白蠟及白蠟高級(jí)烷醇對(duì)人真皮乳頭細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

王占娣，馮 穎，李 嫻，丁偉峰，馬李一，陳曉鳴

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)院資源昆蟲(chóng)研究所，國(guó)家林業(yè)局資源昆蟲(chóng)培育與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

白蠟及白蠟高級(jí)烷醇對(duì)人真皮乳頭細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

王占娣，馮 穎，李 嫻，丁偉峰，馬李一，陳曉鳴*

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)院資源昆蟲(chóng)研究所，國(guó)家林業(yè)局資源昆蟲(chóng)培育與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

白蠟；白蠟高級(jí)烷醇；吐溫80；人真皮乳頭細(xì)胞

白蠟蟲(chóng)(Ericeruspela(Chavannes))是一種重要的林業(yè)資源昆蟲(chóng)，其主要寄主植物為白蠟樹(shù)(FraxinuschinensisRoxb.)和女貞(LigustrumlucidumAit.)。白蠟蟲(chóng)雄性二齡幼蟲(chóng)在寄主植物上分泌的次生代謝物質(zhì)為白蠟。白蠟是我國(guó)的一種重要林副產(chǎn)品，采用氫化鋁鋰還原法或皂化法提煉后能夠得到高級(jí)烷醇[1-2]。高級(jí)烷醇能降低膽固醇，促進(jìn)細(xì)胞成熟[3-4]；但是白蠟和高級(jí)烷醇均不溶于水，限制了人們對(duì)白蠟及高級(jí)烷醇的開(kāi)發(fā)和利用。筆者通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)：白蠟和白蠟高級(jí)烷醇能溶解到含有吐溫80的水溶液中，但吐溫80易誘導(dǎo)細(xì)胞的脫粒作用[5]。因此，用吐溫作為白蠟及高級(jí)烷醇的增溶劑進(jìn)行生物活性篩選時(shí)需要考慮其對(duì)細(xì)胞的安全性。

人真皮乳頭細(xì)胞是毛囊生長(zhǎng)調(diào)節(jié)的重要細(xì)胞，它存在于毛囊的基底部位，調(diào)控毛囊的生長(zhǎng)、循環(huán)，指導(dǎo)毛基質(zhì)細(xì)胞分化形成毛干，決定毛發(fā)的直徑[6]。因此，人真皮乳頭細(xì)胞成為體外篩選脫發(fā)藥物的首選細(xì)胞?？疾焖幬飳?duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響通常采用的方法有MTT法和MTS 法，這2種方法均是采用比色法檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)，其原理是MTT和MTS試劑被活細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶產(chǎn)生的NADPH或NADH還原為有色的甲臜，而死細(xì)胞不能產(chǎn)生脫氫酶，因此，死細(xì)胞不能產(chǎn)生顏色?；罴?xì)胞數(shù)量越多，產(chǎn)生的甲臜越多，培養(yǎng)基的顏色越深[7]，表明細(xì)胞增殖越旺盛。相對(duì)于MTT法，MTS法檢測(cè)時(shí)間短，安全性高，重復(fù)性好[8]。因此，本文采用MTS法研究不同用量的吐溫80對(duì)人真皮乳頭細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，并考察在吐溫80安全用量范圍內(nèi)白蠟及白蠟高級(jí)烷醇在水中的增溶量對(duì)人真皮乳細(xì)胞的增殖作用，為白蠟及白蠟高級(jí)烷醇產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

白蠟及白蠟高級(jí)醇由本課題組提供；人真皮乳頭細(xì)胞(批號(hào)2365)、真皮乳頭細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(批號(hào)184)、包被液(批號(hào)361)、消化液(批號(hào)322)購(gòu)自美國(guó)Cell Applications。非那雄胺(M1122A)購(gòu)自大連美侖生物科技有限公司。吐溫80(分析純)購(gòu)自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。DMSO(批號(hào)：302A0328)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。倒置顯微鏡，日本基恩士，型號(hào)VHX-1000。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人真皮乳頭細(xì)胞保存在液氮中，臨用前從液氮中取出，在37℃水浴中融化后，轉(zhuǎn)移到用包被液處理過(guò)的T-75培養(yǎng)瓶中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜，第2天更換完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%，用消化液消化，采用臺(tái)盼藍(lán)法測(cè)定細(xì)胞的活力，備用。

