谷子BAS1基因生物信息學(xué)分析及其在干旱脅迫下的表達(dá)分析

郭莎莎，溫思鈺，喬亞琪，武懿茂，段杰，李紅英

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801；2.農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原030031；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究所，山西太谷030801）

谷子BAS1基因生物信息學(xué)分析及其在干旱脅迫下的表達(dá)分析

郭莎莎1，溫思鈺1，喬亞琪1，武懿茂1，段杰1，李紅英2，3

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801；2.農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原030031；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究所，山西太谷030801）

BAS1是一種過(guò)氧化物酶，廣泛存在于植物中，具有清除生物體內(nèi)ROS、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)和分子伴侶的功能，在鹽脅迫、光氧化、干旱及低溫脅迫等方面起著重要的作用。通過(guò)生物信息學(xué)分析了谷子中的8個(gè)SiBAS1基因，并與近緣種高粱中SiBAS1基因進(jìn)行親緣關(guān)系比對(duì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高粱和谷子的SiBAS1基因家族同源性極高；對(duì)谷子SiBAS1基因進(jìn)行啟動(dòng)子分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，很多與干旱脅迫相關(guān)的響應(yīng)元件包括干旱響應(yīng)MYB結(jié)合位點(diǎn)MBS、低溫響應(yīng)元件LTR、熱響應(yīng)元件HSE、真菌誘導(dǎo)響應(yīng)元件Box-W1、乙烯響應(yīng)元件ERE、赤霉素響應(yīng)元件P-box、水楊酸響應(yīng)元件TCA-element和脫落酸響應(yīng)元件ABRE等；通過(guò)對(duì)勾勾母雞咀（GG，耐干旱品種）和晉汾16（JF16，干旱敏感品種）的SiBAS1基因轉(zhuǎn)錄組表達(dá)情況的分析發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下不同品種中同一SiBAS1基因的表達(dá)水平不同，且差異較大。其結(jié)果可為深入研究SiBAS1基因與谷子抗旱性的關(guān)系提供依據(jù)，且有助于SiBAS1基因?qū)Ω珊档捻憫?yīng)機(jī)制及作用機(jī)制的后續(xù)研究。

谷子；BAS1；干旱脅迫；抗旱性

谷子（Setaria italica）古稱粟，去皮即小米，是禾本科黍族狗尾草屬1年生草本植物，是我國(guó)北方主要的糧食作物之一[1]。谷子在我國(guó)分布廣泛，幾乎全國(guó)都有種植，但目前其產(chǎn)區(qū)主要分布在北方各省的干旱、半干旱地區(qū)[2]。有研究表明，近50 a來(lái)，東北、華北大部、西北東部降水量明顯減少，干旱化趨勢(shì)非常突出[3]。由于谷子主產(chǎn)區(qū)降水量逐年下降，干旱逐漸成為作物產(chǎn)量的主要限制因素。隨著人們對(duì)小米的了解逐漸加深，對(duì)小米的需求不斷增加，而谷子產(chǎn)量卻受到高溫、低溫、干旱等不良環(huán)境因素的極大影響，導(dǎo)致供給與需求之間存在很大差距。因此，研究谷子抗逆機(jī)制顯得尤為重要。

植物體內(nèi)的2-cys過(guò)氧化物酶被稱為BAS1[4]，是過(guò)氧化蛋白（Prxs）的一種。第1個(gè)被發(fā)現(xiàn)并被確定的Prxs是巰基特異性抗氧化蛋白thiol-specific antiorident protein（TSA），其能夠保護(hù)酵母和哺乳動(dòng)物的谷胱甘肽合成酶與DNA的完整性[5-6]。根據(jù)Cys殘基數(shù)目和位置的不同，將Prxs分為6種亞型（PrxsⅠ～Ⅵ），這6種亞型又可分為3個(gè)亞類[7]（2-Cys Prxs、非典型2-Cys Prxs和1-Cys Prxs）。其中，2-Cys Prxs具有清除生物體內(nèi)ROS、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)[8-10]和分子伴侶[11-12]的功能。

