩精品有码人妻一区| 中国美白少妇内射xxxbb| 女性被躁到高潮视频| 亚洲国产av影院在线观看| 欧美激情国产日韩精品一区| 黄色视频在线播放观看不卡| 七月丁香在线播放| 亚洲,欧美,日韩| 欧美精品亚洲一区二区| 日日撸夜夜添| 国产欧美亚洲国产| 少妇熟女欧美另类| 午夜激情久久久久久久| 亚洲成人av在线免费| 欧美 日韩 精品 国产|