1.3 測(cè)試藥液的配置

1.3.1 吐溫80水溶液 將吐溫80配制成濃度為5%(w/v)的水溶液，用滅菌水稀釋成濃度250.00、125.00、62.50、31.25、15.60 μg·mL-1水溶液。

1.3.2 白蠟水溶液 將白蠟溶解到5%吐溫水溶液中，制備成濃度1.00 mg·mL-1的白蠟水溶液(制備方法已申請(qǐng)專利)，用滅菌水稀釋成濃度3.10、6.30、12.50、25.00、50.00 μg·mL-1的白蠟水溶液；

1.3.3 白蠟高級(jí)烷醇水溶液 將白蠟高級(jí)烷醇溶解到1%吐溫水溶液中，制備成濃度2.00 mg·mL-1的白蠟高級(jí)烷醇水溶液(制備方法已申請(qǐng)專利)，用滅菌水稀釋成濃度31.20、62.50、125.00、250.00、500.00 μg·mL-1的白蠟高級(jí)烷醇水溶液。

非那雄胺溶解到DMSO中配置成濃度0.74 μg·mL-1的溶液。

將上述溶液與培養(yǎng)基按1∶9混勻后，備用。

1.4 吐溫80、白蠟及白蠟高級(jí)烷醇液對(duì)人真皮乳頭細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

同時(shí)采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SAS9.1統(tǒng)計(jì)軟件中的ANOVA分析不同處理組細(xì)胞的增殖率和抑制率的平均值±SE，P<0.05表明有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同用量吐溫80對(duì)人真皮乳頭細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

不同字母表示不同處理組間差異顯著(P<0.05,下同),A:陰性對(duì)照;B:非那雄胺;C:處理藥劑中吐溫80濃度1.56 μg·mL-1; D: 處理藥劑中吐溫80濃度3.12 μg·mL-1;E:處理藥劑中吐80濃度6.25 μg·mL-1; F:處理藥劑中吐溫80濃度12.50 μg·mL-1; G:處理藥劑中吐溫80濃度25.00 μg·mL-1。Different lowercase were significantly different according to One-way analysis of variance(P<0.05,the same below).A: Negative control; B: Finasteride; C: Treatment agent including 1.56 μg·mL-1 tween80; D: Treatment agent including 3.12 μg·mL-1 tween80;E: Treatment agent including 6.25 μg·mL-1 tween80; F: Treatment agent including 12.5 μg·mL-1tween80;G: Treatment agent including 25.00 μg·mL-1 tween80.圖1 不同處理吐溫80對(duì)人真皮乳頭細(xì)胞增殖的影響Fig.1 The proliferation of human dermal papilla cells in difference tween80

2.2 白蠟對(duì)真皮乳頭細(xì)胞的增殖作用

A:陰性對(duì)照;B:非那雄胺;C:處理藥劑中吐溫80和白蠟的濃度分別為1.56、0.31 μg·mL-1;D:處理藥劑中吐溫80和白蠟的濃度分別為3.12、0.63 μg·mL-1;E:處理藥劑中吐溫80和白蠟的濃度分別為6.25、1.25 μg·mL-1;F:處理藥劑中吐溫80和白蠟的濃度分別為12.5、2.50 μg·mL-1;G:處理藥劑中吐溫80和白蠟的濃度分別為25.00、5.00 μg·mL-1.A: Negative control; B: Finastride; C: Treatment agent including 1.56 μg·mL-1 tween 80 and 0.31 μg·mL-1 white wax; D: Treatment agent including 3.12 μg·mL-1 tween80 and 0.63 μg·mL-1 white wax; E: Treatment agent including 6.25 μg·mL-1 tween80 and 1.25 μg·mL-1 white wax; F: Treatment agent including 12.5 μg·mL-1 tween80 and 2.50 μg·mL-1 white wax; G: Treatment agent including 25.00 μg·mL-1 tween80 and 5.00 μg·mL-1 white wax.圖2 白蠟對(duì)人真皮乳頭細(xì)胞的增殖作用Fig.2 The proliferation of human dermal papilla cells in difference white wax

