跳骨片水提物對(duì)體外大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞活性的影響

鄭文偉+馬玉環(huán)+林平冬+陳后煌+邵翔+陳達(dá)+李西海+葉蕻芝

【摘 要】目的：探討跳骨片水提物對(duì)體外大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞活性的影響。方法：4周齡SPF級(jí)SD大鼠5只，采用機(jī)械-Ⅱ型膠原酶消化法獲取膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，倒置相差顯微鏡觀察軟骨細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，Ⅱ型膠原免疫組化染色鑒定軟骨細(xì)胞。0，25，50，100 μg·mL-1跳骨片水提物對(duì)第3代軟骨細(xì)胞，分別干預(yù)24，48，72 h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。結(jié)果：①Ⅱ型膠原免疫組化染色后軟骨細(xì)胞胞漿呈棕黃色，為陽(yáng)性；②以0 μg·mL-1跳骨片水提物干預(yù)的軟骨細(xì)胞作為對(duì)照組，干預(yù)24 h后，50 μg·mL-1組軟骨細(xì)胞活性明顯高于對(duì)照組（P < 0.05）；干預(yù)48 h后，25，50 μg·mL-1組明顯高于對(duì)照組（P < 0.05）；干預(yù)

72 h后，25，50，100 μg·mL-1組與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。結(jié)論：跳骨片水提物在25，50，100 μg·mL-1時(shí)均可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖，具有劑量和時(shí)間依賴性，其中50 μg·mL-1干預(yù)24 h后最為明顯。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎；跳骨片水提物；MTT法；軟骨細(xì)胞；大鼠

Effects of Aqueous Extract of Tiaogu Tablet（跳骨片）on the Activity of Rats Articular Chondrocytes in Vitro

ZHENG Wen-wei，MA Yu-huan，LIN Ping-dong，CHEN Hou-huang，SHAO Xiang，CHEN Da，LI Xi-hai，

YE Hong-zhi

【ABSTRACT】Objective：To investigate the effects of aqueous extract of Tiaogu Tablet（跳骨片）on the activity of rats articular chondrocytes in vitro.Methods：Articular cartilage cells were got from five 4-week-old SD rats of SPF grade by the mechanical typeⅡcollagenase digestion method and their morphology was observed under inverted microscope.The cartilage cells were identified by the typeⅡcollagen immunohistochemical staining.

After the third generation of chondrocytes were intervened with 0，25，50，100 μg·mL-1 of aqueous extract of Tiaogu Tablet respectively after 24，48，72 h，their activity was tested with MTT method.Results：

① Chondrocyte cytoplasm was brown and positive after staining；②The activity of chondrocytes intervened with 50 μg·mL-1 of aqueous extract of Tiaogu Tablet after 24 h was significantly higher than the control group with

0 μg·mL-1 of aqueous extract of Tiaogu Tablet（P < 0.05）.After intervention for 48 h，the activity of chondrocytes in groups intervened with 25，50 μg·mL-1 of extract was significantly higher than the control group

（P < 0.05）.After 72 h intervention，the differences between groups intervened respectively with 25，50，

100 μg·mL-1 of aqueous extract of Tiaogu Tablet and the control group were not statistically significant（P > 0.05）.

Conclusion：Aqueous extract of Tiaogu Tablet of 25，50，100 μg·mL-1 can promote the proliferation of chondrocytes，depending on dose and time，of which 50 μg·mL-1makes it obvious after 24-hour intervention.

