沙棘葉科羅索酸濃縮物的毒理學(xué)研究

王斌，張瓊姝，楊雪芳，張洋洋，郭海利，張小民

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；2.山西金科海生物技術(shù)有限公司，山西太原030006）

沙棘葉科羅索酸濃縮物的毒理學(xué)研究

王斌1，張瓊姝1，楊雪芳1，張洋洋1，郭海利2，張小民1

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；2.山西金科海生物技術(shù)有限公司，山西太原030006）

按照食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序和方法對(duì)沙棘葉科羅索酸濃縮物進(jìn)行了小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)和小鼠精子畸形試驗(yàn)。小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，沙棘葉濃縮物對(duì)雌雄小鼠經(jīng)口最大耐受劑量（MTD）均大于15 g/kg，為無毒級(jí)物質(zhì)；小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)和小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果表明，該檢品未呈現(xiàn)有致突變性。通過食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)，不僅可為沙棘葉濃縮物可食性提供理論依據(jù)，也會(huì)對(duì)整個(gè)沙棘葉的開發(fā)起到積極的推動(dòng)作用。

中國沙棘；葉；提取物；毒理學(xué)

科羅索酸具有較高的藥用價(jià)值，比如降血糖[1]、抗氧化[2]、調(diào)血脂[3]、抗抑郁[4]以及抗心律失常[5]等。沙棘葉中含有科羅索酸，已有許多有關(guān)其的研究。吳哲等[6]采用HPLC法測(cè)定了沙棘葉中科羅索酸的含量；田曉東等[7]對(duì)沙棘葉科羅索酸的濃縮工藝進(jìn)行了研究；張璐等[8]確定了沙棘葉濃縮物中科羅索酸的測(cè)定方法。沙棘在山西有著得天獨(dú)厚的資源優(yōu)勢(shì)，山西現(xiàn)有沙棘林面積為56萬hm2[9]。近年來，研究者還發(fā)現(xiàn)，沙棘葉中含有多種營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)，金婷等[10]證明，沙棘葉中蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素C、脂溶性維生素A、K、E等含量豐富，同時(shí)還含有多種不飽和脂肪酸、葡萄糖、果糖、半乳糖以及其他生物活性物質(zhì)；趙麗萍等[11]研究發(fā)現(xiàn)，沙棘葉中含有豆甾醇、齊墩果酸、槲皮素、表兒茶素、對(duì)羥基苯甲酸丁酯等化合物；付陽等[12]通過高效液相-電噴霧質(zhì)譜法測(cè)定了沙棘葉中槲皮素、楊梅素、蘆丁、異鼠李素、山奈酚的含量。

沙棘葉不僅含有較多的生物活性成分，而且這些成分中的黃酮類物質(zhì)在治療心血管疾病方面有著突出作用。李淑珍等[13]建立了總黃酮含量的測(cè)定方法，并對(duì)沙棘葉總黃酮提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化[14]；安樂等[15]建立了沙棘葉總黃酮的最佳提取純化工藝。此外，沙棘中齊墩果酸是肝病的輔助治療藥物，對(duì)急慢性肝損傷有明顯的保護(hù)作用；蘆丁主要用于脆性增加的毛細(xì)血管出血癥，也用于高血壓、腦出血、視網(wǎng)膜出血、出血性紫癜、急性出血性腎炎、再發(fā)性鼻出血、創(chuàng)傷性肺出血、產(chǎn)后出血等的輔助治療；科羅索酸通過加快葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收和利用，從而實(shí)現(xiàn)其降血糖功效。由于科羅索酸對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的興奮作用類似于胰島素，因此，科羅索酸也被稱為植物胰島素。近年來的研究表明，沙棘葉有著較高的開發(fā)和利用價(jià)值。

