油葵種子特異啟動(dòng)子Ha ds10 G1的克隆及功能鑒定

孫黎 周茜萍 齊梓云 王夢(mèng)瑤 陳福龍

（石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石河子 832000）

油葵種子特異啟動(dòng)子Ha ds10 G1的克隆及功能鑒定

孫黎 周茜萍 齊梓云 王夢(mèng)瑤 陳福龍

（石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石河子 832000）

從油葵中克隆得到LEA蛋白基因家族Ha ds10 G1基因的啟動(dòng)子序列，并對(duì)其進(jìn)行功能分析。利用PCR 技術(shù)從油葵品種“矮大頭“基因組DNA中分離Ha ds10 G1基因上游的調(diào)控序列，將其與GUS 基因融合，構(gòu)建種子特異性表達(dá)載體pBI121-PHa ds10，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草（Nicotiana tabacum）NC89，對(duì)再生植株進(jìn)行PCR、RT-PCR和GUS組織化學(xué)分析，以檢測(cè)GUS基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，油葵Ha ds10 G1基因啟動(dòng)子長(zhǎng)度為 1 417 bp，與已報(bào)道的向日葵Ha ds10 G1基因啟動(dòng)子序列同源性為89.42%。作用元件分析發(fā)現(xiàn)該區(qū)域除了具有啟動(dòng)子核心調(diào)控序列外，還含有多個(gè)與組織特異性、激素、逆境等表達(dá)相關(guān)的順式作用元件，如RY重復(fù)元件、ABRE元件、TC-rich元件等。轉(zhuǎn)基因植株的PCR結(jié)果顯示，成功地獲得了轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株；GUS活性檢測(cè)表明，該啟動(dòng)子序列僅能夠驅(qū)動(dòng)GUS基因在煙草種子表達(dá)，而在根、莖 、葉等組織中均未檢測(cè)到GUS基因表達(dá)。因此，油葵LEA蛋白基因家族Ha ds10 G1基因上游1 417 bp片段具有種子特異性啟動(dòng)子功能。研究結(jié)果為油葵等油料作物的油脂遺傳改良提供組織特異性啟動(dòng)子。

油葵；種子特異性啟動(dòng)子；GUS染色；煙草

油葵是油用向日葵（Helianthus annuus L.）的簡(jiǎn)稱，菊科向日葵屬植物，其適應(yīng)性廣，耐干旱、抗鹽堿、耐貧瘠，是中國(guó)北方重要的油料作物。以油葵種子榨取的葵花油具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，富含不飽和脂肪酸，如油酸、亞油酸，其中亞油酸含量高達(dá)50%-70%，而且富含維生素E和蛋白質(zhì)，是一種優(yōu)質(zhì)的食用油，同時(shí)也是具有廣闊開發(fā)前景的生物柴油能源植物［1，2］?；谙蛉湛匾慕?jīng)濟(jì)價(jià)值以及遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在向日葵中的應(yīng)用［3-6］，各類型的啟動(dòng)子迫切需要應(yīng)用到油葵的基因工程研究中。

目前用于農(nóng)作物遺傳改良的啟動(dòng)子多屬于組成型啟動(dòng)子，如CaMV 35S啟動(dòng)子［7］。由于其為組成型表達(dá)，在轉(zhuǎn)基因植物的所有組織和發(fā)育時(shí)期高表達(dá)外源基因，將會(huì)增加植物的代謝負(fù)擔(dān)和能量浪費(fèi)，而且容易對(duì)農(nóng)作物的生長(zhǎng)造成不良影響，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因作物的農(nóng)藝性狀較差。種子特異啟動(dòng)子（Seedspecific promoter）可以使外源基因在種子里特異表達(dá)，按照人們的意愿調(diào)節(jié)植物代謝途徑，特異性提高種子中特定營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量，最大限度地減少對(duì)農(nóng)作物其他代謝途徑的影響。因此，種子特異啟動(dòng)子的研究對(duì)于基因工程的發(fā)展和農(nóng)作物品質(zhì)改良具有重要意義，也為轉(zhuǎn)基因植物的安全性推廣提供了新思路［8，9］。

晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白（Late embryogenesis abundant protein，LEA）是植物胚胎發(fā)育后期大量積累的一大類蛋白質(zhì)，一般伴隨著種子或胚胎的成熟而形成，在種子萌發(fā)時(shí)很快消失。除此之外，許多營(yíng)養(yǎng)組織可以在ABA、水分和低溫脅迫等誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)錄LEA基因［10］。根據(jù)氨基酸序列或親水性，可將LEA蛋白分為6個(gè)家族，其中第一組LEA蛋白具有多拷貝串連的20個(gè)親水氨基酸序列，富含高比例的帶電荷氨基酸和甘氨酸［11］。Almoguera［12］和Prieto-Dapena等［13］對(duì)向日葵（Helianthus annuus L.）種子LEA蛋白基因Ha ds10 G1進(jìn)行了克隆和表達(dá)調(diào)控模式研究發(fā)現(xiàn)，該基因?qū)儆诘谝唤M（Group 1）LEA蛋白家族，具有種子特異性表達(dá)的特點(diǎn)，尤其在成熟的干種子（dry seed）中大量積累。

煙草是研究植物啟動(dòng)子功能常用的模式植物，具有遺傳轉(zhuǎn)化方法成熟，轉(zhuǎn)化效率高，生長(zhǎng)周期短，研究背景清楚，易于后續(xù)分析等優(yōu)點(diǎn)。本研究從油葵品種“矮大頭”基因組中克隆該基因上游1 417 bp的調(diào)控序列，分析其順式作用元件，并將該片段與GUS報(bào)告基因重組，構(gòu)建報(bào)告表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入煙草中進(jìn)行功能驗(yàn)證，以期為油葵遺傳改良提供可利用的組織特異性啟動(dòng)子奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料為油葵（Helianthus annuus L.）品種“矮大頭”，種植于石河子大學(xué)試驗(yàn)場(chǎng)。其籽實(shí)含油率高達(dá)50%，且抗病耐旱，適應(yīng)性強(qiáng)；野生型煙草（Nicotiana tabacum）為NC89品種，為本實(shí)驗(yàn)室保存。

pBI121質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存，大腸桿菌Top10，農(nóng)桿菌GV3101，pUC-T載體，各種限制性內(nèi)切酶、反轉(zhuǎn)錄酶以及實(shí)驗(yàn)所用試劑盒均購(gòu)自TaKaRa生物有限公司，Taq DNA聚合酶購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司（北京），其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純，實(shí)驗(yàn)所用引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 油葵基因組DNA的提取 以油葵的幼葉為材料提取DNA，采用改良的CTAB法［14］。

1.2.2 Hads10 G1啟動(dòng)子的克隆和序列分析 根據(jù)Prieto等［13］報(bào)道的序列（AJ224116），應(yīng)用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增Hads10 G1基因的啟動(dòng)子。引物序列為：上游引物（SL73）：5'-CCCAAGCTTA GGATACTCGTACACACC-3'（Hind Ⅲ）；下游引物（SL80）：5'-TGCTCTAGATTTGTTCACTCTTTTAAC-3'（Xba I）。其中劃線部分為加入的酶切位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃ 1 min，52℃ 1 min，72℃ 1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，用DNA凝膠回收試劑盒純化后連入pUC-T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top 10感受態(tài)細(xì)胞，通過菌落PCR篩選、酶切和測(cè)序鑒定獲得重組質(zhì)粒，命名為pUCT-Ha ds10。測(cè)序由生工生物工程有限公司完成，并用DNAMAN 軟件對(duì)其進(jìn)行序列分析。使用在線工具PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/）分析啟動(dòng)子的特征元件。

1.2.3 pBI121- PHa ds10 種子特異性表達(dá)載體的構(gòu)建 以植物表達(dá)載體pBI121為基礎(chǔ)，用油葵Ha ds10 G1啟動(dòng)子替換原有的CaMV 35S 啟動(dòng)子，與GUS 報(bào)告基因融合構(gòu)建獲得種子特異性表達(dá)載體pBI-PHa ds10。利用Hind Ⅲ、Xba I分別雙酶切pUC-T-Ha ds10和pBI121質(zhì)粒，并分別回收pUC-THa ds10小片段和pBI121大片段，用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top 10感受態(tài)細(xì)胞，然后提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)PCR、酶切和測(cè)序鑒定正確后，獲得重組種子特異性表達(dá)載體pBI-PHa ds10。