2-cys過(guò)氧化物酶在生物體內(nèi)普遍存在，已有研究重組大麥、大白菜、豌豆、油菜和水稻BAS1的酶學(xué)性質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小球藻、擬南芥和大麥BAS1在鹽、光氧化、干旱及低溫脅迫中參與去除活性氧毒性、抗氧化防御及氧化還原信號(hào)傳導(dǎo)，這種功能多樣性與BAS1的分子組成、亞細(xì)胞分布、組織特異性和脅迫因子有關(guān)[13]。然而，有關(guān)谷子SiBAS1基因家族的研究鮮見報(bào)道，谷子抗旱基因的研究也相對(duì)較少。

本研究就谷子中SiBAS1基因進(jìn)行分析，并分析勾勾母雞咀（GG，耐干旱品種）和晉汾16（JF16，干旱敏感品種）在PEG干旱脅迫下BAS1基因的表達(dá)情況，旨在研究谷子SiBAS1基因是否參與谷子對(duì)干旱逆境的脅迫應(yīng)答，為進(jìn)一步弄清谷子抗旱機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 研究材料

供試材料勾勾母雞咀和晉汾16由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究所提供[14]。

1.2 研究方法

1.2.1 谷子BAS1基因的生物學(xué)分析利用網(wǎng)站Phytozome v 11.0中谷子、高粱、擬南芥、水稻、谷子基因組數(shù)據(jù)（https://phytozome.jg i.doe.gov/pz/portal. html）進(jìn)行關(guān)鍵詞搜索，進(jìn)一步結(jié)合NCBI，GenBank等網(wǎng)站獲取BAS1基因的信息，并下載整理[15]。

使用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent. be/webtools/plantcare/html/）在線分析啟動(dòng)子元件。使用MEGA 7.0軟件中的Neibor-joining算法對(duì)下載的谷子BAS1氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。使用Multalin（http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html）進(jìn)行在線雙序列比對(duì)。

1.2.2 干旱情況下谷子BAS1基因的表達(dá)情況分析GG和JF16在人工氣候室中培養(yǎng)，采用營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石為3∶1的混合土種植，培養(yǎng)條件為：14 h光照28℃/10 h黑暗23℃，相對(duì)濕度為50%左右，光強(qiáng)為500 μmol/（m2·s）。出苗后2 d澆一次蒸餾水，培養(yǎng)21 d后，采用20%PEG-6000模擬干旱，處理材料0.5 h；對(duì)照用蒸餾水處理相同時(shí)間。每個(gè)處理取3株用于RNA的提取，并進(jìn)行表達(dá)譜測(cè)序[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子BAS1基因的基本信息

利用網(wǎng)站Phytozome v11.0中谷子、高粱、擬南芥、水稻基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)鍵詞搜索，結(jié)合NCBI網(wǎng)站獲取以上4種作物的部分BAS1的氨基酸序列共27個(gè)（其中，谷子有8個(gè)，高粱有11個(gè)，擬南芥有3個(gè)，水稻有5個(gè)），并制作了親緣關(guān)系分布圖（圖1）。然后取與谷子BAS1基因親緣關(guān)系最近的其他作物氨基酸序列進(jìn)行雙序列比對(duì)。

