一種以蝦原肌球蛋白為致敏原的Th2反應小鼠模型的建立①

方 蕾 侯 睿 費巧玲 高 源 蔡潤蘭 齊 云

(中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所，北京100193)

·免疫學技術與方法·

一種以蝦原肌球蛋白為致敏原的Th2反應小鼠模型的建立①

方 蕾 侯 睿 費巧玲 高 源 蔡潤蘭 齊 云

(中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所，北京100193)

目的：采用蝦原肌球蛋白為致敏原建立Th2反應小鼠模型。方法：蝦原肌球蛋白腹腔注射小鼠6周誘導Th2反應，ELISA測定小鼠血清總IgE、sIgE和sIgG水平、脾淋巴細胞分泌Th1和Th2細胞因子的含量，采用流式細胞術檢測血液中嗜堿性粒細胞的活化。結果：與對照組比較，致敏6周的小鼠血清總IgE、sIgE和sIgG(sIgG1、sIgG2a和sIgG2b)均顯著升高；脾淋巴細胞在抗原刺激后分泌Th2細胞因子(IL-4、IL-5、IL-10和IL-13)增加，而Th1細胞因子INF-γ則出現(xiàn)明顯降低；血液中嗜堿性粒細胞表面標志物CD200R和CD41表達增強。結論：成功建立一種以蝦原肌球蛋白為致敏原的Th2反應小鼠模型。

Th2反應；蝦原肌球蛋白；嗜堿性粒細胞；IgE

輔助T細胞(T helper，Th)是由初始CD4+T細胞分化而來。初始CD4+T細胞在胸腺內成熟后遷移至外周淋巴器官，與激活的抗原呈遞細胞相互作用分化為Th1、Th2、Th17和調節(jié)性T細胞等多種功能亞群，Th細胞通過細胞因子網絡維持動態(tài)平衡。目前認識到Th1/Th2細胞失衡現(xiàn)象存在于感染性疾病、腫瘤、自身免疫性疾病和變態(tài)反應性疾病等多種疾病中[1]，而Th2優(yōu)勢反應最常見于過敏性疾病，與IgE生成密切相關。在實驗研究中，Ⅰ 型過敏反應動物模型通常以卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)和二硝基苯酚(Dinitrophenol，DNP)與載體蛋白的偶聯(lián)物誘導。前者模擬大分子致敏，后者則模擬小分子(半抗原)致敏。但我們的研究結果卻顯示OVA對嚙齒類動物IgE的誘導情況并不理想，尤其在沒有佐劑的情況下更為明顯[2]。這與普通鼠飼料含蛋粉，長期食用致免疫耐受有關[3]。而小分子DNP誘導的過敏模型代表半抗原致敏，并不能完全替代臨床上對大分子(蛋白質、多肽)致敏的情形。因此，實驗研究中迫切需要一種致敏性高的大分子抗原物質。蝦蛋白也是食品中極重要的一類變應原[4]，且不是普通鼠飼料中的必須組分。通過與相同劑量條件下的OVA進行比較，小鼠對蝦蛋白的響應性遠高于OVA[2]。據此，我們提取了蝦的主要過敏原成分——原肌球蛋白，誘導小鼠模型，從與IgE生成密切相關的Th2效應來探討蝦原肌球蛋白致敏模型的特點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和細胞 雌性BALB/c小鼠(6～8周齡)，16～18 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[許可證編號：SCXK(京)2012-0001]。于中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所SPF級動物房常規(guī)飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑 小鼠IgE ELISA試劑盒購自美國Biolegend公司，protein G PLUS-Agarose購自美國Santa cruz biotechnology公司，HRP標記的大鼠抗小鼠IgE二抗購自英國Abcam公司，兔抗小鼠IgG1、IgG2a和IgG2b抗體購自美國OriGene Technologies公司，F(xiàn)ITC標記的抗小鼠IgE、PerCP-eFluor 710標記的抗小鼠CD41、PE標記的抗小鼠CD200R抗體購自美國BD Bioscience公司。

1.2 方法

1.2.1 鋁佐劑的配制 分別配制質量分數5%的Al2(SO4)3溶液和NaOH溶液，取Al2(SO4)31.0 g，溶于20 ml無菌三蒸水中，即NaOH 0.4 g，溶于8 ml無菌三蒸水中；在強烈攪拌下，將NaOH加入Al2(SO4)3中，4 000 r/min離心15 min，無菌生理鹽水重懸2次，最終以生理鹽水定容至20 ml，-20℃分裝保存。