本研究為推進(jìn)沙棘葉科羅索酸濃縮物的利用和開發(fā)，按食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序和方法進(jìn)行了小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)以及小鼠精子畸形試驗(yàn)，這不僅可為沙棘葉濃縮物的食用安全提供依據(jù)，也將會(huì)加快整個(gè)沙棘葉的開發(fā)進(jìn)程。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 沙棘葉沙棘葉采自山西祁縣來遠(yuǎn)鎮(zhèn)唐河底，為野生中國沙棘（Hippophae rhamnoides L.Subsp.Sinensis Rousi）。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)昆明種小鼠，購自北京維通利華試驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 沙棘葉濃縮物的獲取將沙棘葉經(jīng)60℃干燥箱干燥，粉碎，過0.25 mm篩，置于蒸餾水中，加熱至80℃，浸泡4 h，過濾并棄濾液，將沙棘葉于60℃烘干。烘干后的沙棘葉置于圓底燒瓶中，按料液比1∶10加入無水乙醇，90℃回流3 h，過濾后將濾液倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶，減壓回收乙醇，制得浸膏，4℃保存。

1.2.2 小鼠毒理試驗(yàn)

1.2.2.1 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)按GB15193.3—2003急性毒性試驗(yàn)方法中最大耐受劑量法進(jìn)行。選體質(zhì)量為19～22 g的健康小鼠20只，雌雄各占1/2。小鼠禁食14 h，稱取受試物15 g，加蒸餾水至40 mL。2次經(jīng)口灌胃給予受試物，每千克體質(zhì)量灌胃量為20 mL，中間間隔6 h，合并劑量為15 g/kg。14 d后記錄中毒癥狀及死亡情況。

1.2.2.2 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)按GB15193.5— 2003骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)進(jìn)行。選用體質(zhì)量為25～30 g的健康小鼠50只，按照體質(zhì)量隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各占1/2，處理劑量分別為2.5，5，10 g/kg，同時(shí)設(shè)置溶劑對(duì)照組（蒸餾水）和陽性對(duì)照組（環(huán)磷酰胺50 mg/kg）。各劑量溶液配制方法：稱取受試物2.5，5，10 g，分別加蒸餾水至20 mL，依次為低、中、高劑量組；取環(huán)磷酰胺儲(chǔ)備液（25 mg/mL）2 mL加蒸餾水至20 mL為陽性對(duì)照組，溶劑對(duì)照組為蒸餾水。各組均按20 mL/kg經(jīng)口灌胃，受試物現(xiàn)用現(xiàn)配。各組均采用2次經(jīng)口給受試物，中間間隔24 h，于第2次給受試物后6 h處死動(dòng)物，取一側(cè)股骨制備骨髓涂片，Gimsa染色后鏡檢計(jì)數(shù)嗜多染紅細(xì)胞中的微核發(fā)生率。

1.2.2.3 小鼠精子畸形試驗(yàn)按GB15193.7—2003小鼠精子畸形試驗(yàn)進(jìn)行。選體質(zhì)量為26～35 g的雄性性成熟小鼠25只，按照體質(zhì)量隨機(jī)分為5組，每組5只，設(shè)3個(gè)劑量組，即2.5，5，10 g/kg，同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組（蒸餾水）和陽性對(duì)照組（環(huán)磷酰胺50 mg/kg）。各劑量溶液配制方法同1.2.2.2。各組均按20 mL/kg的體積經(jīng)口灌胃，受試物現(xiàn)用現(xiàn)配。連續(xù)5 d經(jīng)口給予受試物，一天一次，均于首次給受試物后的第35天處死動(dòng)物，取兩側(cè)副睪，制備精子標(biāo)本，高倍鏡下檢查每只動(dòng)物的精子形態(tài)，計(jì)數(shù)結(jié)構(gòu)完整精子1 000個(gè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性試驗(yàn)

在14 d的觀察期內(nèi)，動(dòng)物未見明顯中毒癥狀；眼、鼻、口未見分泌物，無腫脹現(xiàn)象；糞便黑灰色，呈麥粒狀，外陰部光潔；被毛整潔光滑、乳白色，黏膜無充血、水腫，體質(zhì)量增長正常，無一動(dòng)物死亡。表明該受試物對(duì)雌雄小鼠經(jīng)口最大耐受劑量（MTD）均大于15 g/kg（表1）。