1.2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)煙草的遺傳轉(zhuǎn)化 利用凍融法將重組種子特異性表達(dá)載體pBI-PHa ds10 轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌GV3101中，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草NC89品系［15］。用100 mg/L卡那霉素對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行篩選，轉(zhuǎn)化煙草的篩選培養(yǎng)基為MS附加2.0 mg/L 6-BA、0. 3 mg/L IAA、100 mg/L卡那霉素、400 mg/L利福平、200 mg/L羧芐青霉素；誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基為1/2 MS附加100 mg/L卡那霉素、400 mg/L利福平、100 mg/L羧芐青霉素。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因煙草的分子鑒定 采用天根生化有限公司的植物總DNA提取試劑盒提取煙草葉片基因組DNA。以種子特異性表達(dá)載體pBI-PHa ds10為陽(yáng)性對(duì)照，以非轉(zhuǎn)基因煙草為陰性對(duì)照，以Ha ds10 G1基因啟動(dòng)子的特異性引物SL73和SL80進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條件同1.2.2。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

采用天根生化有限公司的植物總RNA提取試劑盒提取煙草種子總RNA。然后將1 μg RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA 為模板，使用GUS基因特異性引物GUS-F：5'-GCAACTGGACAAGGCACT-3'和GUS-R：5'-GCGTCGCAGAACATTACA-3'進(jìn)行PCR 反應(yīng)；同時(shí)，以煙草β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，引物序列為：Actin-F：5'-AAGGGATGCGAGGATGGA-3'，Actin-R：5'-CAAGGAAATCACCGCTTTGG-3'。擴(kuò)增條件同上。1.2.6 GUS活性的組織染色 采用組織化學(xué)染色法［16］檢測(cè)GUS基因在轉(zhuǎn)基因煙草各組織中的表達(dá)。將待測(cè)材料的根、莖、葉和種子分別放入1.5 mL的Eppendorf中，加入GUS染色液（1 mmol/L X-gluc，50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液，0.1% Triton X-100），37℃保溫過夜，然后用75%乙醇脫色數(shù)小時(shí)，種子放在10倍顯微鏡下觀察，并照相記錄結(jié)果。由于煙草外面有較堅(jiān)硬的種皮，會(huì)影響染色效果，因此我們?cè)谌旧跋葘煵莘N子用刀片從中部割開，再置于GUS染液中進(jìn)行染色。

2 結(jié)果

2.1 油葵Ha ds10 G1基因啟動(dòng)子的克隆

以油葵“矮大頭”幼葉的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳，與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析（圖1），表明SL73和SL74引物擴(kuò)增出1條約1.4 kb的條帶，與預(yù)期大小一致。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 重組克隆載體的構(gòu)建

將PCR產(chǎn)物回收后與克隆載體pUC-T連接，獲得重組質(zhì)粒pUC-T-Ha ds10，經(jīng)菌落PCR鑒定（圖2-A）表明，7、8單菌落能擴(kuò)增出一條大小約1.4 kb的條帶，與目的片段的大小一致，而未轉(zhuǎn)化的菌株沒有擴(kuò)增出該條帶。提取7、8號(hào)的質(zhì)粒進(jìn)行Hind Ⅲ / Xba I雙酶切鑒定，結(jié)果二者均能切出大小約1.4 kb的目的條帶（圖2-B），進(jìn)一步通過測(cè)序證實(shí)了序列的正確性，說明pUC-T-Ha ds10載體構(gòu)建成功。