【Keywords】 osteoarthritis；aqueous

extract of Tiaogu Tablet（跳骨片）；MTT method；

chondrocyte；rats

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨退變?yōu)橹鞯穆?、進(jìn)行性骨關(guān)節(jié)疾病[1-2]。OA始發(fā)部位在軟骨，以中老年人群最為常見(jiàn)。軟骨退變是多因素綜合作用的結(jié)果，軟骨細(xì)胞作為軟骨中的唯一細(xì)胞及軟骨破壞過(guò)程的靶細(xì)胞，其結(jié)構(gòu)的破壞及功能喪失在此過(guò)程中起著重要作用[3-4]。因此，采取保護(hù)軟骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)及調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞功能可能是防治OA重要途徑之一。目前治療OA的方法主要以對(duì)癥治療為主，缺乏特效療法。中醫(yī)藥在治療OA上具有多靶點(diǎn)、多方向、安全可靠、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)[5]。跳骨片具有活血舒筋、消腫定痛等功效[6]，但目前其在治療OA方面的研究甚少，因此初步研究跳骨片水提物對(duì)體外關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞活性的影響，有利于為OA的治療及跳骨片開(kāi)發(fā)利用提供一定理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4周齡雄性SPF級(jí)SD大鼠5只，體質(zhì)量60～80 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002。根據(jù)《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》（中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)）處理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物、試劑與儀器 跳骨片（福州屏山制藥有限公司）；胎牛血清（Gbico公司）；MTT、Ⅱ型膠原酶（Sigma公司）；DMEM低糖培養(yǎng)基（HyClone公司）；二甲基亞砜（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；DAB顯色試劑盒、免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱[力新儀器（上海）有限公司]；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-tek有限公司）。

2 方 法

2.1 跳骨片水提物的制備 跳骨片去糖衣，稱取粉碎后的粉末10.2 g，加入10倍量的蒸餾水浸泡

30 min，100 ℃回流提取3次，每次1 h，合并濾液并過(guò)濾，濾液濃縮至1 g·mL-1，真空低溫烘成浸膏備用。

2.2 軟骨細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 4周齡SPF級(jí)SD大鼠，取雙側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)，置于75%的酒精消毒15 min，在超凈臺(tái)內(nèi)用手術(shù)刀片打開(kāi)關(guān)節(jié)腔，分離關(guān)節(jié)面并切下股骨、脛骨的關(guān)節(jié)軟骨，PBS洗3次后切成1 mm3的小塊，加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的Ⅱ型膠原酶，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化，每2小時(shí)1000 r·min-1離心機(jī)離心5 min后收集上清液并離心收集細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，接著按一定的密度接種于培養(yǎng)瓶，于細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，重復(fù)收集至組織塊消化完畢為止，此時(shí)的細(xì)胞標(biāo)記為原代（P0），隔日進(jìn)行更換培養(yǎng)液。

2.3 軟骨細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 將培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡進(jìn)行觀察，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至瓶底面積80%～90%時(shí)，倒掉培養(yǎng)液，加入2 mL PBS洗

3次后吸掉殘液，加入0.25%胰蛋白酶500 μL，于37 ℃培養(yǎng)箱靜置2～3 min左右，倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞間隙變大、形狀變圓，立即加入細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，反復(fù)吹打至均勻后，平均分為2份接種于新的培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞傳至第2代（P2）時(shí)用于MTT實(shí)驗(yàn)。

2.4 軟骨細(xì)胞的免疫組化鑒定 將長(zhǎng)勢(shì)良好的P2細(xì)胞分為陽(yáng)性組和陰性對(duì)照組，并接種于6孔板中，放入細(xì)胞爬片，加入2 mL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)48 h，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次后0.5% Txiton-100處理15 min，PBS洗3次后3% H2O2處理

20 min，PBS洗3次后羊血清封閉60 min，

吸干封閉液，陽(yáng)性組4 ℃下一抗CollagenⅡ（1∶200）孵育過(guò)夜，而陰性對(duì)照組不進(jìn)行一抗CollagenⅡ孵育。PBS洗3次，二抗室溫孵育1 h后PBS洗3次，

