豬鏈球菌黏附機制及其相關(guān)毒力因子研究進展

付超，劉夢月，趙瑞利，胡燁，馬吉飛，崔君

豬鏈球菌（Streptococcus suis,S.suis）屬于球菌科、鏈球菌屬。其自然棲息地是上呼吸道（如咽部、鼻腔等）的黏膜，也可分布于生殖道和消化道等黏膜上，是一種重要的人畜共患病病原體，一般不會引發(fā)感染。但若遇到機體免疫力降低時，便能夠引起皮膚、呼吸道及軟組織感染[1]，可導致豬敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、肺炎等，也可導致相關(guān)從業(yè)人員感染，引起人腦膜炎、敗血癥、中毒性休克綜合征（STSS）等疾病，甚至出現(xiàn)死亡，嚴重威脅公共衛(wèi)生和畜產(chǎn)品生產(chǎn)，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大損失[2]。

S.suis在中國的發(fā)病率高于歐洲等國家，可感染不同品系、不同年齡、不同性別的動物。按莢膜多糖抗原的不同，S.suis可分成35個血清型（1～34型和1/2型），其中毒力最強的依次為血清2型、1型、9型和7型，其中血清32型和34型是鼠口腔鏈球菌[3-4]。而在許多歐洲國家，9型是病豬體內(nèi)主要的血清型。所以，S.suis的血清型致病性是否與地域相關(guān)尚未得到證實。

疫苗免疫是防控該病的關(guān)鍵措施，為了獲得高滴度抗體，許多研究人員致力于S.suis病原學、致病機制、毒力因子等相關(guān)研究，并取得了一定進展。本文通過對S.suis的主要黏附機制和相關(guān)毒力因子進行概述，以期為S.suis致病機制及其疫苗開發(fā)提供相關(guān)參考。

1 主要的宿主黏附機制

迄今為止，許多研究已經(jīng)提出了很多已證實存在或假設(shè)存在的毒力因子及相關(guān)因子，這些因子都直接或間接參與S.suis的致病過程。S.suis主要通過傷口、呼吸道途徑入侵機體，而呼吸道途徑更易于細菌感染。

S.suis通過呼吸道途徑入侵機體后定殖于宿主扁桃體，若帶菌者健康不發(fā)病，則S.suis一直存在。若當機體免疫力下降時，一般認為，菌體會擴散侵入肺組織，進而通過肺循環(huán)而侵襲不同的組織器官或引起全身性感染，最終導致菌血癥、敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎等臨床病理癥狀[5]。在S.suis定殖宿主過程中，S.suis會通過一些能夠識別宿主黏膜細胞表面受體的毒力因子（如溶菌酶釋放蛋白、溶血素、纖連蛋白結(jié)合蛋白等）而特異性結(jié)合宿主的黏膜細胞表面受體（如H因子、纖溶酶原、纖連蛋白等），從而成功定殖于宿主體內(nèi)。此外，S.suis可以產(chǎn)生某些蛋白酶（精氨酸-氨基肽酶、二肽基肽酶Ⅳ、胰凝乳蛋白酶、酪蛋白酶），這些蛋白酶可能與細菌的黏附侵襲有關(guān)[6]。

當由于各種因素導致機體免疫水平下降時，定殖于宿主黏膜細胞表面的S.suis便會與上皮細胞黏膜發(fā)生相互作用，此時由于宿主黏膜上皮杯狀細胞分泌的黏液層（包含有脂類、免疫球蛋白類和糖蛋白類）可以產(chǎn)生一定的抵抗作用，故菌體通過一些毒力因子及酶的作用破壞宿主黏膜屏障，從而入侵機體。即是S.suis可以通過相關(guān)類枯草桿菌蛋白酶A與宿主的黏液層相連，從而黏附宿主黏膜上皮細胞。隨后，其可能會通過溶血素或者一些蛋白酶的作用，而降解宿主細胞的炎性介質(zhì)、破壞細胞的緊密連接或者通過跨細胞途徑而侵入細胞外基質(zhì)，引起機體的炎癥反應(yīng)。此外，S.suis也可以通過蛋白酶（包括一些表面蛋白質(zhì)、毒素和酶）或毒力因子（如纖連蛋白結(jié)合蛋白等）與細胞外基質(zhì)組分（ECM）結(jié)合，從而增加菌體在宿主體內(nèi)的擴散范圍，并通過一些酶（如腺苷合酶等）抵抗宿主免疫細胞的攻擊。同時，通過補體降解、補體沉積抑制、補體滅活等途徑抵抗補體對其所介導的細胞溶解作用。通過上述途徑，S.suis可進入機體后隨血流從而引起宿主發(fā)生相應(yīng)的疾病[7]。

