珠子參β-香樹(shù)素合成酶基因的克隆和生物信息學(xué)分析

吳亞運(yùn) 趙小龍 陳平 張紹鵬

（武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，武漢 430070）

珠子參β-香樹(shù)素合成酶基因的克隆和生物信息學(xué)分析

吳亞運(yùn) 趙小龍 陳平 張紹鵬

（武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，武漢 430070）

β-香樹(shù)素合成酶（beta-amyrin synthase βAS）是定向分流齊墩果烷型皂苷和達(dá)瑪烷型皂苷的限速酶，對(duì)藥用植物三萜皂苷的生物合成具有重要的調(diào)控作用。基于珠子參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中βAS轉(zhuǎn)錄本序列設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR方法從珠子參根狀莖中克隆得到βAS基因全長(zhǎng)cDNA序列，命名為pjβAS。經(jīng)測(cè)序鑒定該基因長(zhǎng)度為2 655 bp，包含一個(gè)2 286 bp的完整開(kāi)放閱讀框，編碼761個(gè)氨基酸，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的登錄號(hào)為KX254566。生物信息學(xué)分析顯示，其編碼蛋白分子量為87.90 kD，理論等電點(diǎn)（pI）5.84，不含跨膜區(qū)，為非分泌蛋白，含有38處磷酸化位點(diǎn)，主要于葉綠體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)揮生理作用；二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)其α-螺旋占39.82%、延伸鏈16.56%、β-轉(zhuǎn)角10.38%、無(wú)規(guī)則卷曲33.24%，具有DCTAE、QW（QXXXXXW）和MWCRCY3個(gè)氧化鯊烯環(huán)化酶（OCS）基因家族特征保守基序；pjβAS蛋白與竹節(jié)參（AKN23431.1）序列的一致性為100%，系統(tǒng)進(jìn)化分析中與竹節(jié)參（AKN23431.1）、西洋參（AGG09939.1）、柴胡（ABY90140.2）劃為同一分支。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析pjβAS在珠子參不同組織中的相對(duì)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)pjβAS基因在花、葉、莖、根狀莖中均有表達(dá)，在葉中表達(dá)量最高，根狀莖中表達(dá)量最低。

珠子參；β-香樹(shù)素合成酶；三萜皂苷；基因克??；生物系信息學(xué)分析

珠子參又名竹節(jié)三七、血參、七葉子，為五加科人參屬植物珠子參（P. japonicus var. major）的干燥根莖［1］，分布于云南、四川、陜西、湖北等省的高海拔地區(qū)，在我國(guó)西部地區(qū)少數(shù)民族中運(yùn)用十分廣泛，是一味非常珍貴的傳統(tǒng)中藥［2］。珠子參含有三萜類(lèi)、多糖、揮發(fā)油等成分，其中三萜類(lèi)成分三萜皂苷是珠子參中研究最多，最主要的有效成分［3］。三萜皂苷是一類(lèi)由三萜苷元與糖或糖醛酸組合而成的植物次生代謝產(chǎn)物，在改善缺血性損傷，提高免疫力，抗炎，抗腫瘤等方面效果明顯［4］。此外，三萜皂苷兼具多種生物學(xué)活性，如充當(dāng)植物抗菌素、活性抗氧劑和調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)等［5，6］。三萜類(lèi)化合物突出的藥理作用和生理活性備受研究人員關(guān)注。

在植物體內(nèi)三萜類(lèi)化合物的生物合成是多種生物酶參與調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，大體可分為前體物的合成、萜類(lèi)骨架的構(gòu)建和環(huán)上官能團(tuán)的修飾［7］。其中，氧化鯊烯環(huán)化酶（oxido squalene cyclase，OCS）基因家族催化2，3-氧化鯊烯形成不同類(lèi)型的三萜碳環(huán)，是整個(gè)合成過(guò)程中的關(guān)鍵步驟［8］。β-香樹(shù)素合成酶（beta-amyrin synthase，βAS）是OCS家族成員，能催化2，3-氧化鯊烯環(huán)化合成β-香樹(shù)脂，后者通過(guò)一系列生化反應(yīng)最終生成齊墩果烷型皂苷。在三萜皂苷合成下游途徑中，βAS是指向分流達(dá)瑪烷型皂苷和齊墩果烷型皂苷的關(guān)鍵限速酶，也是維持植物體內(nèi)三萜化合物多樣性的因素之一［9］。目前已從人參［10］、甘草［11］、擬南芥［12］等植物中成功克隆得到編碼βAS的cDNA序列，但尚未見(jiàn)關(guān)于珠子參βAS基因克隆及其生物信息學(xué)分析的報(bào)道。