2.3 油葵Ha ds10 G1啟動(dòng)子的序列分析

對(duì)pUC-T-Ha ds10進(jìn)行測(cè)序，序列分析結(jié)果（圖3）表明，該片段長(zhǎng)度為1 417 bp，與已報(bào)道的Ha ds10 G1啟動(dòng)子序列（AJ 224116）相似性為89.42%。通過PlantCARE在線軟件對(duì)Ha ds10 G1啟動(dòng)子序列進(jìn)行元件預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)Ha ds10 G1啟動(dòng)子除了含有TATA box和CAAT box等保守的啟動(dòng)子元件外，還存在許多與光反應(yīng)、非生物脅迫相關(guān)的順式作用元件，以及胚乳和種子特異性表達(dá)所必須的調(diào)控元件Skn-1motif、參與多種植物基因種子特異性調(diào)節(jié)的RY重復(fù)元件（CATGCATG）。（1）光響應(yīng)元件：I-Box（ACCCTTATCT）、G-Box（CACGTG）、ACE（AAAACGTTTA）、MRE（TTAGGTT）。（2）脅迫應(yīng)答元件：低溫響應(yīng)元件LTR（TTTCGG），干旱誘導(dǎo)相關(guān)元件MBS（TAACTG），脅迫防御元件TC-rich repeats（ATTTTCTTCA）。（3）激素應(yīng)答元件：脫落酸響應(yīng)元件ABRE（TTTTTTCC），赤霉素響應(yīng)元件P-box，生長(zhǎng)素響應(yīng)元件TGA-element、AuxRR-core（GGTCCAT）等。（4）種子特異表達(dá)元件：胚乳表達(dá)必需的元件Skn-1 motif（GTCAT）、種子特異表達(dá)的調(diào)控元件RY-repeat element（CATGCATG）。

圖2 pUC-T-Ha ds10重組子檢測(cè)結(jié)果

2.4 pBI-PHa ds10種子特異性表達(dá)載體的構(gòu)建

植物表達(dá)載體pBI121是含有CaMV 35S啟動(dòng)子和GUS基因的雙元載體。為了研究Ha ds10 G1基因啟動(dòng)子的功能，本研究將Ha ds10 G1啟動(dòng)子替換pBI121載體上的CaMV 35S組成型啟動(dòng)子，構(gòu)建種子特異表達(dá)載體pBI-PHa ds10，構(gòu)建策略見圖4。

利用限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和Xba I分別雙酶切pUC-T-Ha ds10和pBI121載體，然后將pUC-THads10小片段和pBI121大片段用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定，得到1條約1.4 kb的特異性條帶（圖5），與預(yù)期片段大小一致。進(jìn)一步通過測(cè)序驗(yàn)證了其正確性，表明pBI-PHa ds10載體構(gòu)建成功。

2.5 轉(zhuǎn)基因煙草的獲得及PCR鑒定

將種子特異性表達(dá)載體pBI-PHa ds10 通過凍融法轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌GV3101中，然后采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草NC89，通過卡那霉素篩選獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株。然后從陽(yáng)性植株幼葉中提取基因組DNA，用克隆油葵Ha ds10 G1基因啟動(dòng)子的引物SL73和SL80進(jìn)行PCR 檢測(cè)。結(jié)果（圖6）表明，轉(zhuǎn)基因煙草株系4號(hào)和6號(hào)（泳道4和6）擴(kuò)增出大小約為1.4 kb的片段，與預(yù)計(jì)大小相符，而野生型煙草（泳道1）沒有擴(kuò)增出該片段，表明油葵Ha ds10 G1基因啟動(dòng)子已整合入煙草的基因組DNA中。

2.6 轉(zhuǎn)基因煙草的GUS活性檢測(cè)

為了確證所克隆啟動(dòng)子的功能，取轉(zhuǎn)基因植株不同部位的組織進(jìn)行GUS 檢測(cè)，以野生型煙草為對(duì)照。結(jié)果（圖7）表明，野生型煙草的種子、根、莖和葉片不能被GUS染色，轉(zhuǎn)pBI-PHads10質(zhì)粒的煙草只有種子能被染成藍(lán)色，而根、莖和葉片不能被GUS染色。為了進(jìn)一步驗(yàn)證GUS基因在煙草中的表達(dá)，分別提取轉(zhuǎn)基因和野生型煙草種子的總RNA，進(jìn)行半定量RT-PCR。結(jié)果（圖8）表明，從轉(zhuǎn)基因煙草中擴(kuò)增獲得預(yù)期的目的基因片段，而野生型煙草中未擴(kuò)增出該片段；同時(shí)，在轉(zhuǎn)基因和野生型煙草中均擴(kuò)增出內(nèi)標(biāo)β-actin基因片段。由此可以確認(rèn)，所克隆獲得的啟動(dòng)子為種子特異性表達(dá)啟動(dòng)子。

