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    浸潤性乳腺癌中mtDNAHV2區(qū)突變及意義

    2017-02-23 14:03:15金昭延
    醫(yī)學(xué)信息 2016年35期

    金昭延

    摘要:目的 檢測乳腺癌患者mtDNA D-loop環(huán)HV2區(qū)體細(xì)胞性突變并探討它在腫瘤發(fā)生中的作用。方法 采用聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)像多態(tài)性(PCR-SSCP)的方法對20例浸潤性乳腺導(dǎo)管癌組織和癌旁正常組織的mtDNA非編碼區(qū)D-loop環(huán)HV2區(qū)進(jìn)行分析,將出現(xiàn)異常條帶所有標(biāo)本進(jìn)行基因測序。結(jié)果 經(jīng)PCR-SSCP檢測,在20例乳腺癌mtDNA中共發(fā)現(xiàn)7例出現(xiàn)異常條帶;測序結(jié)果顯示,7例測序標(biāo)本中,HV2區(qū)共檢測到31個(gè)新的突變位點(diǎn),其中有3個(gè)屬于微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability,MSI),7例移碼突變,其余為點(diǎn)突變(point mutation),7個(gè)位點(diǎn)位于復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的區(qū)域。結(jié)論 浸潤性乳腺導(dǎo)管癌mtDNA HV2區(qū)是一個(gè)高度多態(tài)性和突變性的區(qū)域,它與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展有重要關(guān)系。

    關(guān)鍵詞:浸潤性乳腺癌;mtDNA;HV2區(qū);聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)像多態(tài)性

    Abstract:Objective To detect the effect of mutations of HV2 region of D-loop in mtDNA of the breast cancer.Methods It analysed the HV2 region of D-loop in mtDNA in the 20 cases invasive ductual breast carcinoma and 20 cases paracarcinoma tissues by PCR and PCR-single stranded conformation polymorism.Results The 7 cases exceptional bands were found from 20 breast carcinoma in all of the samples by PCR-SSCP;and the sequencing results indicated that 31 new HV2 mutations were found in 7 sequencing specimens,the 3 of them were mitochondrial microsatellite instability(MSI);the 7 of them were frameshift mutations;others were point mutation;and the 7 of them located in the region of mtDNA replication and transcription.Conclusion The mtDNA HV2 region is a highly polymorphic and mutatble region,that could be some relations in the breast carcinoma development.

    Key words:Invasive ductual breast carcinoma;mtDNA;HV2;PCR-single stranded conformation polymorism

    線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)存在于細(xì)胞質(zhì)的線粒體中,是細(xì)胞內(nèi)唯一的核外遺傳物質(zhì),由16569bp組成的雙鏈閉合環(huán)狀分子,含有自我復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯的遺傳體系。mtDNA含有37個(gè)編碼基因,包括編碼氧化磷酸化系統(tǒng)13個(gè)蛋白質(zhì)的亞單位、2個(gè)rRNA及22個(gè)tRNA的結(jié)構(gòu)基因。由于不受組蛋白保護(hù),修復(fù)功能不完善,很容易成為致癌物質(zhì)攻擊的標(biāo)靶。因此mtDNA的突變與細(xì)胞癌變之間的關(guān)系已經(jīng)越來越受到重視,成為研究的熱點(diǎn)。本文利用PCR-SSCP和基因測序法對mtDNA D-loop環(huán)HV2區(qū)的基因突變情況進(jìn)行了研究,并探討了突變在乳腺癌進(jìn)程中的作用。

    1 資料與方法

    1.1一般資料 取自2004年5月~2005年7月延邊大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤外科手術(shù)的患者,20例乳腺癌組織及相對應(yīng)的癌旁正常組織,手術(shù)后切除部分組織立即投入液氮中,后放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?0例乳腺癌患者年齡為36~73歲,平均(51.15±9.54)歲,所選標(biāo)本均經(jīng)病理確診為浸潤性導(dǎo)管癌。

    1.2方法

    1.2.1組織DNA提取 應(yīng)用小量組織DNA提取純化試劑盒進(jìn)行組織DNA的提取,并用1%瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白定量分析儀進(jìn)行DNA提取及純度檢測。選用GeneAmp 2400型PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列為HV2:5'-CTC ACG GGA GCT CTC CAT GC-3'(sense);5'-GAC TGT TAA AAG TGC ATA CCG C-3'(antisense);擴(kuò)增產(chǎn)物大小為403bp,在94℃預(yù)變性5分,之后進(jìn)入循環(huán),94℃30s,退火60℃30s,72℃30s,共35個(gè)循環(huán),后72℃延伸7分,4℃冷卻。2%瓊脂糖凝膠檢驗(yàn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

    1.2.2 PCR-SSCP分析 取PCR產(chǎn)物10μl與等量的2×上樣緩沖液,98℃變性5分,冰浴15 min。然后取該變性液5μl上樣于8%聚丙烯酰氨凝膠,220伏電壓電泳3 h后,進(jìn)行銀染觀察分析條帶:1%HNO3中氧化20分,蒸餾水中沖洗2次,20s/次;12mM硝酸銀中染色30分,蒸餾水中沖洗2次,20s/次;0.28mM碳酸鈉和0.04%甲醛混合液中顯色至色帶清晰;10%冰醋酸中終止染色固定5分。