此外，S.suis的許多毒力因子（如溶菌酶釋放蛋白、溶血素、纖連蛋白結(jié)合蛋白等）都表現(xiàn)出一定的細菌黏附能力，因此細菌對于宿主細胞的黏附可能是多種黏附素參與作用的結(jié)果，其他相關(guān)粘附因子有待于進一步證實。

2 經(jīng)典的毒力因子

S.suis的致病力強弱與毒力因子密切相關(guān)，因此研究其毒力因子極具實際價值。在致病過程中，這些毒力因子與宿主黏膜相互作用，從而影響細菌的黏附力及致病性，但在致病過程中各毒力因子之間是否存在相互作用有待進一步研究。

2.1 莢膜多糖（Capsular polysaccharide，CPS）

由N-乙酰葡萄糖胺、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖及唾液酸構(gòu)成，CPS作為S.suis的分型標志之一，也是S.suis抵抗巨噬細胞吞噬的重要蛋白[8]。其能夠促進機體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，主要通過影響菌體與上皮細胞及吞噬細胞之間的黏附性來發(fā)揮作用。同時，有實驗表明，CPS缺失株表現(xiàn)無毒，極易被吞噬細胞所吞噬。此外，一般認為，S.suis的抗吞噬能力與CPS厚度呈正相關(guān)關(guān)系[9]。臨床上，通常采用經(jīng)純化的添加弗氏不完全佐劑對豬進行免疫，能產(chǎn)生抗體，但不能抵抗全菌感染[10]。

2.2 溶菌酶釋放蛋白（Muramidase-releasedprotein，MRP）和胞外因子（Extracellular factor，EF）

MRP和EF是S.suis2毒力強弱的標志[11]。MRP是細菌的胞壁大分子糖蛋白，分子量為136 kDa，亦是S.suis2的一種黏附素。其黏附作用可被半乳糖所阻斷，但除半乳糖外，MRP是否有其他的識別基團，仍有待證實[12]。EF主要由血清1、2、1/2、14、15型菌株產(chǎn)生，分子量為110 kDa，僅能在培養(yǎng)細菌的上清液中分離得到[8]。與病豬相比，健康母豬的血清型2中MRP+/EF+/Sly+的出現(xiàn)頻率顯著降低，表明MRP和EF在致病過程中起著重要作用。在用不同的表現(xiàn)型菌株感染小豬時發(fā)現(xiàn)，MRP+EF+的表現(xiàn)型菌株可引起典型的腦炎、多發(fā)性漿液炎及多發(fā)性關(guān)節(jié)炎[13]。采用親和層析法提取S.suisMRP和EF，后與WO（油包水乳液佐劑）制備亞單位疫苗，可產(chǎn)生高滴度抗體，能有效保護機體免受S.suis2毒株侵襲[14]。此外，MRP的N末端與人源纖維蛋白原（hFg）中D片段的Aα和Bβ鏈結(jié)合，通過一種αXβ2整合素依賴機制，hFg-MRP的這種相互作用能夠?qū)е露嘈魏酥行粤＜毎≒MNs）的聚集和衰亡，同時能夠促進病原菌在宿主血液中的存活[15]。

