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      4種血清型登革病毒多表位重組抗原的表達(dá)及血清學(xué)初步評(píng)價(jià)

      2017-02-17 07:10:11易方浩張俊愛黎四平余詩炎代友超莊澤崗鄭碧英徐軍發(fā)
      關(guān)鍵詞:表位血清型抗原

      易方浩,張俊愛,黎四平,賈 巖,陳 晨,余詩炎,王 鑫,代友超,莊澤崗,鄭碧英,徐軍發(fā)

      4種血清型登革病毒多表位重組抗原的表達(dá)及血清學(xué)初步評(píng)價(jià)

      易方浩1,張俊愛1,黎四平2,賈 巖1,陳 晨1,余詩炎1,王 鑫1,代友超1,莊澤崗1,鄭碧英1,徐軍發(fā)1

      目的 在原核表達(dá)系統(tǒng)中對(duì)登革病毒包膜蛋白(E蛋白)和非結(jié)構(gòu)蛋白1(NS1)融合的B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行表達(dá)、純化及血清學(xué)評(píng)價(jià)。方法 將B細(xì)胞抗原表位用形成α螺旋的連接肽(EAAAK)2作為接頭,串聯(lián)合成1條全新的多表位融合重組基因rE,將其克隆到原核表達(dá)載體pET-28a(+)中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白,用鎳柱對(duì)重組蛋白純化,并用SDS-PAGE 和Western blot方法鑒定表達(dá)產(chǎn)物。以融合蛋白為抗原,用間接ELISA檢測(cè)登革熱病人血清IgM抗體。結(jié)果 重組表達(dá)載體pET28a-rE構(gòu)建成功,并在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達(dá)。融合蛋白主要以包涵體形式存在,用鎳柱純化獲得高純度的目的蛋白,SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示蛋白分子量大小與預(yù)期結(jié)果相符,建立的間接ELISA具有較高的準(zhǔn)確性。結(jié)論 原核表達(dá)的登革病毒多表位融合蛋白具有良好的血清學(xué)檢測(cè)價(jià)值。

      登革病毒;抗原蛋白;原核表達(dá);血清學(xué)評(píng)價(jià)

      登革熱是由有4種血清型的登革病毒引起,通過伊蚊叮咬而傳播的蟲媒病毒傳染病[1],預(yù)計(jì)全球有大約一半的人口處于感染的風(fēng)險(xiǎn),每年有3.9億登革熱感染者[2-3]。登革病毒4種不同血清型(DENV-1~4)分布在全球的熱帶和亞熱帶地區(qū),每一種血清型都可引起嚴(yán)重的疾病[4],對(duì)于登革熱傳染病沒有特效的治療[5],目前已有全球獲批的首個(gè)登革熱疫苗Dengvaxia可用于預(yù)防登革熱[6]。登革病毒基因組編碼衣殼蛋白(C蛋白)、膜蛋白(M 蛋白)和包膜蛋白(E 蛋白)3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(non-structure protein,NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)[7-8]。登革病毒的E蛋白和NS1蛋白都是抗體的主要靶點(diǎn),其中E蛋白作為構(gòu)成病毒體表面的主要成分,在抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中作為最主要的靶點(diǎn)[9]。E蛋白含有約500個(gè)氨基酸,其中N端約400個(gè)氨基酸組成的膜外區(qū)從結(jié)構(gòu)和功能上分為3個(gè)結(jié)構(gòu)域:從氨基端到羧基端分別為結(jié)構(gòu)域I(EDI)、結(jié)構(gòu)域Ⅱ(EDII)和結(jié)構(gòu)域Ⅲ(EDIII)[10]。EDⅢ含有多重構(gòu)象的中和表位,是E蛋白中最主要的抗原區(qū)域[11],多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)EDIII含有登革病毒單一血清型特異性表位和2~3種血清型的亞復(fù)合體反應(yīng)表位以及4種血清型的復(fù)合體反應(yīng)表位[12]。