按照上述方法從谷子基因組中鑒定了8個(gè)SiBAS1基因，根據(jù)與高粱BAS1基因的同源性，暫時(shí)命名為SiBAS1-1～SiBAS1-8。從圖1可以觀察到各基因起源與進(jìn)化間的關(guān)系，所有BAS1基因被分為3組，谷子BAS1基因分布在3個(gè)不同的組中，Ⅰ組中包含SiBAS1-1，SiBAS1-2，SiBAS1-4和SiBAS1-6；Ⅱ組中包含SiBAS1-3和SiBAS1-5；Ⅲ組中包含SiBAS1-7和SiBAS1-8。在每組中還存在著平行同源性基因?qū)Α８鶕?jù)雙序列比對(duì)圖得出，SiBAS1-1基因與Sobic.004G086400.1基因，SiBAS1-2基因與Sobic.010G182966.1基因，SiBAS1-6基因與Sobic.002G398600.1基因（圖2），SiBAS1-4基因與Sobic.002G398600.1基因的氨基酸序列相似性極高，也表明谷子的BAS1可能與高粱的BAS1基因同源性極高。

表1 谷子BAS1基因的基本信息

由表1可知，SiBAS1-2基因和SiBAS1-3基因在第4染色體上，SiBAS1-1基因、SiBAS1-5基因、SiBAS1-7基因和SiBAS1-8基因在第1染色體上，SiBAS1-4基因在第2染色體上，SiBAS1-6基因在第5染色體上。

谷子BAS1基因家族中不同BAS1基因的內(nèi)含子數(shù)目、大小都存在差異（表1）。8個(gè)SiBAS1基因中，SiBAS1-4基因和SiBAS1-5基因均含有1個(gè)內(nèi)含子，SiBAS1-3基因含2個(gè)內(nèi)含子，SiBAS1-7基因和SiBAS1-8基因均含有6個(gè)內(nèi)含子，SiBAS1-1基因、SiBAS1-2基因和SiBAS1-6基因均含有4個(gè)內(nèi)含子。

2.2 谷子BAS1基因家族啟動(dòng)子元件

根據(jù)谷子的全基因組序列，選取CDS區(qū)上游3 000 bp的核苷酸序列作為啟動(dòng)子，用PlantCARE進(jìn)行在線分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了基本啟動(dòng)子元件TATA-box和CAAT-box外，谷子BAS1基因還含有很多與脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，包括脫落酸響應(yīng)元件ABRE、干旱響應(yīng)MYB結(jié)合位點(diǎn)MBS、熱響應(yīng)元件HSE、低溫響應(yīng)元件LTR、水楊酸響應(yīng)元件TCA-element、光響應(yīng)元件light等（表2）。

表2 啟動(dòng)子順式元件個(gè)

利用PlantCARE在線分析8個(gè)谷子SiBAS1基因啟動(dòng)子上游3 000 bp的順式作用元件，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，每個(gè)基因含有至少130個(gè)調(diào)控元件，最少的是SiBAS1-5基因，含有133個(gè)順式作用元件。調(diào)控SiBAS1-2基因的順式作用元件最多，高達(dá)167個(gè)。在SiBAS1-4中，與病蟲害脅迫相關(guān)的茉莉酸甲酯響應(yīng)元件TGACG-motif多達(dá)14個(gè)，是家族成員中最多的。有7個(gè)BAS1基因家族成員包含2～9個(gè)脫落酸響應(yīng)元件ABRE，其中，SiBAS1-2基因和SiBAS1-3基因均含有9個(gè)；SiBAS1-6基因沒(méi)有脫落酸響應(yīng)元件ABRE。BAS1家族成員包含1～5個(gè)干旱響應(yīng)MYB結(jié)合位點(diǎn)MBS，其中，SiBAS1-3基因和SiBAS1-4基因均含有5個(gè)。7個(gè)谷子BAS1基因家族成員中都包含30個(gè)以上的光響應(yīng)調(diào)控元件，其中，SiBAS1-2基因最多，高達(dá)57個(gè)。

2.3 谷子BAS1基因在干旱脅迫下的表達(dá)情況

對(duì)耐干旱品種勾勾母雞咀（GG）和干旱敏感品種晉汾16（JF16）分別進(jìn)行模擬干旱脅迫處理，使2個(gè)品種的處理組（Drought）和對(duì)照組（CK）中BAS1基因進(jìn)行表達(dá)，并對(duì)表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果表明，2個(gè)品種的SiBAS1-5基因在正常情況（CK）下的表達(dá)量都明顯高于各自在干旱脅迫情況（Drought）下的表達(dá)量，而且耐干旱品種GG在正常情況下表達(dá)量較高，但在干旱脅迫下表達(dá)量卻顯著下調(diào)（圖3）。

