高血壓前期合并糖尿病絕經(jīng)前女性血管內(nèi)皮功能改變的研究

楊震+姚順+曾海+濤蘇晨++陶軍

摘要：目的 探討糖尿病對高血壓前期的絕經(jīng)前女性內(nèi)皮功能的影響。方法 選擇40例年齡 （45.2±4.6）歲的人群作為研究對象，分為兩組：高血壓前期的絕經(jīng)前女性患者（20例）與高血壓前期合并糖尿病的絕經(jīng)前女性（20例），使用超聲技術(shù)評估血管舒張功能，通過使用流式細(xì)胞儀測定四組 CD34 和 KDR 雙標(biāo)陽性循環(huán)EPCs水平，ac-LDL 及 lectin 熒光標(biāo)記方法評估體外培養(yǎng)EPCs數(shù)量，檢測EPCs的遷移和增殖能力，同時研究血管舒張功能與EPC功能可能的關(guān)系。結(jié)果 高血壓前期的絕經(jīng)前女性相比合并糖尿病的高血壓前期絕經(jīng)前女性，內(nèi)皮依賴的血流介導(dǎo)血管舒張功能（FMD）水平明顯較高（P<0.05），而硝酸甘油酯介導(dǎo)的血管舒張功能（GMD）在兩組受試者中未見明顯差異（P>0.05）。與高血壓前期的絕經(jīng)前期女性相比，循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）水平和培養(yǎng)的EPCs數(shù)量較合并有糖尿病的高血壓前期絕經(jīng)前女性明顯要高（P<0.05）。循環(huán)EPCs的遷移和增殖功能在合并有糖尿病的高血壓前期的絕經(jīng)前女性要明顯較非糖尿病的絕經(jīng)前女性降低（P<0.05）。并且，F(xiàn)MD與循環(huán)EPCs水平呈明顯線性相關(guān)，（r=0.56，P<0.05）及細(xì)胞培養(yǎng)試驗（r=0.68，P<0.05），同時，F(xiàn)MD還與EPC遷移和增殖能力呈線性相關(guān)（r=0.61，P<0.05；r=0.57，P<0.05）。結(jié)論 以上結(jié)果說明糖尿病合并高血壓前期的絕經(jīng)前女性體內(nèi)EPCs數(shù)量及功能以及血管舒張功能均下降，表現(xiàn)為內(nèi)皮損傷修復(fù)能力降低及內(nèi)皮功能下降，提示了該表現(xiàn)是血壓升高及糖尿病的共同效應(yīng)所致。

關(guān)鍵詞：內(nèi)皮祖細(xì)胞；高血壓前期；絕經(jīng)前期；糖尿病

高血壓前期是正常血壓與臨床高血壓之間的血壓升高的過渡階段，該階段將增加心血管事件的發(fā)生，處于高血壓前期的患者往往在未確診臨床高血壓前已有潛在的靶器官損害。大量實驗資料表明，來源于骨髓、外周血和臍血中的內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells， EPCs）能夠有效修復(fù)血管內(nèi)皮損傷、參與促進(jìn)血管新生以及改善內(nèi)皮功能。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，心血管事件危險因素如高血壓前期，EPCs的數(shù)量和活性會下降，這可能導(dǎo)致內(nèi)皮損傷的發(fā)生與發(fā)展[1]。大量研究表明，糖尿病會導(dǎo)致心腦血管事件并發(fā)癥的風(fēng)險增加，這可能與糖尿病導(dǎo)致的血管內(nèi)皮損傷及內(nèi)皮功能障礙有關(guān)。

我們前期研究表明，絕經(jīng)前女性體內(nèi)EPCs維持在較高水平，這與體內(nèi)的一定水平的雌激素相關(guān)，同時表明了絕經(jīng)前女性血管損傷修復(fù)能力及內(nèi)皮功能維持在一定水平。然而目前尚不清楚糖尿病合并血壓升高是否會對該類患者血管內(nèi)皮功能造成更明顯的不利效應(yīng)，所以該研究旨在明確糖尿病合并血壓升高對該類患者內(nèi)皮功能的具體影響，為臨床加強(qiáng)篩查與防治高血壓前期合并糖尿病的絕經(jīng)前女性患者提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1材料與試劑 CD34流式細(xì)胞熒光抗體購于BD公司，EGM-2培養(yǎng)基購于Clonetics公司，纖維連接蛋白購于Hematologic Technologies公司，ac-LDL購于Molecular Probes公司，Lectin購于Sigma公司，二苯基四氮唑溴鹽（MTT）購自Fluka公司。