DAB顯色5 min后自來(lái)水漂洗，蘇木素復(fù)染30 s后自來(lái)水蕩洗，晾干，封片，鏡下觀察。

2.5 跳骨片水提物溶液的配制 將“2.1”的浸膏置于干燥器至恒重，稱取一定量的浸膏，加入PBS配成10 mg·mL-1的母液，并用0.22 μm的濾頭過(guò)濾，用8%的培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋。

2.6 MTT法檢測(cè)跳骨片水提物對(duì)軟骨細(xì)胞活性的影響 將P2細(xì)胞以5×104·mL-1的密度接種于96孔

板，每孔為100 μL，置于培養(yǎng)箱24 h后，吸掉培養(yǎng)液，加入含0，25，50，100 μg·mL-1的跳骨片水提物濃度為8%的FBS培養(yǎng)液，并以含0 μg·mL-1跳骨片水提物干預(yù)的軟骨細(xì)胞作為對(duì)照組，每個(gè)濃度設(shè)置9個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24，48，72 h后，棄掉培養(yǎng)液，加入100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的MTT溶液，于培養(yǎng)箱內(nèi)4 h后棄掉MTT，加入150 μL的DMSO，充分振蕩10 min，酶標(biāo)儀490 nm檢測(cè)波長(zhǎng)測(cè)定其吸光度，結(jié)果取平均值。

2.7 主要觀察指標(biāo) 鑒定體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞及觀察跳骨片水體物對(duì)軟骨細(xì)胞活性影響。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間數(shù)據(jù)采用One-Way ANOVA方差分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的形態(tài)觀察 P0細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，大多數(shù)軟骨細(xì)胞開(kāi)始貼壁，圓形增大，見(jiàn)圖1（1）；培養(yǎng)72 h后軟骨細(xì)胞一般呈多角形或三角形，見(jiàn)圖1（2）。傳代后，第1代（P1）軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)以圓形或橢圓形為主，具有細(xì)胞密度依賴性，見(jiàn)圖1（3）、1（4）。P2軟骨細(xì)胞胞漿豐富、胞核清晰，增殖速度較快，呈不規(guī)則的立體“鋪路石”狀，見(jiàn)圖1（5）、1（6）。第3代（P3）軟骨細(xì)胞增殖速度相對(duì)減慢，出現(xiàn)“老化”現(xiàn)象，細(xì)胞開(kāi)始呈長(zhǎng)梭形，見(jiàn)圖1（7）、1（8）。

3.2 軟骨細(xì)胞的免疫組化鑒定 免疫組化結(jié)果顯示，陽(yáng)性組軟骨細(xì)胞的胞漿呈黃棕色，細(xì)胞核周圍和細(xì)胞膜周邊均有分布，細(xì)胞越密集的地方顏色越深，而陰性對(duì)照組未見(jiàn)棕黃色，所分離培養(yǎng)的細(xì)胞具有典型的軟骨細(xì)胞生物學(xué)特征。見(jiàn)圖2。

3.3 跳骨片水提物對(duì)軟骨細(xì)胞活性的影響 跳骨片水提物在適宜濃度范圍內(nèi)均能促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，但具有劑量和時(shí)間依賴性。與對(duì)照組比較，25，50，100 μg·mL-1跳骨片水提物在24，48，72 h均能促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，尤其50 μg·mL-1最為明顯，其在干預(yù)24，48 h時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），以24 h最為明顯。見(jiàn)圖3。

4 討 論

OA屬中醫(yī)學(xué)“痹證”“骨痹”范疇[7]。OA病在筋骨，病位于肝腎，腎氣不足則骨失充養(yǎng)，肝血不足則筋脈失養(yǎng)?！额愖C治裁·痹證論治》曰：“痹久必有痰濕敗而血瘀滯經(jīng)絡(luò)?！睔庋郎率菇?jīng)脈氣血運(yùn)行不暢，肌肉關(guān)節(jié)失去濡養(yǎng)，易致使關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞而誘發(fā)OA[5]。OA由于經(jīng)氣不暢，絡(luò)血不行，陽(yáng)氣不達(dá)，則邪氣肆虐，而生疼痛[8]。故OA與氣滯血瘀、肝腎虧虛、風(fēng)寒濕邪侵襲等因素有關(guān)?；谄渲嗅t(yī)病理特點(diǎn)，可以采取活血化瘀、補(bǔ)益肝腎、消腫定痛法進(jìn)行治療。跳骨片是由骨碎補(bǔ)（炒）、仙桃草、血竭、馬錢子（制）、黃芪、土鱉蟲(chóng)等