2.3 溶血素（Suilysin，Sly）

Sly也稱S.suis溶血素，是S.suis強毒株的標志之一，分子量約為54～62 kD，分泌于上清中，屬于巰基活化類毒素，具有較強細胞毒性，其對微血管內(nèi)皮細胞具有很強的破壞作用[16]?？杀谎趸瘎?、膽固醇及蛋白酶K完全抑制，其產(chǎn)量受培養(yǎng)條件影響極大。S.suis2對動物致病性的差異可能與Sly對不同動物的紅細胞的敏感性差異有關(guān)[17]。Sly導致S.suis不同的溶血活性，有助于細菌的增殖、腦部炎癥的增強和死亡率的增加[18]。

2.4 纖連蛋白原結(jié)合蛋白（Fibrinogen-binding proteins，F(xiàn)nBPs）

FnBPs是一種無錨定黏附蛋白，廣泛存在于各血清型S.suis中，純化FnBPs蛋白顯示主要可以結(jié)合人纖連蛋白和纖維蛋白原，而敲除基因后，突變株毒力有所下降，但在血中的增殖能力并未受到影響，表明其具有干擾纖連蛋白正常功能和提供黏附能力的作用。有研究表明FnBPs的N端及C端的晶體結(jié)構(gòu)及全長蛋白的結(jié)構(gòu)。FnBPs由具有獨特折疊的兩個域組成，其中FnBPs的C-末端結(jié)合宿主纖連蛋白，N-末端附著于細菌表面，促進S.suis對宿主細胞的黏附[19-20]。同時，F(xiàn)nBPs通過β1整合素受體激活信號傳導通路，誘導產(chǎn)生趨化因子，進而導致嗜中性粒細胞浸潤增加，促進細菌在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中的擴散。

3 相關(guān)蛋白及酶類

除了幾種經(jīng)典的毒力因子外，其他S.suis生長代謝相關(guān)蛋白及酶類也與細菌黏附及毒力有密切關(guān)系。這些蛋白及酶類均具有較好的免疫原性，在S.suis的黏附致病過程中發(fā)揮著重要的作用。

3.1 相關(guān)蛋白

主要包括金屬結(jié)合脂蛋白A、Cbp40、Trag、CcpA、SrtA（SortaseA蛋白）、Sao蛋白、SsMps蛋白、IgG結(jié)合蛋白等[21-22]。其中SsMps蛋白作為菌毛骨架，存在于S.suis2的胞壁上，呈不同聚體狀態(tài)，直接接觸宿主細胞或蛋白，可以結(jié)合宿主一種重要免疫因子，影響細菌黏附，對致病性起著重要的作用。其天然狀態(tài)下可能會共價連接小分子量寡糖或肽，但這有待進一步證實[23]。

3.2 相關(guān)酶類

主要包括谷氨酸脫氫酶（GDh）、肽聚糖水解酶、谷氨酰胺合成酶、精氨酸脫亞氨酸酶系統(tǒng)（ADS）、次黃嘌呤單磷酸脫氫酶（IMPDH）、烯醇酶（enolase）、甲酸四氫葉酸連接酶（Fhs）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、Ⅳ型二肽基肽酶（DPPⅣ）、谷氨酰胺合成酶（GlnA）、IgA蛋白酶、IgM蛋白酶等[21-22]。

有研究顯示[24]，使用鼠和仔豬感染模型，F(xiàn)hs對于S.suis2的完全毒力是必需的，敲除Fhs基因在體外對S.suis2生長沒有影響。

4 其他因子

使用無毒力株和毒力株通過生物信息學和構(gòu)建基因敲除株等方法鑒定出多種新型毒力因子，主要包括渾濁因子（OFS）、pgdA基因、分泌性核酸酶A（ssnA）基因、dltA基因、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（plcR）、致病性相關(guān)閱讀框（orf2）、毒力調(diào)控子（covR）、感染相關(guān)因子Trag、反應(yīng)調(diào)控因子（RevS）等[25-26]。這些毒力因子大多數(shù)都具有較好的免疫原性，在S.suis的致病過程中發(fā)揮十分重要的作用。