1.2研究對象 我們招募了40例年齡 （45.2±4.6）歲志愿者，分為兩組：絕經(jīng)前高血壓前期的女性患者（20例）及高血壓前期合并糖尿病的絕經(jīng)前女性（20例）。高血壓前期按照 JNC8 指南的標(biāo)準(zhǔn)：收縮壓120～139 mmHg 和/或舒張壓80～89 mmHg。依據(jù)美國糖尿病協(xié)會專家委員會報告指南，對新近診斷且未進(jìn)行藥物治療的高血壓前期合并2型糖尿病的女性進(jìn)行診斷。并且排除了心血管疾病、惡性腫瘤、感染或炎癥性疾病，以避免對循環(huán)EPCs數(shù)量和功能產(chǎn)生影響；孕婦、哺乳期婦女、子宮切除及吸煙者不納入本研究。所有志愿者通過詢問病史、詳細(xì)的體格檢查和實驗室檢查。

1.3流式細(xì)胞儀測定循環(huán)EPCs水平 取200 μl外周血與FLK-1流式細(xì)胞熒光抗體一抗孵育20 min，再加入FLK-1二抗孵育20 min，之后加入CD34 流式細(xì)胞熒光抗體孵育20 min。最后將紅細(xì)胞溶解，剩余細(xì)胞用20 g/L多聚甲醛固定，以流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，CD34和KDR雙陽性細(xì)胞為循環(huán)EPCs。

1.4熒光標(biāo)記方法評估培養(yǎng)EPCs數(shù)量 取各組外周血約20 ml置于肝素管中，并以PBS稀釋。加入Ficoll-Pague分離液后離心，小心提取血清和Ficoll分離液交界處的單個核細(xì)胞層，置于以纖維連接蛋白預(yù)襯的EGM-2培養(yǎng)基中。將上述含有外周血單個核細(xì)胞的培養(yǎng)基置于含有體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃孵箱中培養(yǎng)，在倒置熒光顯微鏡下動態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。細(xì)胞培養(yǎng)2 w后取一部分貼壁細(xì)胞在一定濃度乙?；兔芏戎鞍兹芤褐蟹跤? h，之后20 g/L多聚甲醛固定，以一定濃度凝集素抗體溶液孵育1 h，并置于熒光顯微鏡下觀察拍片，紅色和綠色雙染色細(xì)胞為EPCs。

1.5 EPC遷移能力檢測 將含 50 ng/ml VEGF 的DMEM 培養(yǎng)液加入改良 Boyden 小室的下室， 用 2.5 g/L 胰酶消化貼壁細(xì)胞，懸浮于DMEM 培養(yǎng)液中。將含50 ng/ml懸浮在 500ul DMEM 培養(yǎng)液注入上室，培養(yǎng)24 h后，輕輕刮去濾膜上面的未遷移細(xì)胞，用甲醇固定，Giemsa 溶液染色，計數(shù)遷移的細(xì)胞。

1.6 EPC能力增殖檢測 EPC培養(yǎng)7 d后，如上述用0.25%胰酶消化貼壁細(xì)胞，懸浮于DMEM培養(yǎng)液中。將相同數(shù)量的EPC接種到包被有人纖維連接蛋白96孔培養(yǎng)板，每孔加10μL MTT （5 g/L），培養(yǎng)4 h后，棄去上清液，再加入二甲基亞砜（150 μL/孔）充分振蕩10 min后，在酶標(biāo)儀下于波長490 nm處測A值。

1.7血管舒張功能檢測 通過高分辨率超聲，使用5～12 MHz的線性探頭，基于HDI5000系統(tǒng)（Wshington，USA），使用5-12 MHz頻率探頭的線性陣列傳感器對肱動脈的血流介導(dǎo)的血管舒張功能（FMD）進(jìn)行測量。受試者仰臥位休息15 min后，對其肘窩附近20～100 mm的肱動脈進(jìn)行測量。用血壓計對受試者前臂上端施加250 mmHg的壓力，持續(xù)5 min，對血壓計進(jìn)行放氣，之后在反應(yīng)性充血55～65 s后通過對平均舒張期管徑增加百分比對FMD進(jìn)行測定。15 min后，給予受試者450 μg硝酸甘油舌下含服，5 min后再對硝酸甘油介導(dǎo)的血管舒張（GMD）管徑進(jìn)行測定。