本課題組借助第二代測(cè)序技術(shù)得到珠子參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)［13］，從中篩選出βAS基因核酸拼接片段，采用反轉(zhuǎn)錄PCR獲得βAS基因全長(zhǎng)cDNA序列，對(duì)其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析pjβAS基因在珠子參花、葉、莖、根狀莖4個(gè)組織中的表達(dá)情況，旨為闡明該基因在珠子參皂苷生物合成途徑中的分子作用機(jī)制和表達(dá)調(diào)控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)植物6年生珠子參樣本采自湖北恩施華中藥用植物園，在相同生長(zhǎng)環(huán)境下取新鮮珠子參植株，經(jīng)無(wú)菌水洗凈后分離花、葉、莖、根狀莖組織，由液氮快速冷凍后置于-80℃保存。

植物總RNA快速提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收純化試劑盒購(gòu)自北京艾德萊（Aidlab）生物科技有限公司；PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒、TaKaRa LA Taq?試劑盒、PMD18-T Vector、DL5000 DNA Marker、E. coil DH5α感受態(tài)細(xì)胞、MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自大連寶生物（TaKaRa）工程有限公司；IPTG、X-Gal購(gòu)自美國(guó)普洛麥格（Promega）公司；MG96G PCR儀購(gòu)自杭州朗基（LongGene）科學(xué)儀器有限公司；LG 2020凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自上海美吉（Majorbio）生物醫(yī)藥科技有限公司；熒光定量PCR儀為美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)（Applied Biosystems）公司生產(chǎn)的ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄 分別取珠子參花、葉、莖、根狀莖組織樣本0.1 g于液氮中充分研磨，利用北京艾德萊植物總RNA快速提取試劑盒提取RNA，采用超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度，1%瓊脂糖凝聚膠電泳檢測(cè)RNA完整性。取珠子參花、葉、莖、根狀莖組織總RNA各1 μg，按照TaKaRa公司PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，分別合成cDNA第一鏈，于-20℃保存。

1.2.2 pjβAS基因的克隆 通過(guò)珠子參轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，得到βAS基因核酸拼接序列，利用NoePrimer2.03和Primer6.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物βAS-F：5'-GAGCTCAATTTTTGTTTGAA GATGTGGAG-3'和 βAS-R：5'-GCGTCTGAACATTT ACTACAGTGCATGC-3'，以珠子參根狀莖cDNA為模板，運(yùn)用TaKaRa LA Taq?試劑盒進(jìn)行珠子參βAS基因全長(zhǎng)序列PCR擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為2 655 bp。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：TaKaRa Ex Taq（5 U/μL）0.25 μL，2×Ex Taq Buffer 5 μL，dNTP Mixture 4 μL，cDNA 5 μL，βAS-F和βAS-R（10 μmoL/L） 各2 μL，ddH2O 31.75 μL。PCR反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性5 min；98℃變性1 min，68℃退火25 s，72℃延伸1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。1.5%瓊脂糖凝聚膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)PCR擴(kuò)增所得特異目的片段進(jìn)行回收純化。將回收所得DNA片段與pMD18-T載體連接后，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在加有氨芐抗生素的LB平板上進(jìn)一步培養(yǎng)，經(jīng)藍(lán)白斑篩選、陽(yáng)性克隆菌落擴(kuò)大培養(yǎng)、質(zhì)粒抽提后送往上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.3 pjβAS基因的生物信息學(xué)分析 依據(jù)pjβAS基因測(cè)序結(jié)果，利用DNAstar中EditSeq軟件獲取基因序列的開(kāi)放閱讀框（Open reading frame，ORF）和其所編碼氨基酸序列；使用在線(xiàn)工具BLAST（http://blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），將獲得的核苷酸和氨基酸序列與NCBI中已登錄的其它物種進(jìn)行序列比對(duì)和同源性分析，并利用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；借助ExPASy網(wǎng)站中在線(xiàn)工具Protparam（http://www.expasy.ch/tools/protaparam.html）進(jìn)行蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)預(yù)測(cè)；蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)采用WOLF SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html）；運(yùn) 用 在線(xiàn) 工 具 TMHMM 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/service/ TMHMM-2.0/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)域；蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位分析運(yùn)用在線(xiàn)程序WOLF PSORT（http:// wolfpsort.org/）；蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)使用NetPhos 2.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）；蛋白質(zhì)序列信號(hào)位點(diǎn)分析使用Signal P 4.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/service/SignalP/）；采用在線(xiàn)工具SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/） 進(jìn)行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)建模。