      本研究采用原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)登革病毒E蛋白和NS1蛋白融合的B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行表達(dá),為登革檢測(cè)試劑的開發(fā)提供候選抗原,為進(jìn)一步開發(fā)登革抗體診斷試劑盒和新型登革疫苗奠定基礎(chǔ)。

      1 材料與方法

      1.1 主要材料 大腸桿菌DH5α及表達(dá)載體pET-28a (+)購自上海捷瑞生物工程有限公司,PCR反應(yīng)所用試劑、各種限制性內(nèi)切酶和DNA Marker購自寶生物工程(大連)有限公司,質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技有限公司,BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司,Protein Marker購自Thermo公司,IPTG、Acr、Bis和Tris購自Sigma公司,SDS購自Amresco公司,0.22 μm無菌濾器和透析袋購自Millipore公司,Ni-NTA親和層析柱購自美國GE公司,抗6×H is 抗體購自Life Technologies公司,HRP標(biāo)記的鼠抗人IgM購自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司,HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG、抗登革病毒E蛋白抗體(兔多抗)和抗登革病毒NS1蛋白抗體(兔多抗)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司,其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

      1.2 方法

      1.2.1 B細(xì)胞抗原表位的選擇 參考文獻(xiàn)[13-14],選擇通過計(jì)算機(jī)軟件篩選4種血清型登革病毒E蛋白共有的優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞抗原表位和能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的NS1蛋白共有抗原表位,各表位的來源、氨基酸序列及位置見表1。

      1.2.2 融合基因的設(shè)計(jì)及合成 本研究把表1中登革病毒E蛋白和NS1蛋白的B細(xì)胞抗原表位序列用連接肽(EAAAK)2串聯(lián)表達(dá),構(gòu)思和連接順序如下:E蛋白序列1(3~14)+連接肽+ NS1蛋白序列(225~245)+連接肽+ E蛋白序列2(67~110)+連接肽+E蛋白序列3(244~276)+連接肽+E蛋白序列4(305~427),其中E蛋白序列4包含EDIII序列(305~394),以上E蛋白序列均為1~4型登革病毒共有的氨基酸序列,見參考文獻(xiàn)[13],連接后的氨基酸序列見圖1;因在大腸桿菌BL21 (DE3)中表達(dá),所以選用大腸桿菌EscherichiacoliK12的偏嗜密碼子對(duì)基因進(jìn)行優(yōu)化,但不改變編碼的氨基酸序列。優(yōu)化后的多表位基因(命名為rE基因)大小約816 bp,委托上海捷瑞生物工程有限公司合成其基因序列,用DNAStar分析其抗原性。

      表1 登革病毒各抗原表位氨基酸序列
      Tab.1 Epitope amino acid sequences of dengue virus

      表位來源Epitopesources氨基酸序列Aminoacidsequences位置PositionECVGVGNRDFVEG3-14ENTTTDSRCPTQGEA67-80EVDRGWGNGCGLFG98-110EAKKQEVVVLGSQEGA244-258EMHTALTGATEIQTSGGTT259-276EWFKKGSSIGKMF391-402EGDTAWDFGSVGG416-427NS1WPKSHTLWSNGVLESEMIIPK225-245

      圖1 登革病毒重組抗原蛋白氨基酸序列

      Fig.1 Amino acid sequence of dengue virus recombinant antigen protein

      1.2.3 rE基因的PCR擴(kuò)增和原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 根據(jù)rE基因序列,設(shè)計(jì)1對(duì)引物,在5′和3′端分別加入NcoI和XhoI酶切位點(diǎn),按照常規(guī)體系,以rE基因克隆質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR,將NcoI和XhoI雙酶切的PCR產(chǎn)物與表達(dá)載體pET-28a(+)用T4DNA連接酶連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,抽取質(zhì)粒進(jìn)行PCR,用XbaI、XhoI雙酶切鑒定陽性克隆,并對(duì)序列進(jìn)行測(cè)序分析。正確的重組質(zhì)粒命名為pET28a-rE。