1.2.2 蝦原肌球蛋白的提取和鑒定 取新鮮的刀額新對蝦(Metapenaeusensis)，去頭去殼，蝦肉研碎勻漿，參照文獻[5]采用等電點沉淀的方法提取原肌球蛋白，通過SDS-PAGE對其分子量進行鑒定。

1.2.3 蝦原肌球蛋白誘導小鼠Th2反應 小鼠隨機分為佐劑對照組和模型組。蝦原肌球蛋白配制成400 μg/ml(生理鹽水配制)，再加入等體積的鋁佐劑，蝦原肌球蛋白的終濃度為200 μg/ml。模型組小鼠腹腔注射0.1 ml蝦原肌球蛋白，即20 μg/只，每周1次，共6周。佐劑對照組則給予等體積含佐劑的生理鹽水。

1.2.4 ELISA法測定小鼠血清總IgE及抗原特異性IgE(antigen-special immunoglobulin E，sIgE) 小鼠6周末摘眼球取血，分離血清，參照ELISA測定試劑盒說明書測定總IgE的含量。sIgE的檢測參考文獻[6]所述，并加以改進：待測血清先與protein G PLUS-Agarose以體積比1∶9混合，除去血清中的IgG。室溫反應30 min，期間每隔5 min混懸1次；2 500 r/min 離心10 min，取上清；將上清以PBS稀釋10倍后取100 μl加入預包被蝦原肌球蛋白的ELISA板(1 μg/孔)中，37℃孵育1 h；PBST洗板4次，加入HRP-大鼠抗小鼠IgE二抗(1∶5 000稀釋)，100 μl/孔，37℃孵育1 h；PBST洗板5次，TMB顯色37℃孵育10 min，每孔加100 μl 2 mol/L H2SO4終止，于450 nm處讀數。

1.2.5 ELISA法測定小鼠抗原特異性IgG(antigen-special immunoglobulin G，sIgG) 取6周末小鼠血清檢測sIgG，方法與上述測定sIgE的方法相似：待測血清稀釋后直接加入包被蝦原肌球蛋白的ELISA板中，37℃孵育1 h；PBST洗板4次，加入兔抗小鼠IgG1(1 ng/ml)或IgG2a(2 μg/ml)或IgG2b抗體(1 ng/ml)，37℃孵育1 h；PBST洗板4次，加入HRP標記的山羊抗兔IgG，37℃孵育1 h；PBST洗板4次，37℃ TMB孵育10 min顯色，H2SO4終止，于450 nm處讀數。

1.2.6 流式細胞術檢測血液中嗜堿性粒細胞CD200R和CD41的表達 小鼠摘眼球取血，全血置于EDTA-K2抗凝管中，取抗凝血100 μl加入終濃度為5 μg/ml的蝦原肌球蛋白，37℃孵育。2 h后，加入FITC標記的抗小鼠IgE、PerCP-eFluor 710標記的抗小鼠CD41和PE標記的抗小鼠CD200R抗體，4℃避光孵育15 min，再加入流式專用紅細胞裂解液2 ml避光孵育5 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加2 ml PBS洗1次，離心，最后加0.3 ml PBS重懸細胞，F(xiàn)ACSCalibur型流式細胞儀(美國BD公司)檢測，收集1 000個IgE+細胞，于流式分析軟件Flowjo 7.6.1中分析CD200R和CD41的表達(Mean fluorescence intensity，MFI)。

1.2.7 蝦原肌球蛋白刺激小鼠脾淋巴細胞72 h分泌細胞因子 小鼠于6周末處死后，于75%酒精中浸泡5 min消毒皮毛。參照文獻[5]，無菌條件下取脾臟，制備脾細胞懸液，以4×106個/孔鋪24孔板，各孔加入終濃度為4 μg/ml蝦原肌球蛋白，37℃孵育培養(yǎng)。蛋白刺激72 h后，取上清采用ELISA法測定IL-4、IL-5、IL-10、IL-13和IFN-γ的含量。

2 結果

2.1 模型小鼠血清總IgE和sIgE 經電泳鑒定提取的刀額新對蝦原肌球蛋白分子量為36 kD，與文獻報道吻合[7]。采用蝦原肌球蛋白誘導小鼠模型，與對照組比較，第6周的動物血清總IgE和sIgE含量均明顯升高(P<0.01)，見圖1。

2.2 模型小鼠血清sIgG1、sIgG2a和sIgG2b 由圖2可見，與對照組比較，模型組小鼠血清sIgG2a、 sIgG2b和sIgG1均明顯升高(P< 0.01)。從血清稀釋倍數可見，以sIgG1含量最高。

圖1 小鼠血清總IgE和sIgE含量Fig.1 Levels of total IgE and sIgE in serum of ST-sensitized miceNote: Mice were sensitized by ST intraperitoneally once a week.At day 42,sera from different groups of mice were obtained.The total IgE (A) and sIgE (B) levels were determined by using ELISA.Data present the ±s(n=6).##.P< 0.01 vs control group.