1.2.4 pjβAS基因在珠子參不同器官中的表達(dá)分析 運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)珠子參花、葉、莖、根狀莖中pjβAS基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。依據(jù)pjβAS基因測(cè)序結(jié)果，運(yùn)用Oligo7引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)定量分析引物pjβAS-F：5'-AAGATGTGGAGGCTAA-3'和pjβAS-R：5'-CAGAAATGGAGACGAG-3'；分 別以珠子參花、葉、莖、根狀莖的cDNA為模板；采用SYBR Green I法，利用TaKaRa公司SYBR?Premix Ex TaqTM熒光定量試劑盒，在應(yīng)用生物系統(tǒng)（Applied Biosystems） 公 司ABI 7500熒 光 定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系（20 μL）：SYBR Premix Ex TaqTMII 10 μL，ROX Reference Dye II 0.6 μL，pjβAS-F和pjβAS-R（10 umoL/L） 各0.3 μL，60 ng/μL的cDNA模 板2 μL，RNase Free H2O 6.8 μL。每個(gè)反應(yīng)進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)，并設(shè)置一例陰性對(duì)照。反應(yīng)條件：96℃預(yù)變性3min；96℃變性20 s，60℃退火35 s，72℃延伸50 s，進(jìn)行 40個(gè)循環(huán)。本次實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)選用β-actin（肌動(dòng)蛋白）基因作為內(nèi)參基因，內(nèi)參引物為β-actin-F：5'-GGCATCACACTTTCTACAACG-3'和 β-actin-R：5'-GGCAGGAACATTAAAGGTTTC-3'［14］， 以 2-ΔΔct法計(jì)算pjβAS基因的相對(duì)表達(dá)量［15］。

2 結(jié)果

2.1 總RNA提取結(jié)果的檢測(cè)

通過(guò)1%瓊脂糖凝聚膠電泳對(duì)珠子參花、葉、莖、根狀莖總RNA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（圖1）顯示，3條特征條帶完整清晰，其中28S rRNA條帶與18S rRNA條帶亮度比例約為2∶1，且無(wú)拖帶現(xiàn)象發(fā)生，表明總RNA未發(fā)生降解完整性良好。由超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果表明，各組織器官總RNA的A260/A280值介于1.8-1.9之間、A260/A230值介于2.0-2.1之間，表明總RNA純度高，無(wú)多酚類(lèi)有機(jī)物和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)污染，滿(mǎn)足后續(xù)分子實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 珠子參不同組織器官總RNA電泳結(jié)果

2.2 pjβAS基因PCR擴(kuò)增檢測(cè)

以珠子參根狀莖cDNA為模板，βAS-F和βAS-R為引物，進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝聚膠電泳檢測(cè)，結(jié)果（圖2）顯示，獲得一條長(zhǎng)度約為2 700 bp的明亮條帶，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小基本一致。初步判定為珠子參pjβAS基因全長(zhǎng)片段，由測(cè)序分析進(jìn)一步鑒定。

圖2 pjβAS基因全長(zhǎng)序列PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 pjβAS基因測(cè)序結(jié)果和生物信息學(xué)分析