3 討論

植物的種子，尤其是油料作物和糧食作物的種子與人類的生產(chǎn)生活密切相關(guān)，因此，以種子作為生物反應(yīng)器一直是人們研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。種子特異性表達(dá)啟動(dòng)子是基因工程研究中必不可少的有利工具。近20年來，隨著人們對(duì)種子特異啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)、功能的深入研究，發(fā)現(xiàn)了一系列種子特異啟動(dòng)子，并且已在芝麻、大豆等農(nóng)作物的品質(zhì)改良中得到應(yīng)用。如在芝麻種子特異性2S清蛋白（2Salb）啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下，將大豆脂肪酸去飽和酶基因在芝麻種子中特異表達(dá)，提高了芝麻種子α-亞麻酸的含量［17］。栽培大豆球蛋白（vicillin）種子特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)紫蘇γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因在印度大豆中表達(dá)，促進(jìn)轉(zhuǎn)基因大豆種子中γ-生育酚轉(zhuǎn)化為α-生育酚，提高了種子中α-生育酚的含量［18］。

圖3 Ha ds10 G1啟動(dòng)子序列分析

圖4 植物表達(dá)載體pBI121與pBI-PHa ds10的T-DNA區(qū)域示意圖

圖5 pBI-PHa ds10質(zhì)粒雙酶切鑒定

圖6 轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測(cè)

圖7 陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株?duì)I養(yǎng)器官和種子的GUS組織化學(xué)染色

圖8 轉(zhuǎn)基因煙草種子GUS基因的RT-PCR檢測(cè)

油葵是世界上重要的油料作物，同時(shí)也是具有廣闊開發(fā)前景的可再生能源植物，通過基因工程方法調(diào)控油葵的代謝路徑可以提高其產(chǎn)量、品質(zhì)和抗病性［3，5，6］，而種子特異性啟動(dòng)子的開發(fā)和應(yīng)用將有助于實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo)。雖然人們已從油菜、大豆等植物中克隆了一些種子特異啟動(dòng)子，并成功應(yīng)用到油料作物品質(zhì)改良工作中，但在油葵基因工程研究中使用來源于向日葵自身的種子特異啟動(dòng)子，不僅可以降低同源轉(zhuǎn)基因沉默的風(fēng)險(xiǎn)，而且在某種程度上避免生物安全性帶來的問題。因此研究油葵本身的種子特異啟動(dòng)子應(yīng)用于油葵中具有重要意義。本研究以油葵品種“矮大頭”的基因組DNA為模板，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增了油葵LEA蛋白家族中的Ha ds10 G1基因起始密碼前1 417 bp序列，與已報(bào)道的向日葵Ha ds10 G1基因啟動(dòng)子（AJ 224116）序列同源性為89.42%。進(jìn)一步對(duì)Ha ds10 G1基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，該序列除含有CAAT box和TATA box等真核生物啟動(dòng)子基本元件外，還存在大量光反應(yīng)元件，如I-Box、G-Box、ACE、MRE，說明Ha ds10 G1 基因的表達(dá)受到光的調(diào)控。同時(shí)該啟動(dòng)子上也存在多個(gè)脅迫應(yīng)答元件，如低溫響應(yīng)元件LTR、干旱誘導(dǎo)相關(guān)元件MBS（也是MBY轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)），脅迫防御元件TC-rich repeats 和激素應(yīng)答元件（脫落酸響應(yīng)元件ABRE，赤霉素響應(yīng)元件P-box，生長(zhǎng)素響應(yīng)元件TGA-element、AuxRR-core等），暗示該基因的表達(dá)可能受到多種逆境脅迫和激素的調(diào)控。另外，該啟動(dòng)子還含有2個(gè)胚乳特異表達(dá)必需的順式調(diào)節(jié)元件Skn-1 motif和2個(gè)RY重復(fù)序列（RY repeat）。RY重復(fù)序列廣泛存在于單子葉和雙子葉植物的種子特異性基因啟動(dòng)子中，如1.7S油菜貯藏蛋白（napin）基因啟動(dòng)子［19］和7S大豆貯藏蛋白（β-conglycinin）基因啟動(dòng)子［20］等。RY重復(fù)序列常以多拷貝的形式存在，是核蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)種子特異性基因的高水平表達(dá)十分重要，具有種子特異性時(shí)序調(diào)控功能［21，22］。Ha ds10 G1基因啟動(dòng)子中RY重復(fù)序列的存在進(jìn)一步證實(shí)了該啟動(dòng)子為種子特異性啟動(dòng)子。

