長鏈非編碼RNA CASC9靶向miR-195-5p對胰腺癌BxPC-3細胞增殖和凋亡的影響

陳志文 胡曉偉 樊勝杰

1湖北省襄陽市中西醫(yī)結合醫(yī)院普外科，襄陽 441004；2湖北省谷城縣人民醫(yī)院普外科，谷城 441700

近年來隨著測序技術和相關領域基因學的迅速發(fā)展，長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)的生物學功能逐漸受到重視。研究表明lncRNA 在生物體內生物學功能廣泛，尤其在基因轉錄后、細胞周期和分化等多個層面調控基因的表達[1]。lncRNA腫瘤易感性候選基因9 (cancer susceptibility candidate 9，CASC9)在食管鱗癌和肝癌中的表達明顯升高，發(fā)揮著重要的促癌作用[2-3]。微小RNA-195-5p(miR-195-5p)是一類抑癌基因，生物信息數據庫檢索發(fā)現(xiàn)miR-195-5p是CASC9下游靶點之一[4]，在骨肉瘤、肝癌、舌鱗癌等癌細胞中呈低表達狀態(tài)[5-6]。但目前有關 CASC9與miR-195-5p在胰腺癌中的作用機制尚不清楚。本研究檢測 CASC9在胰腺癌組織和細胞中的表達水平，分析 CASC9及其靶基因miR-195-5p對胰腺癌BxPC-3細胞增殖和凋亡的作用，以期為胰腺癌治療提供新的理論依據。

資料與方法

一、胰腺癌組織、細胞株CASC9和miR-195-5p表達檢測及兩者相關性分析

選取2017年4月至2018年5月間湖北省襄陽市中西醫(yī)結合醫(yī)院行手術切除并經組織病理學證實的40例胰腺癌患者的癌組織及相應癌旁正常胰腺組織(距離手術切緣>3 cm)。術前患者均未接受化療、放療等輔助治療。所有標本取下后立即放入-196℃液氮中保存。

應用Trizol法抽提胰腺癌組織及癌旁組織總RNA，RNA逆轉錄與擴增按試劑盒(日本TaKaRa公司)說明書操作，轉錄的cDNA再用GreenTMTB Premix Ex TaqTM(TliRnaseH Plus，日本TaKaRa公司)行實時熒光定量PCR反應。 CASC9正向引物序列5′-AGATGAAGCCGGTACCTCAGAT-3′，反向引物序列5′-TCACTTTAAAGAGGGAGAGGAG-3′；內參GAPDH正向引物序列5′-TATGATGATATCAAGAGGGTAGT-3′，反向引物序列5′-TGTATCCAAACTCATTGTCATAC-3′；U6正向引物序列5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物序列5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。通過儀器自帶軟件獲取擴增產物的Ct值，采用公式2-ΔΔCt計算各基因相對表達量，每個樣品設3個復管，取均值。

正常胰腺導管上皮細胞株HPDE6-C7及胰腺癌細胞株AsPC-1、HPAC、BxPC-3、PANC1均由中國科學院細胞庫提供，常規(guī)復蘇、傳代。取對數生長期細胞，采用上述相同方法檢測細胞CASC9表達量。

采用上述方法檢測20例胰腺癌組織miR-195-5p表達量。miR-195-5p正向引物序列5′-GATAGCAGCACAGAAATATTGGC-3′，反向引物序列5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′。分析胰腺癌組織miR-195-5p與CASC9表達水平的相關性。

二、胰腺癌BxPC-3細胞分組及檢測

1．BxPC-3細胞分組：將BxPC-3細胞分為si-CASC9組(轉染靶向lncRNA CASC9的siRNA)、si-control組(轉染與CASC9不匹配的siRNA)、CACS9組(轉染CASC9過表達質粒)和CASC9/miR-195-5p組(共轉染CASC9過表達質粒和miR-195-5p mimics)。所有siRNA、質粒及miR-195-5p mimics均由上海Gene Pharma公司設計、合成。使用脂質體2000試劑(Thermo Fisher Science，美國)進行細胞轉染，按照說明書操作。運用Geneticin(Sigma-Aldrich,美國)篩選出穩(wěn)定轉染的細胞株。

2．BxPC-3細胞增殖活性檢測：選用3～6代si-control組、si-CASC9組、CACS9組、CASC9/miR-195-5p組BxPC-3細胞，以每孔1×104個細胞均勻接種于96孔板，分別培養(yǎng)1、2、3、4 d，到時間點時每孔加入5 mg/ml MTT(武漢博士德生物科技有限公司)20 μl，繼續(xù)孵育4 h，每孔再加入150 μl DMSO，室溫搖床振蕩10 min，上酶標儀在490 nm處測定每孔的吸光度值(A490值)，繪制細胞生長曲線。