測(cè)序結(jié)果經(jīng)引物序列的剔除和片段拼接，獲得了1個(gè)大小為2 655 bp的cDNA序列片段。經(jīng)EditSeq軟件分析，該序列包含一段2 286 bp的完整開(kāi)放閱讀框，編碼761個(gè)氨基酸組成的蛋白，起始密碼子為ATG，終止密碼子為T(mén)GA，5'-UTR與3'-UTR的長(zhǎng)度分別為98 bp和271 bp。Protparam推測(cè)pjβAS蛋白的分子式為C3980H5980N1042O1121S48，相對(duì)分子質(zhì)量為87.90 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為5.84，帶正電氨基酸殘基（Arg+Lys）為74，帶負(fù)電氨基酸殘基（Asp+Glu）為91。該蛋白平均親水性系數(shù)為-0.360，不穩(wěn)地系數(shù)為49.38，脂肪系數(shù)為75.14。pjβAS蛋白包含20種基本氨基酸，其中含量最高的是Glu（7.0%），含量最低的是Cys（2.4%）。

將測(cè)序得到的核苷酸序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示，該序列與竹節(jié)參 Panax japonicus C. A. Mey（KP658156.1）、 西 養(yǎng) 參 Panax quinquefolius（JX262290.1）、柴胡 Bupleurum chinense DC（EU400220.2）、遼東楤木 Aralia elata（Miq.）Seem（HM219225.1）和刺揪 Kalopanax septemlobus（Thunb.）Koidz（KT150523.1）全長(zhǎng)序列相似度分別為99%、99%、86%、83%和83%，說(shuō)明克隆獲得的序列可能為珠子參pjβAS基因。對(duì)推衍的珠子參pjβAS氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果（圖3）顯示，該序列與竹節(jié)參 Panax japonicus C. A. Mey（AKN23431.1）、西洋參 Panax quinquefolius（AGG09939.1）、柴胡 Bupleurum chinense DC（ABY-90140.2）、遼東楤木 Aralia elata（Miq.）Seem（ADK-12003.1）和刺揪 Kalopanax septemlobus（Thunb.）Koidz（ALO23119.1）氨基酸序列的一致性分別為100%、99%、89%、87%和85%，比對(duì)結(jié)果經(jīng)篩選得到3段OSC基因家族特征保守氨基酸序列DCTAE、QW（QXXXXXW）和MWCRCY。由此推測(cè)，本研究成功獲得了一個(gè)新的珠子參/氧化鯊烯環(huán)化酶基因家族成員的全長(zhǎng)cDNA序列，命名為pjβAS，將序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得的登錄號(hào)為KX254566。

2.4 pjβAS基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位、信號(hào)肽和跨膜區(qū)分析

使用WOLF PSORT程序預(yù)測(cè)pjβAS基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位情況，結(jié)果如下：葉綠體的定位系數(shù)為5.0（chlo5.0）；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的定位系數(shù)為3.0（E.R 3.0）；線(xiàn)粒體的定位系數(shù)為2.0（mito2.0）；細(xì)胞核的定位系數(shù)為1.5（uncl1.5）；細(xì)胞骨架的定位系數(shù)為1.5（cysk_uncl1.5）；質(zhì)體的定位系數(shù)為1.0（plas1.0）。Signal P4.0在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)該蛋白無(wú)信號(hào)肽，屬非分泌蛋白。在線(xiàn)工具TMHMM2.0預(yù)測(cè)該蛋白幾乎不含跨膜區(qū)，為非跨膜蛋白（圖4）。

2.5 pjβAS基因編碼蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

運(yùn)用NetPhos程序?qū)jβAS基因編碼蛋白的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果（圖5）顯示，該蛋白含有14處潛在的絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，8處潛在的蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，16處潛在的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。

2.6 pjβAS基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用SOPMA在線(xiàn)軟件對(duì)pjβAS基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果（圖6）顯示，該蛋白由39.82%α-螺旋，16.56%延伸鏈，10.38%β-轉(zhuǎn)角和33.24%無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，表明α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲是主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件。使用SWISS-MODEL工具，運(yùn)用同源建模法對(duì)pjβAS基因編碼蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)建模（圖7）。