圖2 模型小鼠血清sIgG1、sIgG2a和sIgG2b含量Fig.2 Levels of sIgG1,sIgG2a and sIgG2b in serum of ST-sensitized miceNote: Mice were sensitized by ST intraperitoneally once a week.At day 42,sera from different groups of mice were obtained.The levels of sIgG1 (A),sIgG2a (B) and sIgG2b (C) were determined by using ELISA.Sera were diluted 1∶2×105 for sIgG1,1∶1 000 for sIgG2a,and 1∶4×104 for sIgG2b.Data present the ±s(n=6).##.P< 0.01 vs control group.

圖3 蝦原肌球蛋白刺激模型小鼠脾細胞分泌細胞因子Fig.3 Splenocyte cytokine secretion in response to STNote: Spleen cells from control or ST-sensitized mice were cultured for 72 h in the presence of ST.Cytokines in culture supernatants (A.IL-4,B.IL-5,C.IL-10,D.IL-13 and E.IFN-γ) were measured by ELISA.Data present the ±s(n=5).##.P< 0.01 vs control group.

圖4 模型小鼠血液中嗜堿性粒細胞CD200R和CD41的表達Fig.4 Basophil CD200R and CD41 expression in response to STNote: Whole blood was incubated with ST.MFI of CD200R (A,C-F) and CD41 (B,G-J) on basophils were analyzed by flow cytometry.).#.P< 0.05,##.P< 0.01 vs control group.

2.3 蝦原肌球蛋白刺激模型小鼠脾淋巴細胞分泌細胞因子 通過預實驗我們考察了蝦原肌球蛋白(0.5～8 μg/ml劑量范圍)的最佳刺激量為4 μg/ml。在該造模劑量條件下，如圖3所示，與對照組比較，抗原刺激模型小鼠脾淋巴細胞72 h可見上清中IL-4、IL-5、IL-10和IL-13含量均顯著升高(P<0.01)，而模型組的IFN-γ則顯著降低(P<0.01)。

2.4 模型小鼠血液中嗜堿性粒細胞CD200R和CD41的表達 通過預實驗我們考察了5～20 μg/ml劑量范圍內蝦原肌球蛋白的體外刺激小鼠抗凝血合理劑量為5 μg/ml?？乖c抗凝血孵育2 h后，模型組CD200R的表達較對照組明顯增強(圖4E、F：CD200R+嗜堿性粒細胞對照組2.17% vs 模型組52.9%)；CD41的表達也增加，但是不如CD200R趨勢顯著(圖4I、J：CD41+嗜堿性粒細胞對照組18.3% vs 模型組33.0%)。

3 討論

Ⅰ型過敏反應常見Th2優(yōu)勢反應，Th2細胞因子是促進B細胞發(fā)生抗體類型轉換生成IgG1和IgE類抗體的關鍵因子。過敏患者可見血清sIgG、sIgG1和sIgE的明顯升高[8]；Th2細胞因子IL-4在哮喘患兒血清中濃度升高，而Th1細胞因子IFN-γ濃度則下降，出現(xiàn)Th1/Th2細胞免疫失衡[9]。在本文建立的以蝦原肌球蛋白為抗原的小鼠Th2模型中，小鼠血清總IgE、sIgE和sIgG(sIgG以sIgG1含量最高)含量均顯著增加(圖1～2)；同時，抗原刺激模型小鼠脾細胞分泌的Th2細胞因子IL-4、IL-5、IL-10和IL-13均顯著升高，而Th1效應則受到抑制，IFN-γ的含量明顯下降(圖3)，可見該模型呈現(xiàn)典型的Th2反應亢進。