      1.2.4 重組質(zhì)粒的表達(dá) 將經(jīng)鑒定正確的重組質(zhì)粒pET28a-rE轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,涂布于含50 mg /L卡那霉素的LB平板,37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取生長(zhǎng)良好的單菌落,接種于4 mL含50 mg /L卡那霉素的LB培養(yǎng)基,37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。取培養(yǎng)過夜的培養(yǎng)基250 μL接種到5 mL含50 mg /L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中,220 r/min搖菌,直到OD600為0.5~0.7。

      1.2.5 融合蛋白的可溶性分析 誘導(dǎo)前立即取1 mL樣本,10 000 g離心2 min,棄上清,用80 μL 1×PBS緩沖液重懸菌體沉淀后加入20 μL的5× loading buffer作為非誘導(dǎo)對(duì)照。向剩余的培養(yǎng)物中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0.5 mmol/L,分別在37 ℃和15 ℃,220 r/min振搖4 h和16 h,誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá),收集第2個(gè)1 mL樣本,12 000 g離心2 min,棄上清,用80 μL 1×PBS緩沖液重懸菌體沉淀后加入20 μL的5 × loading buffer作為誘導(dǎo)對(duì)照。從剩余的培養(yǎng)物中分別取37 ℃和15 ℃誘導(dǎo)后菌液2 mL,10 000 g離心2 min,棄上清,加500 μL的50 mmol/L Tris、300 mmol/L NaCl、pH 8.0緩沖液到離心后的沉淀混勻,超聲波破碎,分別收集上清溶液和菌體沉淀,SDS-PAGE電泳檢測(cè)融合蛋白在菌體沉淀和上清溶液中的表達(dá)情況。

      1.2.6 純化包涵體蛋白 5 L表達(dá)菌液,加入0.5 mmol/L IPTG在37 ℃振蕩培養(yǎng)4 h后,離心收集菌體,加50 mmol/L Tris、300 mmol/L NaCl、pH 8.0裂解液混勻,超聲破碎后12 000 r/min離心15 min。離心后的上清制樣檢測(cè),離心后的沉淀用8 mol/L尿素重新溶解,16 000 r/min離心15 min,上清加入鎳柱孵育1 h,用含50 mmol/L Tris、500 mmol/L NaCl、8 mol/L尿素、20 mmol/L咪唑、pH8.0緩沖液進(jìn)行洗雜,用含50 mmol/L Tris、500 mmol/L NaCl、8 mol/L尿素、500 mmol/L咪唑、pH 8.0緩沖液進(jìn)行洗脫,透析到含有25 mmol/L Tris、300 mmol/L NaCl、pH 8.0緩沖液過夜,再用超濾濃縮管濃縮透析后的溶液,采用BCA法測(cè)定其濃度。

      1.2.7 純化產(chǎn)物的Western blot鑒定 純化的重組蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE分離后,電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,將其浸在PBST(含5%BSA)中,37 ℃封閉2 h,PBST洗滌3次,將膜分別與His-Tag單抗、兔抗登革病毒E蛋白多克隆抗體和兔抗登革病毒NS1蛋白多克隆抗體溫育1 h,洗滌,最后與HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體溫育1 h,顯色。

      1.2.8 自研間接ELISA檢測(cè)登革熱病人血清IgM抗體 收集臨床診斷為登革熱的血清標(biāo)本8例和正常人血清標(biāo)本8例,這8份登革熱血清標(biāo)本通過登革病毒診斷試劑盒檢測(cè)血清NS1抗原和IgM抗體都是陽性,該試劑盒來自中山生物工程有限公司,應(yīng)用間接ELISA原理檢測(cè)人血清或血漿中登革病毒IgM抗體。本研究用5 μg重組蛋白包被ELISA板,用間接ELISA檢測(cè)以上收集的標(biāo)本,操作步驟參考上述試劑盒說明書,利用ROC曲線法確定陰陽性血清最佳臨界值,取靈敏度和特異性之和最大的點(diǎn)定為臨界點(diǎn)(cut off值)。

      2 結(jié) 果

      2.1 表達(dá)載體中的rE基因的序列分析 采用DNAStar軟件中的protean對(duì)rE基因表達(dá)的蛋白進(jìn)行分析,結(jié)果顯示該重組多表位蛋白有良好的親水性、柔性、抗原性及表面可及性,分析結(jié)果見圖2。