圖3 珠子參pjβAS基因編碼蛋白的多序列比對(duì)

2.7 pjβAS基因編碼蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了解pjβAS蛋白在自然界中大致的進(jìn)化關(guān)系，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出與pjβAS基因編碼蛋白同源性較高的16種植物的βAS蛋白序列，分別為竹節(jié)參 Panax japonicus C. A. Mey（AKN23431.1）；西 洋 參 Panax quinquefolius（AGG09939.1）； 柴胡 Bupleurum chinense DC（ABY90140.2）；遼東 楤木 Aralia elata（Miq.）Seem（ADK12003.1）；刺 揪Kalopanax septemlobus（Thunb.）Koidz（ALO23119.1）；番茄 Lycopersicon esculentum Mill（NP_001234604.1）；麻花艽 Gentiana straminea Maxim（AHX97777.1）；黃花蒿 Artemisia annua Linn（ACA13386.1）；綠玉樹(shù)Euphorbia tirucalli L.（BAE43642.1）；百脈根 Lotus corniculatus L.（BAE53429.1）；可可 Theobroma cacao（XP_007023608.1）；大豆 Glycine max（Linn.）Merr（AHI17180.1）； 南 非 醉 茄 Ashwagandha（AGA17940.1）；烏拉爾甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch（ADE88148.1）；蒺 藜 苜 蓿 Medicago truncatula（XP_003604121.1）；紫 菀 Aster tataricus L. f.（AAX147161）；由ClustalW序列比對(duì)后，通過(guò)MEGA6.0軟件采用NJ法，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果（圖8）顯示，pjβAS基因與同屬植物竹節(jié)參、西洋參和傘型科植物柴胡的βAS基因親緣性最近，劃歸于同一分支，與菊科植物黃花蒿和紫菀在進(jìn)化水平上遺傳距離較近，而與豆科植物大豆、烏拉爾甘草、百脈根和蒺藜苜蓿遺傳距離較遠(yuǎn)。

圖4 pjβAS基因編碼蛋白跨膜區(qū)域分析

圖5 pjβAS基因編碼蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

圖6 pjβAS基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.8 pjβAS基因在珠子參不同組織中的表達(dá)分析

以珠子參花、葉、莖、根狀莖cDNA為模板，pjβAS-F和pjβAS-R為引物，β-actin為內(nèi)參基因進(jìn)研究的深入，已成功從珠子參中分離出了28個(gè)皂苷單體，囊括了齊墩果烷型三萜皂苷和達(dá)瑪烷型三萜皂苷兩大類(lèi)，其中竹節(jié)參皂苷Ⅳa作為珠子參的主要藥用活性成分被2010版《中國(guó)藥典》收錄［16，17］。近期，珠子參總皂苷在抑制大鼠心肌細(xì)胞凋亡和拮抗氧化應(yīng)激損傷等方面的應(yīng)用［18］，已成為臨床研究行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，檢測(cè)不同組織中pjβAS基因轉(zhuǎn)錄層面的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果（圖9）顯示，pjβAS基因在葉中表達(dá)量最高，在根狀莖中的表達(dá)量最低。珠子參的主要藥用部位為根狀莖，而pjβAS基因的組織差異表達(dá)，說(shuō)明珠子參中皂苷類(lèi)成分的代謝、合成與積累可能存在指向性和組織間的轉(zhuǎn)運(yùn)。

圖7 pjβAS基因編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖8 17種植物βAS基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