3．BxPC-3細胞凋亡相關蛋白Bax和Bcl-2檢測：收集si-control組、si-CASC9組、CACS9組、CASC9/miR-195-5p組BxPC-3細胞，加入蛋白裂解液(Roche,美國)抽提總蛋白，應用BCA法定量后常規(guī)行蛋白質免疫印跡法檢測Bax和Bcl-2蛋白表達，以GAPDH為內參?？笲ax抗體(ab32503，1∶1 000)和抗Bcl抗體(ab32124,1∶1 000)均購自英國Abcam公司，HRP二抗(1∶3 000)購自武漢博士德生物科技有限公司。最后ECL發(fā)光，X片曝光、顯影、定影。用Image J軟件分析，以目的條帶與內參條帶的灰度值比表示蛋白相對表達量。

三、lncRNA CASC9與miR-195-5p的關系驗證

從Starbase數據庫(http://starbase.sysu.edu.cn/)搜索CASC9的潛在靶向基因，通過熒光素酶報告基因法驗證lncRNA CASC9和miR-195-5p之間的靶向關系。將擴增的野生型(wild type, WT)lncRNA CASC9序列插入pmirGLO dual-luciferase miRNA target expression vector (Promega Corp，美國)，構建WT熒光報告載體pmirGLO-WT-CASC9。使用GeneArtTMSite-Directed Mutagenesis PLUS System(A14604, Thermo Fisher Scientific Inc.美國)推定突變lncRNA CASC9與miR-195-5p的結合位點，將突變體(mutant type, MT)lncRNA CASC9片段插入pmirGLO載體，構建MT熒光報告載體pmirGLO-MT-CASC9。將2個報告載體分別和miR-195-5p mimics或陰性對照mimics(mimics-NC)共轉染BxPC-3細胞(分別設為WT-CASC9/miR-195-5p組、MT-CASC9/miR-195-5p組和WT-CASC9/mimics-NC組、MT-CASC9/mimics-NC組)，48 h后按照試劑盒說明書測定熒光素酶活性。實驗重復3次。

四、統(tǒng)計學處理

結 果

一、胰腺癌組織和各細胞株lncRNA CASC9表達量

胰腺癌組織及其癌旁正常胰腺組織lncRNA CASC9表達量分別為4.70±1.25、2.15±0.82，癌組織顯著高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學意義(t= 2.95，P=0.04)。HPDE6-C7、AsPC-1、HPAC、BxPC-3、PANC1細胞株中l(wèi)ncRNA CASC9表達量分別為1.00±0.10、1.43±0.12、1.86±0.13、2.03±0.14、1.73±0.15，胰腺癌細胞株均顯著高于HPDE6-C7細胞，差異均有統(tǒng)計學意義(t值分別為4.77、9.08、10.37、7.01，P值均<0.001)。其中以BxPC-3細胞CASC9的表達量最高，故實驗均采用BxPC-3細胞。

二、抑制BxPC-3細胞lncRNA CASC9表達可抑制細胞增殖，促進細胞凋亡

si-CASC9組lncRNA CASC9表達水平顯著低于si-control組(0.26±0.026比1.00±0.06，t=19.56，P< 0.001)，表明抑制lncRNA CASC9表達的BxPC-3細胞株構建成功。

si-control組和si-CASC9組細胞的生長曲線見圖1A。培養(yǎng)第3、4天的si-CASC9組細胞較si-control組細胞的增殖活性顯著下降(0.57±0.05比0.72±0.04，t=4.05，P=0.01；0.75±0.07比0.95±0.07，t=3.49，P=0.02)，差異有統(tǒng)計學意義，提示抑制lncRNA CASC9表達可抑制BxPC-3細胞增殖。si-control組、si-CASC9組Bax 表達水平分別為1.07±0.11、1.39±0.13，Bcl-2表達水平分別為1.71±0.12、1.44±0.11，表明抑制lncRNA CASC9表達可顯著上調Bax(t=3.26，P=0.03)、下調Bcl-2表達水平(t=2.85，P=0.04)，提示抑制lncRNA CASC9表達可促進BxPC-3細胞凋亡(圖1B)。

三、lncRNA CASC9與miR-195-5p的靶向關系確定

來自Starbase數據庫下載圖所示，CASC9包含miR-195-5p的保守目標位點(圖2A)。20例胰腺癌組織lncRNA CASC9和miR-195-5p表達量見圖2B，計算出lncRNA CASC9和miR-195-5p之間的相關性系數R2=0.549，證實lncRNA CASC9與miR-195-5p表達之間存在負向調節(jié)的關系。雙熒光素酶報告法檢測結果顯示，WT-CASC9/miR-195-5p組、WT-CASC9/mimics-NC組、MT-CASC9/miR-195-5p組、MT-CASC9/mimics-NC組的熒光素酶活性分別為0.37±0.03、1.00±0.08、0.96±0.06、1.00±0.08，WT-CASC9/miR-195-5p組較MT-CASC9/miR-195-5p組顯著下降(t=12.77，P<0.001)，而WT-CASC9/mimics-NC組與MT-CASC9/mimics-NC組間的差異無統(tǒng)計學意義(t=0.75，P=0.49)，證實lncRNA CASC9和miR-195-5p之間可以靶向結合。