表1 沙棘葉提取物對(duì)小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

經(jīng)單因素方差分析可知，各劑量組微核細(xì)胞率與溶劑對(duì)照組相比，差異均無顯著性（P＞0.05），且微核細(xì)胞率均在文獻(xiàn)報(bào)道的正常組的正常值范圍之內(nèi)，而陽性對(duì)照組微核細(xì)胞率與溶劑對(duì)照組以及各劑量組之間進(jìn)行比較，差異達(dá)極顯著（P＜0.01）（表2）。

2.3 小鼠精子畸形試驗(yàn)

經(jīng)單因素方差分析可知，各劑量精子畸形率與溶劑對(duì)照組相比，差異不顯著（P＞0.05），而陽性對(duì)照組精子畸形率與溶劑對(duì)照組及各劑量組相比，差異極顯著（P＜0.01）（表3）。

表2 沙棘葉提取物對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核率的影響

表3 沙棘葉提取物對(duì)小鼠精子畸形率的影響

3 討論與討論

根據(jù)《食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序和方法》（GB 15193.1～15193.21—2003）的要求，對(duì)沙棘葉科羅索酸濃縮物進(jìn)行了小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)及2項(xiàng)致突變?cè)囼?yàn)。小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，在14 d的觀察期內(nèi)，動(dòng)物未見明顯中毒癥狀，被毛整潔光滑，黏膜無充血、水腫，體質(zhì)量增長正常，無一動(dòng)物死亡。表明該受試物對(duì)雌雄小鼠經(jīng)口MTD均大于15 g/kg。按急性毒性劑量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)屬無毒級(jí)物質(zhì)。

小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果表明，各劑量組微核細(xì)胞率與溶劑對(duì)照組相比，差異均無顯著性（P＞0.05），而陽性對(duì)照組微核細(xì)胞率與溶劑對(duì)照組以及各劑量組相比，差異極顯著（P＜0.01），說明沙棘葉濃縮物未使小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率發(fā)生改變。

小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果表明，各劑量精子畸形率與溶劑對(duì)照組相比，差異均不顯著（P＞0.05），而陽性對(duì)照組精子畸形率與溶劑對(duì)照組及各劑量組相比，差異極顯著（P＜0.01），說明沙棘葉濃縮物在所涉及劑量范圍內(nèi)不會(huì)引起小鼠畸形率增高。

沙棘雖然是果葉兩用植物，但對(duì)沙棘葉的開發(fā)遠(yuǎn)不如沙棘果，張小民等[16]按照食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序和方法對(duì)沙棘葉進(jìn)行了急性毒性試驗(yàn)和骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)，初步證明了沙棘葉作為新的食物資源的安全性。劉緒川等[17]研究指出，用沙棘葉長期飼喂試驗(yàn)動(dòng)物無蓄積性毒害，不影響動(dòng)物繁殖，對(duì)胚胎也無致畸作用，更無致癌或促發(fā)腫瘤作用，長期飼喂還能提高機(jī)體抗病力。劉艷豐等[18]研究了沙棘葉黃酮對(duì)綿羊瘤胃代謝和血清指標(biāo)的影響，結(jié)果認(rèn)為，在綿羊日糧中添加沙棘葉黃酮，可以提高綿羊蛋白質(zhì)的合成，調(diào)節(jié)脂類代謝，增加細(xì)胞因子的含量，有益于免疫力的提高，建議在綿羊日糧中添加0.25%的沙棘葉黃酮。山西省沙棘資源豐富，面積大，分布廣，每年都有大量的枝葉產(chǎn)生，對(duì)沙棘葉的深入研究，將會(huì)加快沙棘葉的開發(fā)利用進(jìn)程，為沙棘葉在醫(yī)藥領(lǐng)域的拓展起到推動(dòng)作用。

［1］梁茂雨，陳怡平，縱偉.降血糖功能因子科羅索酸研究進(jìn)展[J].中國食物與營養(yǎng)，2007（5）：7-18.

［2］王曉飛，李輝，劉銘佩，等.沙棘不同組織部位的抗氧化活性研究[J].中成藥，2016，38（2）：437-440.