圖9 珠子參不同組織中pjβAS基因的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

珠子參作為人參屬植物中的重要藥材，在我國(guó)擁有悠久的藥用傳統(tǒng)。隨著其化學(xué)成分和藥理活性的熱點(diǎn)。然而，珠子參中皂苷類(lèi)成分含量較低，對(duì)活性單體皂苷的分離，傳統(tǒng)的化學(xué)提純法提取成本高且收益率低。加之珠子參為多年生草本植株，收獲周期長(zhǎng)，對(duì)土壤、氣候和海拔高度等生長(zhǎng)條件要求較高，使得珠子參在醫(yī)藥領(lǐng)域和日常生活中的推廣應(yīng)用受到限制。因此，利用合成生物學(xué)的研究思路，借助分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的分析方法，探索珠子參中皂苷類(lèi)成分的生物合成途徑，實(shí)現(xiàn)合成途徑中關(guān)鍵調(diào)控基因的定位、克隆和高效表達(dá)［19］，將成為三萜皂苷大規(guī)模外源合成的可行辦法。目前，對(duì)藥用植物βAS基因的研究已取得了一定的進(jìn)展。吳瓊等［20］，首次在西洋參中克隆得到βAS基因全長(zhǎng)序列，并進(jìn)行了序列特征分析和聚類(lèi)分析。焉雅濤等［21］，分析了不同種屬間氧化鯊烯環(huán)化酶（OSC）基因家族的特征構(gòu)型、表達(dá)調(diào)控和進(jìn)化關(guān)系。王康寧等［22］，在人參15個(gè)組織器官中對(duì)βAS基因表達(dá)量和皂苷含量進(jìn)行了相關(guān)性分析，證實(shí)人參總皂苷和單體皂苷Rb1與βAS基因的表達(dá)呈顯著正相關(guān)。本課題組在早期研究中通過(guò)Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)，獲得了15.6 Gb的珠子參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并從中篩選出了包括βAS基因在內(nèi)的大量參與三萜皂苷生物合成的候選基因［13］。

在藥用植物中，OSC家族處于三萜皂苷合成途徑的中游位置，負(fù)責(zé)催化皂苷前體物的合成，βAS是OSC家族中目前唯一發(fā)現(xiàn)的調(diào)控齊墩果烷型皂苷合成的限速酶。本研究首次從珠子參中克隆得到βAS基因全長(zhǎng)cDNA序列，編碼761個(gè)氨基酸，整個(gè)多肽鏈中存在38處磷酸化位點(diǎn)，包括14處絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，8處蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)和16處絡(luò)氨酸磷酸化位點(diǎn)。蛋白質(zhì)磷酸化是生物體內(nèi)一種調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性與功能的普遍機(jī)制，氨基酸殘基經(jīng)磷酸化作用致使蛋白質(zhì)分子帶有電荷，進(jìn)而使其分子結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變［23］。Haralampidis等［8］研究發(fā)現(xiàn)，βAS基因中鄰近絡(luò)氨酸Tyr261的氨基酸易產(chǎn)生突變，致使四環(huán)三萜類(lèi)與五環(huán)三萜類(lèi)產(chǎn)物發(fā)生互換。pjβAS基因與竹節(jié)參βAS基因氨基酸序列一致性為100%，而核苷酸序列相似度為99%，磷酸化作用可能是導(dǎo)致親緣性較近的不同個(gè)體間基因功能發(fā)生改變的原因。在與其它OSC氨基酸序列的比較分析中，發(fā)現(xiàn)pjβAS基因含有OSC家族3個(gè)特征保守基序DCTAE、QW（QXXXXXW）和MWCRCY。序列DCTAE被視為環(huán)氧己烷親電活化的質(zhì)子供體，作用于底物結(jié)合［24-26］；QW（QXXXXXW）為一段帶負(fù)電荷的芳香族序列，在2，3-氧化鯊烯的環(huán)化過(guò)程中作用于正電荷中間體，達(dá)到穩(wěn)固蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用［27］；在OSC基因家族中，MWCRCY序列于βAS中較為保守，其序列中的色氨酸（W）經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控三萜化合物碳骨架的生物合成［28］。