20味中藥制成的糖衣片，其中骨碎補(bǔ)、狗脊補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨[9-12]；馬錢子（制）、獨(dú)活、冰片、羌活、烏藥消腫定痛[13]；黃芪能夠促使血管重生，改善局部循環(huán)[14]；三七、紅花、土鱉蟲(chóng)舒筋活血、祛風(fēng)散寒。諸藥配伍合用，共奏補(bǔ)肝腎強(qiáng)筋骨、活血舒筋、祛風(fēng)散寒、消腫定痛的功效。

關(guān)節(jié)軟骨由軟骨細(xì)胞及軟骨基質(zhì)組成，軟骨細(xì)胞包埋于膠原與蛋白多糖等所形成的致密基質(zhì)中。Ⅱ型膠原酶消化法是軟骨細(xì)胞分離及體外培養(yǎng)的一種常用方法，但是其消化時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞有一定損傷[15]。本實(shí)驗(yàn)采用機(jī)械-Ⅱ型膠原酶消化法，將關(guān)節(jié)軟骨切成1 mm3的小塊，加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%Ⅱ型膠原酶消化獲取軟骨細(xì)胞。與胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶序貫消化法、單純Ⅱ型膠原酶消化法相比，此法操作相對(duì)簡(jiǎn)單，所需時(shí)間較短，污染幾率較小，同時(shí)可以獲得數(shù)量較多的軟骨[16]。倒置相差顯微鏡觀察不同時(shí)期軟骨細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著原代培養(yǎng)及傳代可以獲得較高純度的軟骨細(xì)胞。Ⅱ型膠原蛋白屬于軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，常作為軟骨細(xì)胞鑒定的生物標(biāo)記物。Ⅱ型膠原免疫組化染色鑒定及形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，P3軟骨細(xì)胞胞漿豐富、胞核清晰，增殖速度較快，純度高，具有典型軟骨生物學(xué)特征，故選用此時(shí)期的軟骨細(xì)胞進(jìn)行傳代干預(yù)。

軟骨退變是OA的主要病理特征，軟骨功能與結(jié)構(gòu)的相關(guān)性主要取決于軟骨細(xì)胞和周圍基質(zhì)動(dòng)態(tài)的相互影響。軟骨細(xì)胞能合成和分泌基質(zhì)，在軟骨形成、修復(fù)及代謝過(guò)程中起著重要作用[17]。OA中軟骨細(xì)胞數(shù)量隨著病情加重而下降，同時(shí)加上基質(zhì)異常鈣化及細(xì)胞數(shù)量變化跟軟骨纖維化的增加頻率呈一致性，說(shuō)明軟骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)是引起OA的一個(gè)重要因素[18]。因此，促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖可能是防治OA的一個(gè)有效途徑。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)MTT法分析跳骨片水提物對(duì)體外大鼠軟骨細(xì)胞活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，跳骨片水提物在25，50，100 μg·mL-1時(shí)均能增強(qiáng)軟骨細(xì)胞活性，其中以50 μg·mL-1干預(yù)24 h最為明顯，說(shuō)明跳骨片具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖的功能，提示了其很可能是一種潛力治療OA的藥物。但是由于OA發(fā)病機(jī)制不明確，加上跳骨片所含化學(xué)成分多且復(fù)雜，因此有待進(jìn)一步研究。

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收稿日期：2016-07-21；修回日期：2016-09-18