      圖2 rE基因多表位蛋白的生物信息學(xué)分析Fig.2 Bioinformatic analysis of multiple epitopes of rE gene

      M:DNA marker DL2000;1: PCR product of recombinant plasmid containing target gene; 2: PCR product of the plasmid was extracted after transformation of BL21 (DE3); 3: PCR product of empty plasmid.圖3 重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-rE的PCR鑒定Fig.3 Identification of recombinant expression plasmid pET28a-rE by PCR

      2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 陽性菌經(jīng)質(zhì)粒PCR鑒定,可見477 bp的目的條帶,見圖3。提取的質(zhì)粒用XbaI和XhoI雙酶切,可見約5.1 kb的載體條帶和863 bp的目的條帶,見圖4。測(cè)序結(jié)果顯示其堿基序列與設(shè)計(jì)的rE基因序列完全一致,并形成完整的開放閱讀框,表明rE基因已成功克隆至原核表達(dá)載體pET-28a(+)上。

      M:DNA marker DLTM10000;1:The recombinant expression plasmids were digested with XbaI and XhoI.圖4 重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-rE的酶切鑒定Fig.4 Recombinant expression plasmid pET28a-rE was digested by restriction enzyme digestion

      2.3 不同溫度誘導(dǎo)的重組蛋白表達(dá)結(jié)果 表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析,可見相對(duì)分子質(zhì)量約32 kDa的目的蛋白條帶,大小與預(yù)期相符。重組蛋白在15 ℃表達(dá)量很低,在37 ℃條件下的表達(dá)量高,主要是以包涵體的形式存在于沉淀中,通過灰度掃描軟件分析顯示其表達(dá)的重組蛋白約占超聲破碎后沉淀蛋白量的57%,結(jié)果見圖5。

      M: Protein marker; 1: Pre-induction samples; 2: Samples after induction at 37℃; 3: Supernatant of BL21(DE3)/ pET28a-rE after induction at 15℃; 4: Precipitate of BL21(DE3)/ pET28a-rE after induction at 15 ℃; 5: Supernatant of BL21(DE3)/ pET28a-rE after induction at 37 ℃; 6: Precipitate of BL21(DE3)/ pET28a-rE after induction at 37 ℃.圖5 不同溫度誘導(dǎo)的重組蛋白表達(dá)形式的SDS-PAGE結(jié)果分析Fig.5 SDS-PAGE analyses of recombinant proteins induced at different temperature

      2.4 融合蛋白的包涵體破碎及純化 純化的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析,可見相對(duì)分子質(zhì)量約32 kDa的目的蛋白條帶,通過灰度掃描軟件分析,純化前重組蛋白約占變性重溶離心后上清蛋白量的48%,純化后重組蛋白純度可達(dá)95%以上,濃度約0.5 mg/mL,結(jié)果見圖6。

      M:Protein marker;1:Re-dissolved after degeneration and then the precipitate was analyzed after centrifugation;2:Re-dissolved after degeneration and then the supernatant was analyzed after centrifugation;3:Collected liquid of inclusion body protein after column;4: The non-target protein was eluted with 20 mmol/L imidazole;5: The target protein was eluted with 500 mmol/L imidazole. 圖6 重組蛋白純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of purified recombinant protein products

      2.5 Western blot鑒定 Western blot結(jié)果分析顯示,純化的重組蛋白分別與His-Tag單抗、兔抗E蛋白和兔抗NS1蛋白多克隆抗體特異性結(jié)合,在相對(duì)分子質(zhì)量約32 kDa附近可見特異性反應(yīng)條帶,見圖7。此外,圖7C顯示,重組蛋白在預(yù)期分子量附近還有其它反應(yīng)條帶,其原因可能是兔抗NS1蛋白多克隆抗體特異性不強(qiáng)。

