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    云南德宏地區(qū)一例虎紋蛙氣單胞菌的分離鑒定

    2017-02-25 09:58:01張瑞海趙汝梅張書光
    中國畜牧獸醫(yī)文摘 2017年1期
    關(guān)鍵詞:盈江縣德宏單胞菌

    張瑞海趙汝梅張書光

    (1.盈江縣動物疫病預(yù)防控制中心,云南盈江 679300;2.德宏州動物疫病預(yù)防控制中心,云南芒市 678400;3.昆明理工大學(xué)津橋?qū)W院,云南昆明 650101)

    云南德宏地區(qū)一例虎紋蛙氣單胞菌的分離鑒定

    張瑞海1趙汝梅3張書光2*

    (1.盈江縣動物疫病預(yù)防控制中心,云南盈江 679300;2.德宏州動物疫病預(yù)防控制中心,云南芒市 678400;3.昆明理工大學(xué)津橋?qū)W院,云南昆明 650101)

    目的:確診虎紋蛙的致病菌。方法:采用平板分離法從死亡虎紋蛙肝臟中分離出1株細(xì)菌,通過表型、16s-rRNA的PCR擴增、測序鑒定。結(jié)果:分離菌的測序結(jié)果為氣單胞菌,16s rRNA序列同源性分析結(jié)果表明分離菌與氣單胞菌的同源性為99%。結(jié)論:虎紋蛙所患細(xì)菌病為胃腸炎,細(xì)菌病原為氣單胞菌。

    氣單胞菌 分離 鑒定 16s-rRNA

    虎紋蛙(Rana tigrina Wiegmann)隸屬于兩棲綱無尾目蛙科蛙屬,廣泛分布于中國、印度、尼泊爾、錫金、孟加拉、斯里蘭卡、泰國、印度尼西亞及菲律賓等熱帶和亞熱帶地區(qū)。虎紋蛙共有4個亞種,中國僅分布1 亞種,即 虎紋蛙,目前已被列為國家二級保護(hù)動物,主要分布于我國東南和南部各省,河南和陜西南部也偶有分布。云南的隴川、盈江、勐臘、河口、金平、屏邊、石屏和元江等地均有分布。

    氣單胞菌在細(xì)菌分類學(xué)上屬于弧菌科(Vibrionaceae)氣單胞菌屬(Aeromonas),是多種魚類均可感染的病原細(xì)菌,且感染后的病型也表現(xiàn)很復(fù)雜,同時存在多種不同的免疫血清型。其中有的不僅可致魚病,還可引起人的感染發(fā)病。陳懷青等報道嗜水氣單胞菌引起鯉科魚暴發(fā)性傳染病,朱家新報道嗜水氣單胞菌引起牛蛙暴發(fā)性疾病,韓名竹等報道嗜水氣單胞菌引起甲魚出血性敗血癥。近年來,有關(guān)氣單胞菌引發(fā)養(yǎng)殖鰻鱺的細(xì)菌性敗血癥也多有報道,最常見的由致病性嗜水氣單胞菌 Aeromonas hydrophila引起的鰻鱺敗血癥表現(xiàn)為體表充血乃至潰爛、血性腹水、胃內(nèi)積水、腸炎、肝脾等組織敗血等系列嚴(yán)重病變,每年都能引起養(yǎng)殖鰻鱺的大批量死亡。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    病料由云南德宏某個體養(yǎng)殖戶送檢;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(DP2001)和Ex tag酶購自大連寶生物技術(shù)有限公司。

    1.2 引物

    根據(jù)已知參比序列設(shè)計細(xì)菌通用引物,上游引物PF:5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’,下游引物PR:5’-AAG GAG GTG ATC CAG CC-3’,擴增目的片段大小為1500bp左右,由大連寶生物技術(shù)有限公司合成。

    1.3 菌株的分離與純化

    采取虎紋蛙的肝臟病料,涂布于LB平板上,置于恒溫培養(yǎng)箱37攝氏度培養(yǎng)12~16h后觀察細(xì)菌生長情況。挑取單個典型菌落,進(jìn)行純培養(yǎng)后分別進(jìn)行革蘭氏染色及菌種保存。

    1.4 16s-rRNA鑒定

    1.4.1 16s-rRNA測序

    將分離菌株接種LB液體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)10h,用試劑盒按說明書方法提取基因組DNA。用細(xì)菌通用引物pF、pR、擴增16s-rRNA,PCR擴增體系為50μL,反應(yīng)條件為95℃ 5 min;94℃30 S,55℃ 1 min,72℃ 1.5 min,30個循環(huán);72℃ 10 min。擴增產(chǎn)物送到大連TaKaRa公司測序。

    1.4.2 16s-rRNA測序結(jié)果比對

    將測序結(jié)果提交至GenBank進(jìn)行比對。下載同源性最高的序列,用本地軟件DNAMAN將測序結(jié)果與下載序列進(jìn)行同源性比對。

    2 實驗結(jié)果

    從樣品中分離到1株細(xì)菌,命名為A1。

    2.1 菌落特征

    LB平板上菌落為光滑,灰白色,半透明,隆起,濕潤,圓形的菌落(如圖1):

    圖1 菌落特征

    2.1.1 形態(tài)特征

    革蘭氏染色后光鏡下檢查,紅色、桿狀、兩端頓圓、無鞭毛,無莢膜,無芽孢,革蘭氏陰性細(xì)菌。其鏡檢特性見圖2:

    圖2 革蘭氏染色形態(tài)

    2.2 16s-rRNA鑒定

    2.2.1 分離菌的16s-rRNA基因

    提取分離菌株的基因組DNA,利用細(xì)菌16s-rRNA通用引物PCR擴增,得到約1.5 kb大小的目片段,擴增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果(見圖3)。

    張瑞海(1967-),男,云南德宏人,盈江縣動物疫病預(yù)防控制中心工作.

    張書光(1988-),男,河南三門峽人,云南農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)研究生,德宏州動物疫病預(yù)防控制中心工作。

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