2個(gè)品種的SiBAS1-7基因在干旱脅迫情況（Drought）下的表達(dá)量都明顯高于各自在正常情況（CK）下的表達(dá)量，而且JF16品種的2種情況下的基因表達(dá)水平高于GG品種2種情況下基因表達(dá)水平。耐干旱品種GG的SiBAS1-7基因在正常情況下幾乎不表達(dá)，而在干旱脅迫下表達(dá)量顯著上調(diào)（圖3）。

干旱敏感品種JF16的SiBAS1-3基因在正常情況（CK）下的表達(dá)量顯著高于其在干旱脅迫情況（Drought）下的表達(dá)量；此基因在干旱脅迫情況（Drought）下的表達(dá)量顯著下降，且在干旱脅迫下幾乎不表達(dá)（圖3）。

3 討論與結(jié)論

BAS1是植物抗逆的重要物質(zhì)，廣泛存在于植物基因組中。通過(guò)對(duì)谷子SiBAS1基因組的分析，有利于我們了解SiBAS1基因基本特征及功能，對(duì)后續(xù)研究具有重要意義。

谷子BAS1基因在谷子基因組中呈不均勻分布，集中分布在第1，2，4，6染色體上。BAS1系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，谷子、高粱、擬南芥、水稻4種植物的BAS1家族可以分為3組，在每組中還存在著平行同源性基因?qū)?，其中，SiBAS1-6基因與Sobic. 002G398600.1基因的同源性最高。

通過(guò)對(duì)谷子SiBAS1基因啟動(dòng)子上游約3000bp進(jìn)行啟動(dòng)子分析，發(fā)現(xiàn)其中含有多個(gè)與逆境相關(guān)的順式作用元件，包括低溫響應(yīng)元件LTR、熱響應(yīng)元件HSE、真菌誘導(dǎo)響應(yīng)元件Box-W1、干旱響應(yīng)MYB結(jié)合位點(diǎn)MBS、乙烯響應(yīng)元件ERE、赤霉素響應(yīng)元件P-box、水楊酸響應(yīng)元件TCA-element和脫落酸響應(yīng)元件ABRE等。這些結(jié)果表明，BAS1基因可能正是通過(guò)這些順式作用元件參與了谷子對(duì)脅迫信號(hào)傳導(dǎo)途徑的應(yīng)答,在植物響應(yīng)脅迫過(guò)程中發(fā)揮作用。

通過(guò)對(duì)谷子3個(gè)SiBAS1基因的表達(dá)情況分析發(fā)現(xiàn)，耐干旱品種GC的SiBAS1-7基因在正常情況下幾乎不表達(dá)，而且在干旱脅迫下表達(dá)量顯著上調(diào)；而且此基因在干旱脅迫下干旱敏感品種JF16中表達(dá)量也增加，說(shuō)明該基因?qū)Ω珊得{迫有響應(yīng)，只是在不同品種中對(duì)干旱的響應(yīng)程度不同；2個(gè)品種的SiBAS1-7基因在干旱脅迫下均高表達(dá)，是否意味著它在谷子抗旱中的重要性，還值得更詳細(xì)和深入的研究。耐干旱品種GG和干旱敏感品種JF16的SiBAS1-5基因在干旱脅迫情況下表達(dá)量均下降，且耐干旱品種GC表達(dá)量下調(diào)明顯，說(shuō)明該基因?qū)Ω珊得{迫有響應(yīng)，且在2個(gè)品種中不具有表達(dá)特異性；干旱敏感品種JF16的SiBAS1-3基因在干旱脅迫情況下的表達(dá)量顯著下降，表明此基因可能與干旱脅迫有關(guān)。