      A: Recombinant protein was detected by immunoblotting with His-Tag monoclonal antibody;M: Protein marker;S: Purified recombinant protein.B: Western blotting was used to detect the expression of recombinant protein by rabbit anti-E protein polyclonal antibody; M: Protein marker;1: Negative control;2: Rabbit anti-E protein polyclonal antibody.C: Western blotting was used to detect the expression of recombinant protein by rabbit anti-NS1 protein polyclonal antibody;1: Rabbit anti-NS1 protein polyclonal antibody.圖7 純化產(chǎn)物的Western blot分析Fig.7 Western blot of purified recombinant protein

      2.6 重組蛋白應(yīng)用于間接ELISA的血清學(xué)評(píng)價(jià) 以自研間接ELISA檢測(cè)后讀取OD值,檢測(cè)結(jié)果見表2。利用ROC曲線得到cut off值,當(dāng)cut off值為0.377 5時(shí),該診斷方法的靈敏度和特異性均為100%,ROC曲線如圖8所示,曲線下面積為1,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說明這種診斷方法的準(zhǔn)確性較高。

      圖8 間接ELISA檢測(cè)登革病人血清ROC曲線圖Fig.8 ROC of indirect ELISA in detecting sera from dengue patients

      表2 自研間接ELISA檢測(cè)結(jié)果
      Tab.2 Self-study indirect ELISA test results

      檢測(cè)指標(biāo)Detectionindex登革熱病人血清Denguepatientsserum正常人血清NormalhumanserumPBS(陰性對(duì)照)PBS(Negativecontrol)OD值ODvalue0.4240.4720.4690.4690.3990.4670.3930.4090.2380.2510.2370.2810.3560.3620.2230.3110.0340.0350.047

      3 討 論

      目前,登革病毒感染的實(shí)驗(yàn)室診斷主要有病毒分離培養(yǎng)、抗原檢測(cè)、核酸檢測(cè)和血清學(xué)檢測(cè)。跟病毒分離培養(yǎng)和核酸檢測(cè)相比,血清學(xué)檢測(cè)由于價(jià)錢相對(duì)便宜和快速簡(jiǎn)便,因而在登革病毒感染的診斷中最常用,特別是對(duì)于抗登革病毒IgM抗體的檢測(cè)[1,15]。國際公認(rèn)研制較為成功的是澳大利亞PanBio公司生產(chǎn)的登革病毒IgM捕獲ELSIA試劑盒,它采用登革病毒1-4型E基因N端80%的重組蛋白,4種重組抗原混和后應(yīng)用于檢測(cè)登革病毒感染者血清,具有高靈敏度和特異性[16]。從理論上來說四種型別登革病毒混合抗原具有更多的IgM抗體結(jié)合位點(diǎn),但更多的IgM抗體結(jié)合位點(diǎn)往往會(huì)存在更大的空間位阻,有可能降低了抗原抗體結(jié)合的有效性。Panbio公司生產(chǎn)的登革病毒IgM捕獲ELSIA試劑盒采用C6/36細(xì)胞培養(yǎng)登革病毒制備的混合抗原,不僅成本高,而且具有病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)。本研究采用基因工程技術(shù)制備單一重組蛋白,更易于標(biāo)準(zhǔn)化、表達(dá)量高、不易污染且價(jià)格低廉。

      一種有效的登革熱疫苗應(yīng)能夠同時(shí)對(duì)4種血清型的登革病毒具有持久的抗病毒保護(hù)作用[17],登革病毒E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ已成為重組亞單位疫苗發(fā)展的焦點(diǎn)[18-19]。研究表明能夠同時(shí)針對(duì)4種血清型登革病毒,具有均衡且持久的抗病毒保護(hù)性免疫的登革熱疫苗組分除了結(jié)構(gòu)蛋白成分外還可能需要登革病毒NS1蛋白組分[20-22]?;谝陨系难芯繄?bào)道,本研究構(gòu)建的重組蛋白成分里包含4種血清型登革病毒共有的EDIII和NS1蛋白抗原表位。