［3］于云，曲樹明，何躍生.沙棘葉提取物的調(diào)血脂作用[J].中草藥，2002，33（9）：824-825.

［4］田俊生，鄭曉芬，張麗增，等.沙棘籽油抗抑郁作用[J].食品科學(xué)，2013，34（19）：279-282.

［5］劉鳳鳴，李增晞，石山.沙棘總黃酮對(duì)離體心臟的抗心律失常作用[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，1989，5（1）：44-47.

［6］吳哲，李小玉，田曉東，等.HPLC法測(cè)定桑葉和沙棘葉中科羅索酸的含量[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（11）：1169-1171.

［7］田曉東，張璐，張瓊姝，等.沙棘葉中科羅索酸濃縮工藝初探[J].

山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（2）：239-242.

［8］張璐，田曉東，王斌，等.沙棘葉中科羅索酸濃縮物的測(cè)定方法[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（1）：30-32.

［9］侯霄，衛(wèi)罡，李曉艷，等.山西沙棘資源及生境初步分析[J].國際沙棘研究與開發(fā)，2014（4）：27-29.

［10］金婷，徐雅琴，李興國.沙棘中活性物質(zhì)及其應(yīng)用[J].沙棘，2005，18（2）：24-26.

［11］趙麗萍，張紐枝，徐福春.西藏沙棘葉中化學(xué)成分的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（22）：75-76.

［12］付陽，王宇坤，劉明博，等.UPLC-ESIMS法同時(shí)測(cè)定沙棘黃酮中5種主要成分含量[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2016（3）：129-133.

［13］李淑珍，武飛，陳月林，等.沙棘葉總黃酮含量測(cè)定方法的建立[J].西北師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2015，51（6）：94-97.

［14］李淑珍，武飛，陳月林，等.沙棘葉總黃酮的提取工藝優(yōu)化[J].中國民族民間醫(yī)藥，2016，25（1）：14-16.

［15］安樂，郁長治，郭小娜.沙棘葉中總黃酮提取純化工藝研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（11）：154-155.

［16］張小民，翼頤之，張吉科，等.沙棘茶葉毒理學(xué)研究[J].沙棘，2001，14（1）：38-40.

［17］劉緒川，張國偉，李雅如，等.沙棘葉及沙棘制品殘?jiān)远拘栽囼?yàn)[J].青海畜牧獸醫(yī)雜志，1989（6）：13-14.

［18］劉艷豐，王晶，王文奇，等.沙棘葉黃酮對(duì)綿羊瘤胃代謝和血清指標(biāo)的影響[J].中國畜牧雜志，2016，52（7）：66-70.

Toxicologic Study on Corosolic Acid Concentrations of Seabuckthorn Leaves

WANGBin1，ZHANGQiongshu1，YANGXuefang1，ZHANGYangyang1，GUOHaili2，ZHANGXiaomin1
（1.College ofLife Science，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；
2.Shanxi Jinkehai Biological TechnologyCo.，Ltd.，Taiyuan 030006，China）

The acute oral toxicity,micronucleus test of bone marrow and sperm shape abnormality test in mice was applid on corosolic acid concentrations of seabuckthorn leaves according to the evaluation processes and methods of food safety toxicology.The acute oral toxicity showed the maximum tolerated dosesea（MTD）of seabuckthorn leaves concentrations through the mouth of mice was greater than 15 g/kg,indicating the seabuckthorn leaves concentrations had no toxic.The micronucleus test and sperm shape abnormality test demonstrated that the examined sample didn't presented mutagennicity.On the basis ofthe evaluation processes and methods of food safety toxicology,this study not only provided theoretical basis for edibility of seabuckthorn leaves concentrations,but promoted the seabuckthorn leaves exploitation actively.

Chinese seabuckthorn;leaves;extractive;toxicology

S793.6

：A文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：1002-2481（2017）02-0203-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.02.14

2016-11-17

王斌（1988-），男，山西晉中人，在讀碩士，研究方向：動(dòng)物學(xué)。張小民為通信作者。