通過對(duì)啟動(dòng)子功能進(jìn)行驗(yàn)證，用Ha ds10 G1啟動(dòng)子替換pBI121中GUS上游的CAMV35S啟動(dòng)子，構(gòu)建重組表達(dá)載體，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草獲得轉(zhuǎn)基因植株，對(duì)其種子和營(yíng)養(yǎng)器官進(jìn)行GUS染色。結(jié)果表明，Ha ds10 G1啟動(dòng)子序列能驅(qū)動(dòng)GUS基因在煙草種子中特異表達(dá)。研究結(jié)果不僅為油葵基因調(diào)控的理論研究提供新資料，同時(shí)也為油葵基因工程提供更有效的啟動(dòng)子和調(diào)控元件，對(duì)于將向日葵作為生物反應(yīng)器并在其中表達(dá)和儲(chǔ)存有價(jià)值的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)具有較大的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

油葵Ha ds10 G1啟動(dòng)子上游1 417 bp片段具有種子特異性表達(dá)的特點(diǎn)，可用于植物種子特異表達(dá)載體的構(gòu)建和進(jìn)一步的遺傳轉(zhuǎn)化。

［1］劉公社, 陳中岳. 向日葵生物柴油的開發(fā)前景［J］. 中國(guó)油料作物學(xué)報(bào), 2006, 28（2）：224-227.

［2］Senkoylu N, Dale N. Nutritional evaluation of a high-oil sunflower meal in broiler starter diets［J］. J Appl Poult Res, 2006, 15：40-47.

［3］Sujatha A, Vijay S, Vasavi S, et at. Agrobacterium-mediated transformation of cotyledons of mature seeds of multiple genotypes of sunflower （Helianthus annuus L.）［J］. Plant Cell, Tissue and Organ Culture（PCTOC）, 2012, 110（2）：275-287.

［4］Lewi DM, Hopp HE, Escandon AS. Sunflower（Helianthus annuus L.）［J］. Methods Mol Biol, 2006, 343：291-297.

［5］Skori? D, Joci? S, Sakac Z, et al. Genetic possibilities for altering sunflower oil quality to obtain novel oils［J］. Can J Physiol Pharmacol, 2008, 86（4）：215-221.

［6］Tishchenko EN, Komisarenko AG, Mikhal’skaia SI, et al. Agrobacterium-mediated sunflower transformation（Helianthus annuus L.）in vitro and in Planta using strain of LBA4404 harboring binary vector pBi2E with dsRNA-suppressor proline dehydrogenase gene［J］. Tsitol Genet, 2014, 48（4）：19-30.

［7］Covey SN, Lomonossoff GP, Hull R. Characterisation of cauliflower mosaic virus DNA sequences which encode major polyadenylated transcripts［J］. Nucleic Acids Res, 1981, 9：6735-6748.

［8］ 李田, 孫景寬, 劉京濤. 植物啟動(dòng)子研究進(jìn)展［J］. 生物技術(shù)通報(bào), 2015, 31（2）：18-25.

［9］Zhao Y, Sha W, Wang QY, et al. Molecular cloning and activity analysis of a seed-specific FAD2-1B gene promoter from Glycine max［J］. Cell Mol Biol, 2015, 61（4）：85-89.

［10］Hincha DK, Thalhammer A. LEA proteins：IDPs with versatile functions in cellular dehydration tolerance［J］. Biochem Soc Trans, 2012, 40（5）：1000-1003.

［11］Dure L. A repeating 11-mer amino acid motif and plant desiccation［J］. Plant J, 1993, 3（3）：363-369.

［12］Almoguera C, Jordano J. Developmental and environmental concurrent expression of sunflower dry-seed-stored low-molecularweight heat-shock protein and Lea mRNAs［J］. Plant Mol Biol, 1992, 19（5）：781-792.