    1.2.3基因測序 PCR-SSCP分析出現(xiàn)異常條帶者,用相應(yīng)的DNA再次擴(kuò)增,再經(jīng)過PCR-SSCP分析,仍出現(xiàn)異常條帶者,將PCR產(chǎn)物純化后基因測序分析。

    1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 11.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果用(x±s)表示,采用單樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析檢驗(yàn)各組資料間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.01為差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1組織DNA提取、PCR擴(kuò)增和PCR-SSCP結(jié)果 DNA樣本經(jīng)核酸蛋白分析儀檢測,OD260/OD280均≥1.7;HV2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測均顯示單一條帶,與DNA Marker所提供的片段定位相符,說明所檢測的片段上沒有明顯的插入和缺失。結(jié)果發(fā)現(xiàn)20例乳腺癌患者中有7例患者經(jīng)過PCR-SSCP分析出現(xiàn)異常區(qū)帶。

    2.2測序結(jié)果 本研究在7例乳腺癌組織mtDNA在乳腺癌組織mtDNA D-loop環(huán)HV2區(qū),有7處發(fā)生移碼突變(單個(gè)核插入或缺失)其余均為點(diǎn)突變,轉(zhuǎn)錄因子X(TFX,nt 233-260)有2例3次突變、Y(TFY,nt 276-303)有1例次突變。共有23差異位點(diǎn)位于重鏈起始區(qū)(OH,nt 110-441)。

    3 討論

    mtDNA與核基因組一樣也存在不穩(wěn)定,其形式以D-loop環(huán)區(qū)(CA)n和polyC長度不穩(wěn)定多見[1-2]。Aral等[3-4]用限制性內(nèi)切酶BsaXI找到了一個(gè)迅速檢測D310多態(tài)性的一種方法。甲狀腺癌[5]、乳腺癌、膀胱癌、及子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌中均存在D310區(qū)突變。本研究中11例標(biāo)本均發(fā)生微衛(wèi)星不穩(wěn)定,且都位于D310區(qū)域,D310是位于D-環(huán)區(qū)303~315的polyC序列,是實(shí)體腫瘤突變的熱點(diǎn),其突變形式多為單堿基插入或缺失。線粒體基因組不穩(wěn)定的原因可能是活性氧的破壞﹑滑鏈錯(cuò)配和不平衡交換。并且對甲狀腺癌的研究發(fā)現(xiàn)D310區(qū)突變與腫瘤的組織類型和分化程度無關(guān)。負(fù)責(zé)mtDNA復(fù)制的DNA聚合酶γ在4個(gè)核苷酸以上的多聚核苷酸區(qū)復(fù)制的忠實(shí)性低可能是D310區(qū)具有高突變率的主要原因。D310的長度變化可能通過影響mtDNA復(fù)制或使腫瘤細(xì)胞獲得選擇性生長優(yōu)勢而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。

    本研究使用PCR-SSCP方法檢測測了20例乳腺癌患者的癌組織和癌旁組織HV2區(qū),共發(fā)現(xiàn)32個(gè)多態(tài)性變化。除了與基因庫記載相重復(fù)的多態(tài)性變化外,又發(fā)現(xiàn)新的多態(tài)性位點(diǎn)10個(gè),可見HV2區(qū)是一個(gè)具有高度多態(tài)性的區(qū)域,而這種多態(tài)性反映了線粒體DNA的核苷酸順序是1981年Sanger等通過對西方人線粒體DNA測序得出的,因此在本研究中發(fā)現(xiàn)的新的多態(tài)性也可能是人種和地域差異的反映。

    通過統(tǒng)計(jì)分析mtDNA基因突變浸潤性導(dǎo)管癌與乳腺纖維腺瘤無顯著性,但是乳腺纖維腺瘤的突變率要高于浸潤性導(dǎo)管癌提示線粒體變異可能是婦科惡性腫瘤形成過程中的一個(gè)早期現(xiàn)象,并持續(xù)存在于癌癥演變的全過程。但由于本研究所測例數(shù)較少,尚有待于進(jìn)一步證實(shí)。因?yàn)闄z測腫瘤細(xì)胞中的mtDNA突變比檢測核DNA(nDNA)突變要簡單可靠,因此,檢測組織細(xì)胞中mtDNA突變有可能成為一種腫瘤輔助診斷方法。

    參考文獻(xiàn):

    [1]Parrella P,Seripa D,Matera MG,et al.Mutations of the D310 mitochondrial mononucleotide repeat in primary tumors and cytological speciments[J].Cancer Lett,2003,190(1):73-77.

    [2]Wei L,Zhao Y,Guo TK,et al.Association of mtDNA D-loop polymorphisms with risk of gastric cancer in Chinese population.[J].Pathol Oncol Res,2011,17(3):735-742.

    [3]Aral C,Kaya H,Celikel CA,et al.A novel approach for rapid screening of mitochondrial D310 polymorphism[J].BMC Cancer,2006,6(1):21-25.

    [4]Yu M,Shi Y,Zhang F,et al.Sequence variations of mitochondrial DNA D-loop region are highly frequent events in familial breast cancer[J].J Biomed Sci,2008,15(4):535-534.

    [5]Ding Z,Ji J,Chen G,et al.Analysis of mitochondrial DNA mutations in D-loop region in thyroid lesions.[J].Biochim Biophys Acta,2010,1800(3):271-274.

    編輯/金昊天

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