1.8主要觀察指標(biāo) 觀察兩組循環(huán)EPCs的數(shù)量，檢測EPCs的遷移和增殖能力，檢測FMD及分析其與EPCs的關(guān)系。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 11.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，圖表結(jié)果以（x±s）表示；組間差異采用方差分析及兩兩比較，F(xiàn)MD和EPCs數(shù)量或功能增加水平之間關(guān)系采用單因素直線相關(guān)分析，P<0.05 為差異表示有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1兩組FMD與GMD比較 超聲技術(shù)檢測顯示，與非糖尿病高血壓前期的絕經(jīng)前女性相比，糖尿病患者FMD水平明顯下降（P<0.05）。然而， GMD水平在兩組患者中沒有明顯差異（P>0.05）。

2.2兩組循環(huán)EPCs數(shù)量比較 與高血壓前期的絕經(jīng)前期女性相比，循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）水平和培養(yǎng)的EPCs數(shù)量較合并有糖尿病的高血壓前期絕經(jīng)前女性明顯要高（P<0.05）。

2.3兩組循環(huán)EPCs功能比較 循環(huán)EPCs的遷移和增殖功能在合并有糖尿病的高血壓前期的絕經(jīng)前女性要明顯較非糖尿病的絕經(jīng)前女性降低（P<0.05）。

2.4兩組FMD與循環(huán)EPCs數(shù)量或功能的關(guān)系 通過流式細(xì)胞儀分析可以發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MD與循環(huán)EPCs水平呈明顯線性相關(guān)（r=0.56，P<0.05）及與培養(yǎng)EPCs數(shù)量呈線性相關(guān)（r=0.68，P<0.05），同時，F(xiàn)MD還與EPC遷移和增殖能力呈明顯線性相關(guān)（r=0.61，P<0.05；r=0.57，P<0.05）。

3 討論

本文的研究結(jié)果表明，高血壓前期合并糖尿病將使絕經(jīng)前女性患者內(nèi)皮功能明顯受損，患者體內(nèi)循環(huán)EPCs水平下降，內(nèi)皮依賴性血流介導(dǎo)的血管舒張功能降低，提示患者血管內(nèi)皮損傷修復(fù)能力下降。本研究通過EPCs水平、培養(yǎng)的EPCs數(shù)量，F(xiàn)MD、GMD以及FMD與EPC數(shù)量和功能的關(guān)系對血管內(nèi)皮功能進(jìn)行評估。近來研究表明，在骨髓和外周血中存在能分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞-內(nèi)皮祖細(xì)胞，是血管內(nèi)皮損傷修復(fù)重要的細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制[2]。在血管內(nèi)皮損傷發(fā)生后，內(nèi)皮祖細(xì)胞能歸巢至損傷血管內(nèi)皮局部，再生損傷局部的內(nèi)皮細(xì)胞，在心血管危險因素如動脈粥樣硬化，肥胖，抽煙影響下，EPCs水平與功能則會下降。FMD是高分辨率超聲技術(shù)實現(xiàn)的無創(chuàng)檢測內(nèi)皮功能受損的精確度、可重復(fù)性高的檢測指標(biāo)。本研究中發(fā)現(xiàn)FMD與EPCs水平及功能呈線性相關(guān)，提示了內(nèi)源性血流介導(dǎo)的血管舒張功能與內(nèi)皮修復(fù)能力具有明顯相關(guān)性。

高血壓前期患者體內(nèi)循環(huán)EPCs數(shù)量減少，遷移和增殖能力減弱，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞得不到及時修復(fù)及更新，血管內(nèi)皮受損修復(fù)能力下降[3]，最終加重高血壓血管損傷及靶器官損害的發(fā)生。然而高血壓前期的絕經(jīng)前期女性體內(nèi)循環(huán)EPCs的數(shù)量和活性卻維持在正常水平，這與體內(nèi)維持一定水平的雌激素有關(guān)[4]。目前尚不清楚糖尿病合并血壓升高是否會對該類患者血管內(nèi)皮功能造成更明顯的不利效應(yīng)，因此，本研究是首次探討糖尿病合并高血壓前期絕經(jīng)前女性的血管內(nèi)皮功能改變的研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病合并高血壓前期的女性內(nèi)皮功能下降，提示了注重篩查此類患者，及時控制及減少心血管疾病危險因素，改善血管舒張功能，提高循環(huán)EPCs的數(shù)量和活性繼而修復(fù)損傷的血管內(nèi)皮，對于該類患者防治心血管疾病具有非常重要的意義。

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編輯/蔡睿琳