［13］Prieto-Dapena P, Almoguera C, Rojas A, et al. Seed-specific expression patterns and regulation by ABI3 of an unusual late embryogenesis-abundant gene in sunflower［J］. Plant Mol Biol, 1999, 39：615-627.

［14］ Doyle JJ, Doyle JL. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue［J］. Phytochem Bull, 1987, 19：11-15.

［15］Horsch RB, Fry JE, Hoffman NL. A simple and general method for transferring gene into plant［J］. Science, 1985, 227（4691）：1229-1231.

［16］Jefferson RA, Kavanagh TA, Bevan MW. GUS fusions：β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants［J］. EMBO J, 1987, 6（13）：3901-3907.

［17］Bhunia RK, Chakraborty A, Kaur R, et al. Seed-specific increased expression of 2S albumin promoter of sesame qualifies it as auseful genetic tool for fatty acid metabolic engineering and related transgenic intervention in sesame and other oil seed crops［J］. Plant Mol Biol, 2014, 86：351-365.

［18］Arun M, Subramanyam K, Theboral J, et al. Transfer and targeted overexpression of γ-tocopherol methyltransferase（γ-TMT）gene using seed-specific promoter improves tocopherol composition in Indian soybean cultivars［J］. Appl Biochem Biotechnol, 2014, 172（4）：1763-1776.

［19］Sohrabi M, Zebarjadi A, Najaphy A, et al. Isolation and sequence analysis of napin seed specific promoter from Iranian Rapeseed（Brassica napus L.）［J］. Gene, 2015, 563（2）：160-164.

［20］Yoshino M, Tsutsumi K, Kanazawa A. Profiles of embryonic nuclear protein binding to the proximal promoter region of the soybean β-conglycinin α subunit gene［J］. Plant Biol（Stuttg）, 2015, 17（1）：147-152.

［21］Reidt W, Wohlfarth T, Ellerstrom M, et al. Gene regulation during late embryogenesis：the RY motif of maturation-specific gene promoters is a direct target of the FUS3 gene product［J］. Plant J, 2000, 21：401-408.

［22］Nie DM, Ouyang YD, Wang X, et al. Genome-wide analysis of endosperm-specific genes in rice［J］. Gene, 2013, 530（2）：236-247.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Cloning and Identification of Seed-specific Promoter Ha ds10 G1 from Oil Sunflower（Helianthus annuus）

SUN Li ZHOU Xi-ping QI Zi-yun WANG Meng-yao CHEN Fu-long
（College of Life Sciences，Shihezi University，Xinjiang 832000）

The objective of this work is to clone and identify the seed-specific promoter of Ha ds10 G1 in a LEA（late embryogenesis abundant）protein gene family from oil sunflower. The upstream regulatory region of Ha ds10 G1 gene was isolated from the genomic DNA of sunflower “Aidatou” by PCR method. The cloned region was fused to the GUS reporter gene，and plant expression vector pBI121-PHa ds10 was constructed，which was introduced into Nictiana tabacum NC89 by medicating Agrobacterium tumefaciens. The expression of GUS gene in the transgenic tobacco plants was detected by PCR，RT-PCR and GUS. As results，the gene promoter of Ha ds10 G1 was 1 417 bp，and it had homology with the reported sequence at 89.42%. Cis-acting elements search in the segment revealed that in addition to kernel regulatory sequences of promoter，there was the presence of a number of motifs related to tissue specificity，hormone，and adverse environment，such as RY-repeat elements，ABRE motif and TC-rich element，etc. PCR results showed that the transgenic plants were obtained successfully. GUS activity assays indicated that this promoter drove the expression of GUS gene only in tobacco seed embryo，and not in the other tissues such as roots，stems and leaves. Conclusively，the cloned 1 417 bp upstream regulatory region of Ha ds10 G1 gene from the LEA protein gene family of oil sunflower is seed-specific promoter. The results may provide the tissue-specific promoter for genetic improvement of oilseed crops such as oil sunflower.

oil sunflower；seed-specific promoter；GUS staining；tobacco

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.011

2016-06-29

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31360052），兵團(tuán)博士基金項(xiàng)目（2012BB005）

孫黎，女，博士，研究方向：植物分子生物學(xué)；E-mail：sunlishz@126.com