2.3 白蠟高級(jí)烷醇對(duì)人真皮乳頭細(xì)胞的增殖作用

A:陰性對(duì)照; B:非那雄胺;C:處理藥劑中吐溫80和白蠟高級(jí)烷醇的濃度分別為1.56、3.12 μg·mL-1;D:處理藥劑中吐溫80和白蠟高級(jí)烷醇的濃度分別為3.12、6.25 μg·mL-1;E:處理藥劑中吐溫80和白蠟高級(jí)烷醇的濃度分別為6.25、12.5 μg·mL-1;F:處理藥劑中吐溫80和白蠟高級(jí)烷醇的濃度分別為12.50、25.00 μg·mL-1;G:處理藥劑中吐溫80和白蠟高級(jí)烷醇的濃度分別為25.00、50.00 μg·mL-1.A: Negative control; B: Finastride;C: treatment agent including 1.56 μg·mL-1 tween 80 and 3.12 μg·mL-1 white wax; D: treatment agent including 3.12 μg·mL-1 tween 80 and 6.25 μg·mL-1 white wax; E: treatment agent including 6.25 μg·mL-1 tween 80 and 12.5 μg·mL-1 white wax; F: treatment agent including 12.5 μg·mL-1 tween 80 and 25.00 μg·mL-1 white wax; G: treatment agent including 25.00 μg·mL-1 tween 80 and 50.00 μg·mL-1 white wax.圖3 白蠟高級(jí)烷醇對(duì)人真皮乳頭細(xì)胞的增殖作用Fig.3 The proliferation of human dermal papilla cells in difference policosanol of white wax

3 討論

4 結(jié)論

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(責(zé)任編輯：張 玲)

Effect of White Wax and Policosanol from White Wax Tween Aqueous Solution on HFDPCS

WANGZhan-di,FENGYing,LIXian,DINGWei-feng,MALi-yi,CHENXiao-ming

(Research Institute of Resources Insects, Chinese Academy of Forestry, Key laboratory of Cultivating and Utilization of Resources Insects of State Forestry Administration, Kunming 650224, Yunnan, China)

[Objective]To investigate the cell proliferation effect of white wax and policosanol from white wax tween aqueous solution in human dermal papilla cells (HFDPCs). [Method]The cell seeding density was decided by Trypan blue test. Next day, change fresh medium which including treatment agent for HFDPCs. MTS assay was used to compare the proliferation effects of different concentrations of tween80, white wax and policosanol from white wax tween80 aqueous solutions on HFDPCs tween aqueous solutionafter 48 h.[Result]HFDPCs could grow wellwhenthe concentration of tween 80 was 1.56-6.25 μg·mL-1. In the concentration range, white wax (solubility in water was from 0.31-1.25 μg·mL-1) and policosanol from white wax (solubility in water was 3.125-12.5 μg·mL-1) tween aqueous solutions had the cell proliferation effect for HFDPCs. In which, the white wax aqueous solution including 6.25 μg·mL-1tween80 and 1.25 μg·mL-1white wax, and the policosanol aqueous solution which including 6.25 μg·mL-1tween80 and 12.5 μg·mL-1policosanol increased significantly the proliferation of HFDPCs comparing with finasteride.[Conclusion]The selected concentration of tween80 is below 6.25 μg·mL-1in HFDPCs culture when tween80 is used as a solubilizing agent. In the optimistic concentration range of tween80, the white wax and policosanol from white wax could increase the proliferation of HFDPCs remarkably.

white wax; policosanol from white wax; tween80; human dermal papilla cells

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.01.006

2016-09-19

國(guó)家公益性林業(yè)科研專項(xiàng)(201204602);國(guó)家863項(xiàng)目(2014AA021800)

王占娣(1981—)，女，河北任丘，在讀博士，主要從事資源昆蟲(chóng)研究.E-mail: zhdwang@163.com.
* 通訊作者.

S899.1

A

1001-1498(2017)01-0041-05