      為了更好地保持登革病毒各個(gè)B細(xì)胞表位的功能活性,本研究采用連接肽介入技術(shù),連接肽的選擇對(duì)構(gòu)建有功能活性的融合蛋白很重要??紤]到功能域分離的空間與融合蛋白的穩(wěn)定性和生物活性密切相關(guān),剛性α螺旋連接肽在重組融合蛋白中最常使用的是(EAAAK)n (n≤6)[23],所以選用剛性連接肽(EAAAK)2。與柔性連接肽相比,剛性連接肽優(yōu)勢(shì)在于能提供相對(duì)穩(wěn)定和可控的隔離效果,并且使融合蛋白較為穩(wěn)定,不易被蛋白酶降解[24]。

      本研究利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)4種血清型登革病毒多表位重組抗原,初步證明重組蛋白具有較好的免疫反應(yīng)活性,可望用于登革熱的臨床血清學(xué)診斷。

      [1] Guzman MG, Harris E. Dengue[J]. Lancet, 2015, 385(9966): 453-465.

      [2] Bhatt S, Gething PW, Brady OJ, et al. The global distribution and burden of dengue[J]. Nature, 2013, 496(7446): 504-507.

      [3] Shepard DS, Undurraga EA, Betancourt-Cravioto M, et al. Approaches to refining estimates of global burden and economics of dengue[J]. PLoS Negl Trop Dis, 2014, 8(11): e3306.

      [4] Diamond MS, Pierson TC. Molecular insight into dengue virus pathogenesis and its implications for disease control[J]. Cell, 2015, 162(3): 488-492.

      [5] Capeding MR, Tran NH, Hadinegoro SR, et al. Clinical efficacy and safety of a novel tetravalent dengue vaccine in healthy children in Asia: a phase 3, randomised, observer-masked, placebo-controlled trial[J]. Lancet, 2014, 384(9951): 1358-1365.

      [6] Durbin AP. A dengue vaccine[J]. Cell, 2016, 166(1): 1.

      [7] McArthur MA, Sztein MB, Edelman R. Dengue vaccines: recent developments, ongoing challenges and current candidates[J]. Expert Rev Vaccines, 2013, 12(8): 933-953.

      [8] Lindenbach BD, Rice CM. Molecular biology of flaviviruses[J]. Adv Virus Res, 2003, 59: 23-61.

      [9] Li M, Jin X. Current progress and future perspectives of dengue vaccine development[J]. Chem Life, 2014(1): 29-38. (in Chinese)

      李敏, 金俠. 登革病毒疫苗研究現(xiàn)狀與展望[J]. 生命的化學(xué), 2014(1):29-38.

      [10] Kuhn RJ, Zhang W, Rossmann MG, et al. Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion[J]. Cell, 2002, 108(5): 717-725.

      [11] Kou TT, Ding TB. Recent advances on the structure and function of E protein of Flaviviruses[J]. Prog in Microbiol Immunol, 2014(3): 49-53. (in Chinese)

      寇甜甜, 丁天兵. 黃病毒屬病毒E蛋白結(jié)構(gòu)和功能研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展, 2014(3):49-53.

      [12] Li XQ. Neutralizing epitopes and functional study of antibodies against envelope protein domain III of dengue virus[D]. Guangzhou: Southern Medical University, 2013. (in Chinese)

      李孝權(quán). 登革病毒包膜E蛋白Ⅲ區(qū)抗體中和表位與功能研究[D]. 廣州:南方醫(yī)科大學(xué), 2013.

      [13] Hussain M, Idrees M, Afzal S. Development of global consensus of dengue virus envelope glycoprotein for epitopes based vaccine design[J]. Curr Comput Aided Drug Des, 2015, 11(1): 84-97.

      [14] Omokoko MD, Pambudi S, Phanthanawiboon S, et al. A highly conserved region between amino acids 221 and 266 of dengue virus non-structural protein 1 is a major epitope region in infected patients[J]. Am J Trop Med Hyg, 2014, 91(1): 146-155.

      [15] Guzman MG, Halstead SB, Artsob H, et al. Dengue: a continuing global threat[J]. Nat Rev Microbiol, 2010, 8(12 Suppl): S7-S16.