結(jié)合啟動(dòng)子順式調(diào)控元件的預(yù)測(cè)結(jié)果分析，并未找出脅迫相關(guān)的調(diào)控元件與BAS1基因表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)。我們推測(cè)，可能有5個(gè)原因：一是同一基因在不同組織中的表達(dá)水平不同；二是SiBAS1基因的表達(dá)非常復(fù)雜，不僅會(huì)受其他外界條件的調(diào)控如光、溫度等，還會(huì)受內(nèi)部因素的誘導(dǎo)如內(nèi)源植物激素的影響；三是各種逆境之間存在信號(hào)交叉，并非所有BAS1都只與干旱脅迫相關(guān)，如在擬南芥的葉片生長(zhǎng)中，BAS1能夠保護(hù)光合組織免遭氧化脅迫[16]；四是在谷子的不同生育期，GG和JF16的抗旱性也有差別，如在孕穗期GG抗旱性較JF16強(qiáng)，但在灌漿期JF16抗旱性較GG強(qiáng)[14]；五是SiBAS1基因家族各成員的表達(dá)模式可能不盡相同，這與SiBAS1基因參與逆境應(yīng)答調(diào)控的信號(hào)途徑不同有一定的關(guān)系。

綜合以上分析，初步研究表明谷子BAS1家族中部分SiBAS1基因受干旱的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，因此推斷谷子中一些SiBAS1基因可能參與谷子對(duì)干旱逆境的脅迫應(yīng)答。目前，還不清楚SiBAS1基因的具體功能，而且其在谷子中的作用機(jī)制也不清楚，因此，要解決這一系列的困惑，仍需對(duì)進(jìn)化樹中垂直同源、平行同源基因?qū)χ谢虻木唧w功能與作用機(jī)制進(jìn)行更深入的研究。

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Bioinformatics Analysis ofBAS1Genes from Foxtail Millet（Setaria italica（L.）Beauv.）and Its Expression under Drought Stress

GUOShasha1，WENSiyu1，QIAOYaqi1，WUYimao1，DUANJie1，LI Hongying2，3
（1.College ofAgronomy，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China；2.KeyLabaratoryofCrop Gene Resources and GermplamEnhancement on Loess Plateau，MinistryofAgriculture，Taiyuan 030031，China；3.Institute ofAgricultural Bioengineering，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

BAS1 is a kind of peroxiredoxin in plant,which is widely distributed in almost every plant genome.BAS1 can remove ROS,which plays a vital role in the varies of aspects,such as the salt stress,light oxidation,drought and low temperature stresses,etc. This paper analysed eight SiBAS1 gene offoxtail millet through bioinformatics,and compared their relationship between SiBAS1 genes in sorghum.The results showed that foxtail mille was high homologous with sorghum.And analysed SiBAS1 genes promoter,and the result found that many was elements related to drought stress response including drought response MYB binding sites of MBS,lowtemperature response element LTR,thermal response element HSE,fungus induced response element Box-W1,ethylene response elements ERE, gibberellin response element P-box,salicylic acid response element TCA-element and abscisic acid response element ABRE,etc.And analysed GG（drought resistant varieties）and JF16（drought sensitive cultivars）peroxide protease gene expression,and the result found that for one SiBAS1 gene,its expression level was different in different varieties under drought stress.These results not only provide a foundation for the further study of the relationship between SiBAS1 gene and millet drought resistance,but also are helpful for further research on the response mechanismofthe SiBAS1 gene todrought.

foxtail millet;BAS1;drought stress;drought-resistance

S515

A文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：1002-2481（2017）02-0151-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.02.01

2016-09-13

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31471556）；地方高校國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（2015082）

郭莎莎（1993-），女，山西長(zhǎng)治人，在讀本科，研究方向：作物遺傳。李紅英為通信作者。