此外，有研究表明，S.suis致病過程中，毒力因子的表達處于動態(tài)變化中，隨著轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的調(diào)控發(fā)生而發(fā)生著變化，這表明S.suis可能通過一些調(diào)控基因來調(diào)控毒力因子的表達與致病[22]。在芽孢桿菌屬細菌中，plcR作為多效調(diào)節(jié)子，可以調(diào)控卵磷酶和單個或多個蛋白酶基因的表達，對其致病力有著一定調(diào)控作用[27]。但在S.suis2中的作用卻未見報道，陳恬[28]通過構(gòu)建plcR基因缺失突變株，并用其野生株和突變株分別感染BALB/c小鼠，結(jié)果顯示plcR基因缺失突變株的毒力較野生株顯著降低，表明plcR作為特有的外源基因，其與S.suis2致病性相關(guān)聯(lián)。

5 結(jié)語

S.suis不僅可以引起豬群發(fā)病，而且可以突破種群障礙感染人，甚至引起死亡，給養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟和相關(guān)從業(yè)人員的健康帶來了巨大威脅，故需對其進行有效防控。S.suis對于宿主的黏附作為其感染致病的首要步驟，研究該機制是防治S.suis的關(guān)鍵所在，許多毒力因子也都直接或間接參與S.suis的致病過程，并對其致病力產(chǎn)生了一定影響。此外，有文獻顯示[29]，鳥類也可充當該病的傳播媒介。

此外，由于近年來S.suis的耐藥情況復雜，濫用抗生素較為嚴重，耐藥情況呈逐年加重的趨勢[30]，故該病的防治工作更加艱巨。隨著科學技術(shù)的迅速發(fā)展，研究S.suis菌株（尤其S.suis2強毒株）的黏附機制以及相關(guān)毒力因子（包括潛在毒力因子）均具有重要的實際意義，豬源S.suis的病原學、致病性等研究得越來越深入，將為豬鏈球菌病的防控及動物性食品安全提供保障。

[1]Segura M.Streptococcus suis：an emerging human threat[J].The Journal of Infectious Diseases，2008，199（1）：4-6.

[2]Sánchez D R V，F(xiàn)ernández-Garayzábal J F，Domínguez L，et al.Screening of virulence-associated genes as a molecular typing method for characterization ofStreptococcus suis isolates recovered from wild boars and pigs[J].Veterinary Journal，2015，209（3）：108-112.

[3]Lun Z R，Wang Q P，Chen X G，et al.Streptococcus suis：an emerging zoonotic pathogen[J].The Lancet Infectious Diseases，2007，7（3）：201-206.

[4]黎敏.2型豬鏈球菌分離鑒定及毒力基因檢測[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技，2016，41（3）：18-20.

[5]周康，李宗明，李江華，等.豬鏈球菌Ⅱ型五種感染途徑感染豬模型的比較[J].中國動物傳染病學報，2016，24（2）：35-41.

[6]Marie-Claude J，Daniel G.Identification and characterization of four proteases produced byStreptococcus suis[J].FEMS Microbiology Letters，2003，220（1）：113-119.

[7]Segura M，Calzas C，Grenier D，et al.Initial steps of the pathogenesis of the infection caused byStreptococcus suis：fighting against nonspecific defenses[J].FEBS Letters，2016，590（21）：3772-3799.

[8]劉耀川，宋淑英，張澤輝，等.豬鏈球菌毒力因子簡介[J].湖北畜牧獸醫(yī)，2015，36（3）：7-8.

[9]曾巧英，陸承平.豬鏈球菌2型溶菌酶釋放蛋白誘導上皮細胞融合和凋亡[J].微生物學報，2003（3）：407-412.

[10]陳瑤，張雅為，王宏燕，等.豬鏈球菌2型研究進展[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2010（7）：72-74.

[11]黎敏.2型豬鏈球菌分離鑒定及毒力基因檢測[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技，2016，41（3）：18-20.