四、miR-195-5p逆轉CASC9促進胰腺癌細胞增殖和抑制細胞凋亡的作用

CASC9/miR-195-5p組中miR-195-5p mimics轉染對BxPC-3細胞CASC9的表達無顯著影響(2.45比2.33，t=1.44，P>0.05)，只是增加了細胞miR-195-5p的表達(0.37比0.88，t=13.97，P<0.001)。MTT實驗結果顯示，第2、3、4天時si-control組A490值分別為0.26±0.02、0.37±0.02、0.40±0.02，CASC9組分別為0.34±0.02、0.57±0.03、0.71±0.03，CASC9/miR-195-5p組分別為0.29±0.02、0.45±0.02、0.59±0.03。CASC9組細胞增殖活性較si-control組顯著增加(t=4.90、9.61、14.89，P值均<0.05)，而CASC9/miR-195-5p組細胞增殖活性較CASC9組顯著下降(t=3.06、5.77、4.90，P值均<0.05)，提示lncRNA CASC9促進BxPC-3胰腺癌細胞增殖的作用被miR-195-5p逆轉。蛋白質免疫印跡法結果顯示， CASC9組Bax表達水平顯著低于CASC9/miR-195-5p組(0.56±0.03比0.68±0.04，t=4.16，P=0.01)，Bcl-2表達顯著高于CASC9/miR-195-5p組(1.47±0.04比1.05±0.03，t=14.55，P<0.001(圖3)，提示lncRNA CASC9抑制BxPC-3細胞凋亡的作用被miR-195-5p逆轉。

圖1 si-control組和si-CASC9組BxPC-3細胞的生長曲線(1A)及Bax(1)和Bcl-2(2)蛋白的表達(1B)

圖2 CASC9與miR-195-5p結合位點(2A)及胰腺癌組織CASC9與miR-195-5p表達關系(2B)

圖3 si-control組(1)、CASC9組(2)、CASC9/miR-195-5p組(3)BxPC-3細胞及Bax、Bcl-2蛋白表達

研究顯示非編碼RNA在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中扮演著重要的角色[7-9]，其中l(wèi)ncRNAs生物學功能包括參與表觀遺傳調控、轉錄調控、轉錄后調控、miRNA調控、細胞分化及發(fā)育，其重要機制之一是通過對周圍的相關編碼基因的選擇性表達發(fā)揮調控作用[10]。例如lncRNA CASC9在食管癌中的表達明顯升高，抑制其表達能抑制食管癌細胞的發(fā)生和發(fā)展[11]。此外，有研究表明lncRNA CASC9可顯著抑制鼻咽癌和肝癌的惡性表型[2-13]。這些研究提示可通過在表達水平上具有顯著性差異的lncRNA來尋找包括胰腺癌在內的多種疾病診斷及治療的分子標志物。本研究首次證明胰腺癌組織和細胞系lncRNA CASC9表達顯著上調，抑制其表達能抑制胰腺癌細胞增殖，促進胰腺癌細胞凋亡，提示CASC9是一種促癌的lncRNA，在胰腺癌進展中起著關鍵作用。

miRNAs是內源性的小非編碼RNA，但與功能基因的表達密切相關[14]。miR-195-5p在許多腫瘤中表達下調，比如舌鱗狀細胞癌[15]和膀胱腫瘤[16]，目前被認為是一個抑癌的miRNA。最近研究發(fā)現(xiàn)lncRNAs通過作為miRNAs的競爭性內源RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)發(fā)揮作用。有研究表明，下調miR-196-5p的表達可促進原發(fā)性腹膜癌的腫瘤進展和維持腫瘤干細胞特征[17]。也有研究表明，miR-195-5p通過靶向子宮內膜癌中l(wèi)ncRNA PVT1發(fā)揮促癌作用[23]。受ceRNA調節(jié)網絡的啟發(fā)，本課題組假設lncRNA CASC9也可能是一種ceRNA。通過生物學信息和雙熒光素酶分析證實lncRNA CASC9能特異性結合miR-195-5p，功能性實驗表明CASC9與miR-195-5p的表達呈負相關，且miR-195-5p能逆轉CASC9促進胰腺癌惡性表型的效應，從而證明了CASC9可能作為胰腺癌細胞miR-195-5p的競爭性內源RNA發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究通過臨床樣本和體外細胞實驗證實，miR-195-5p通過靶向結合lncRNA CASC9可逆轉CASC9促胰腺癌細胞增殖和抑制胰腺癌細胞凋亡的作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突