人們很早就認識到肥大細胞是 Ⅰ 型過敏反應的主要參與者，通過IgE介導其激活。然而，和肥大細胞表型和功能相似的嗜堿性粒細胞，由于占白細胞總數的比例不到1%，在很長一段時期內，都被認為是血液循環(huán)中殘余的肥大細胞，對其功能關注并不多。近年來，國內外學者發(fā)現(xiàn)多種過敏性疾病的發(fā)生以及發(fā)病的嚴重程度與人體內能夠激活的致敏嗜堿性粒細胞(其表面標志物CD63的表達增強)的比例以及脫顆粒的程度相關[10，11]。隨著嗜堿性粒細胞條件性缺失技術的發(fā)展和高純度細胞分選技術的應用，嗜堿性粒細胞的新生物學作用被逐一闡明：目前已發(fā)現(xiàn)它不僅是Th2細胞因子IL-4的主要來源細胞，而且可能具有潛在獨立的或協(xié)同樹突狀細胞的抗原提呈作用，調節(jié)Th2應答[12]。進一步的研究則明確了嗜堿性粒細胞參與過敏性哮喘小鼠Th2反應：抗原致敏和激發(fā)導致了小鼠血液和肺組織中嗜堿性粒細胞的數量明顯增加，同時伴隨其激活標志物CD200R的表達上調。然而，采用MAR-1或Ba103抗體清除嗜堿性粒細胞后氣道炎癥明顯減輕，脾臟和引流淋巴結Th2亞群減少，肺組織IL-4和血清sIgE均顯著降低[13]。目前，小鼠嗜堿性粒細胞激活標志物研究并不多，研究顯示小鼠的嗜堿性粒細胞CD200R的激活和胞內IL-4的水平成正相關[14]；CD41是血小板和巨核細胞的標志物，還表達于人和小鼠骨髓來源的肥大細胞，2014年有研究者首次嘗試將CD41作為寄生蟲感染性疾病嗜堿性粒細胞活化的標志物[15]。在本文建立的以蝦原肌球蛋白為抗原的Th2模型中，我們檢測到小鼠血液中嗜堿性粒細胞表面活化標志物CD200R和CD41表達明顯增強(圖4)，表明嗜堿性粒細胞處于激活狀態(tài)。

綜上所述，蝦原肌球蛋白克服了傳統(tǒng)大分子抗原OVA在嚙齒類動物中的免疫耐受問題，具有更高的致敏性，可能是經典致敏原的一個更好的替代品。經腹腔注射蝦原肌球蛋白能夠成功誘導小鼠發(fā)生明顯的Th2優(yōu)勢反應，產生與臨床Ⅰ型過敏反應患者類似的免疫學改變，表現(xiàn)為脾淋巴細胞分泌Th2細胞因子IL-4、IL-5、IL-10和IL-13增加，分泌Th1細胞因子IFN-γ的含量明顯下降，呈現(xiàn)Th1/Th2免疫反應的明顯失衡；血清抗體水平總IgE、sIgE和sIgG的含量升高；血液中嗜堿性粒細胞活化，其表面活化標志物CD200R和CD41表達明顯增強。該模型的應用價值在于，研究者們能夠利用這種以Th2反應為主的動物模型為基礎選擇進行多種實驗，例如可直接以抗原激發(fā)建立全身(經靜脈)或局部(經呼吸道)的主動過敏模型，或采用其富含IgE的致敏血清可用于被動皮膚過敏反應模型；而脾細胞反應以及嗜堿性粒細胞激活實驗均可用于體外抑制Th2反應藥物的評價，這些將為抗過敏性疾病創(chuàng)新藥物的機制研究提供良好的應用平臺。

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[收稿2016-06-16 修回2016-08-25]

(編輯 倪 鵬)

A murine model of Th2 response induced by shrimp tropomyosin

FANGLei,HOURui,FEIQiao-Ling,GAOYuan,CAIRun-Lan,QIYun.

InstituteofMedicinalPlantDevelopment,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Beijing100193，China

Objective:To develop murine models of Th2 response induced by shrimp tropomyosin (ST).Methods: Mice were sensitized with ST for 6 weeks.The serum antigen-special IgE (sIgE),total IgE and sIgG level,Th1/Th2 cytokines production were measured by ELISA.The basophil activation in mice was measured by flow cytometry.Results: The intraperitoneal sensitization with ST for 6 weeks induced significant increase of serum sIgE,total IgE and sIgG (sIgG1,sIgG2a and sIgG2b) level in mice.Th2 cell response was induced and cytokines (IL-4,IL-5,IL-10 and IL-13) production increased in splenocytes stimulated by ST,while Th1 cytokine (IFN-γ) production decreased.As the markers of basophil activation,CD200R and CD41 expression also increased in response to ST.Conclusion: The Th2 response is dominant in ST-induced anaphylaxis in mice.

Th2 response;Shrimp tropomyosin;Basophil;IgE

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.014

①本文受國家科技重大專項(2014ZX09201022-006)和北京市自然科學基金項目(7142112)資助。

方 蕾(1983年-)，女，博士，講師，主要從事抗過敏中藥藥理學研究，E-mail：fanglei@yzu.edu.cn，就職于揚州大學醫(yī)學院。

及指導教師：齊 云(1964年-)，男，博士，研究員，博士生導師，主要從事抗炎免疫藥理學研究，E-mail：yqi@implad.ac.cn。

R392.8

A

1000-484X(2017)02-0233-05