[12]曾巧英，陸承平.豬鏈球菌2型溶菌酶釋放蛋白的黏附作用[J].南京農(nóng)業(yè)大學學報，2002，25（4）：67-71.

[13]Vecht U，Wisselink H J，Jellema M L，et al.Identification of two proteins associated with virulence ofStreptococcus suistype 2[J].Infection and Immunity，1991，59（9）：3156-3162.

[14]Wisselink H J，Vecht U，Stockhofe-Zurwieden N，et al.Protection of pigs against challenge with virulentStreptococcus suisserotype 2 strains by a muramidase-released protein and extracellular factor vaccine[J].Veterinary Record，2001，148（15）：473-477.

[15]Pian Y Y，Li X Q，Zheng Y L，et al.Binding of Human Fibrinogen to MRP EnhancesStreptococcus suisSurvival in Host Blood in a αXβ2Integrin-dependent Manner[J].Scientific Reports of Nature，2016，6（26966）：1-12.

[16]吳萍萍.豬鏈球菌2型毒力因子及疫苗候選蛋白研究進展[J].畜牧與飼料科學，2013（11）：123-127.

[17]高尚慶，雷連成，韓文瑜.豬鏈球菌2型主要毒力因子研究進展[J].中國生物制品學雜志，2006，19（6）：657-659.

[18]Chen S L，Xie W L，Wu K，et al.Suilysin Stimulates the Release of Heparin Binding Protein from Neutrophils and Increases Vascular Permeability in Mice[J].Front in Microbiology，2016，7（1338）：1-12.

[19]Musyoki A M，Shi Z Y，Xuan C L，et al.Structural and functional analysis of an anchorless fibronectin-binding protein FBPS from Gram-positive bacteriumStreptococcus suis[J].PNAS of USA，2016，113（48）：13869-13874.

[20]Hoffmann C，Ohlsen K，Hauck C R.Integrin-mediated uptakeoffibronectin-bindingbacteria[J].European Journal of Cell Biology，2011，90（11）：891-896.

[21]吳立志，王金良，肖躍強，等.豬鏈球菌2型毒力因子研究進展[J].動物醫(yī)學進展，2012，33（6）：118-122.

[22]Fittipaldi N，Segura M，Grenier D，et al.Virulence factors involved in the pathogenesis of the infection caused by the swinepathogenandzoonoticagentStreptococcus suis[J].Future Microbiology，2012，7（2）：259-279.

[23]楊寶玲，陳福廣，謝芳，等.2型豬鏈球菌SsU05-0474的表達純化及單克隆抗體制備[J].中國動物傳染病學報，2016，24（2）：25-30.

[24]Zheng C K，Xu J L，Shi G L，et al.Formatetetrahydrofolate ligase is involved in the virulence of Streptococcus suisserotype2[J].Microbial Pathogenesis，2016，98（9）：149-154.

[25]鞠愛萍，王長軍，李明，等.豬鏈球菌2型反應(yīng)調(diào)控因子RevS突變株的構(gòu)建[J].中華流行病學雜志，2008，29（1）：59-64.

[26]Greeff A d，Buys H，Alphen L V，et al.Response regulator important in pathogenesis ofStreptococcus suisserotype 2[J].Microbial Pathogenesis，2002，33（4）：185-192.

[27]王玲，陳亞華，Mahillon J，等.蠟狀芽胞桿菌轉(zhuǎn)錄激活子pIcR調(diào)控多基因的表達[J].微生物學報，2001，41（3）：304-309.

[28]陳恬.SezAT系統(tǒng)及PlcR轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在2型豬鏈球菌中的作用研究[D].重慶：第三軍醫(yī)大學，2014.

[29]浦堅華，毛紫微，王瓊，等.豬鏈球菌病的研究進展[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2016（4）：13-15.

[30]張維誼，王曉旭，寧昆，等.豬源豬鏈球菌耐藥情況分析[J].中國農(nóng)業(yè)信息，2016（11）：101-103.