亞細(xì)胞定位分析表明，pjβAS蛋白在葉綠體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中定位系數(shù)較高，且該蛋白無(wú)信號(hào)肽，不含跨膜區(qū)。推測(cè)pjβAS蛋白主要在附著于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體上合成，后由相應(yīng)的信號(hào)肽定向輸送到細(xì)胞內(nèi)的靶位點(diǎn)發(fā)揮其生物學(xué)作用。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)表明，pjβAS基因在珠子參葉、莖、花、根狀莖中表達(dá)量依次降低，表達(dá)量的變化與皂苷含量的分布相違背，珠子參根狀莖中皂苷含量最高，莖和葉次之，花中含量最低［29］。由此推測(cè)珠子參中皂苷類(lèi)成分主要在葉和莖中合成，通過(guò)物質(zhì)轉(zhuǎn)移通道運(yùn)輸?shù)礁鶢钋o中儲(chǔ)存，這種分布狀態(tài)也符合草本植物在脅迫環(huán)境下自身防衛(wèi)機(jī)制的客觀要求。

4 結(jié)論

本研究克隆得到的珠子參pjβAS基因全長(zhǎng)2 655 bp，包含一個(gè)2 286 bp的完整開(kāi)放閱讀框，編碼761個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析顯示，pjβAS編碼蛋白分子量為87.90 kD，理論等電點(diǎn)（pI）5.84，不含跨膜區(qū)，為非分泌蛋白，含有38處磷酸化位點(diǎn)，主要于葉綠體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)揮生理作用。二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，具有DCTAE、QW（QXXXXXW）和MWCRCY3個(gè)保守基序。pjβAS蛋白與竹節(jié)參（AKN23431.1）一致性達(dá)100%，和西洋參（AGG09939.1）、柴胡（ABY90140.2）的親緣關(guān)系較近，劃為同一支。pjβAS基因在珠子參不同組織中均有表達(dá)，在葉中表達(dá)量最高，根狀莖中表達(dá)量最低。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Cloning of β-amyrin Synthase Gene from Panax japonicus var. major and Its Bioinformatics Analysis

WU Ya-yun ZHAO Xiao-long CHEN Ping ZHANG Shao-peng
（College of Biology and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430070）

β-amyrin synthase（βAS），the rate-limiting enzyme saponin of directional shunt oleanane and dammarane types，plays an important role in biosynthesis of triterpenoid saponin in medical plants. The primers were designed based on the transcript sequence of βAS from the transcriptome dataset of P. japonicus var. major. And the full-length cDNA sequence of βAS was cloned from the rhizome of P. japonicus var. major by utilizing RT-PCR method，named as pjβAS. The length of this gene was 2 655 base pairs containing a complete open reading frame of 2 286 base pairs and encoding 761 amino acids. The accession number in GenBank is KX254566. The bioinformatics analysis showed that the putative molecular weight and theory isoelectric point of protein encoded by pjβAS were 87.90 kD and 5.84，respectively. The protein contained no transmembrane domain，was a non-secretory protein with 38 phosphorylation sites，it played a physiological role in chloroplast and endoplasmic reticulum. The secondary structure of the protein indicated that α-helix accounted for 39.82，extended strand for 16.56%，β-turn for 10.38%，and random coil for 33.24%. Meanwhile，three feature conserved motifs of oxido squalene cyclase（OSC）were found in pjβAS，i.e.，DCTAE，QW（QXXXXXW），and MWCRCY. The results of the sequence homology comparison concluded that the protein encoded by pjβAS was in 100% similarity with Panax japonicus C. A. Mey（AKN23431.1），and pjβAS gene was classified in the same branch with Panax japonicus C. A. Mey（AKN23431.1），Panax quinquefolius（AGG09939.1），and Bupleurum chinense DC（ABY90140.2）in phylogenetic analysis. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to analyze the relative expression quantity of pjβAS gene in different tissues of P. japonicus var. major，the results showed that there were different expression trends in flowers，leaves，stems and rhizomes，with the highest in leaves but the lowest in rhizomes.

Panax japonicus var. major；β-amyrin synthase；triterpenoid saponin；gene cloning；bioinformatics analysis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.016

2016-06-17

國(guó)家自然科學(xué)基金（81274023）

吳亞運(yùn)，男，碩士研究生，研究方向：中藥功能基因組學(xué)；E-mail：282595491@qq.com

張紹鵬，男，講師，研究方向：中藥功能基因組學(xué)；E-mail：shaopeng@whpu.edu.cn