      [16] Niu G, Pang Z, Guan C, et al. Dengue virus envelope domain III protein based on a tetravalent antigen secreted from insect cells: Potential use for serological diagnosis[J]. Virus Res, 2015, 201: 73-78.

      [17] Fahimi H, Sadeghizadeh M, Mohammadipour M. In silico analysis of an envelope domain III-based multivalent fusion protein as a potential dengue vaccine candidate[J]. Clin Exp Vaccine Res, 2016, 5(1): 41-49.

      [18] Gottschamel J, Lossl A, Ruf S, et al. Production of dengue virus envelope protein domain III-based antigens in tobacco chloroplasts using inducible and constitutive expression systems[J]. Plant Mol Biol, 2016, 91(4/5): 497-512.

      [19] Ren SF, Cao GM, Tan F, et al. Construction of fusion immunoadjuvants Lipo peptides and envelope protein EDIII dengue virus tetravalent vaccine and its immune effect[J]. Chin J Zoonoses, 2016, (2): 119-123. (in Chinese)

      任守鳳, 曹國梅, 譚峰, 等. 融合免疫佐劑Lipo多肽與包膜蛋白EDⅢ區(qū)的登革病毒四價(jià)疫苗的構(gòu)建及免疫效應(yīng)研究[J]. 中國人獸共患病學(xué)報(bào), 2016, (2):119-123.

      [20] Chokephaibulkit K, Perng GC. Challenges for the formulation of a universal vaccine against dengue[J]. Exp Biol Med (Maywood), 2013, 238(5): 566-578.

      [21] Halstead SB. Identifying protective dengue vaccines: guide to mastering an empirical process[J]. Vaccine, 2013, 31(41): 4501-4507.

      [22] Swaminathan S, Batra G, Khanna N. Dengue vaccines: state of the art[J]. Expert Opin Ther Pat, 2010, 20(6): 819-835.

      [23] Li JF, Wang CJ, Wu MC. Design of linker peptides and its application in fusion protein[J]. J Food Sci Biotechnol, 2015, (11): 1121-1127. (in Chinese)

      李劍芳, 王春娟, 鄔敏辰. 連接肽的設(shè)計(jì)及在融合蛋白中的應(yīng)用[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2015(11):1121-1127.

      [24] Huang ZL, Zhang C, Wu X, et al. Recent progress in fusion enzyme design and applications[J]. Chin J Biotech, 2012, (4): 393-409. (in Chinese)

      黃子亮, 張翀, 吳希, 等. 融合酶的設(shè)計(jì)和應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 生物工程學(xué)報(bào), 2012(4):393-409.

      Expression and its serological preliminary evaluation on multi-epitope recombinant antigens of 4 serotypes of dengue virus

      YI Fang-hao1,ZHANG Jun-ai1,LI Si-ping2,JIA Yan1,CHEN Chen1,YU Shi-yan1,WANG Xin1,DAI You-chao1,ZHUANG Ze-gang1,ZHENG Bi-ying1,XU Jun-fa1

      (1.InstituteofLaboratoryMedicine,GuangdongMedicalUniversity,Dongguan523808,China;2.No.8HospitalofDongguanCity,Dongguan523808,China)

      We expressed B cell epitopes of dengue virus envelope protein and NS1 protein in prokaryotic cells, and purified and evaluated for its serological activities. A recombinant multi-epitope chimeric gene named rE including eight B cell epitopes was connected by linker peptide (EAAAK)2and cloned into prokaryotic expression vector pET-28a(+), and transformed intoE.coliBL21(DE3) cells for expression under induction of IPTG. The expressed recombinant protein was purified with 6×His purification media, and identified by SDS-PAGE and Western blot, and its antigenicity was analyzed by using an indirect ELISA assay. The recombinant expression vector pET28a-rE was constructed and expressed in BL21(DE3) successfully,but the recombinant proteins mainly appeared as inclusion bodies.The target protein was obtained with high purity through the purification of affinity chromatography. SDS-PAGE and Western blot analysis showed that the molecular weight of fusion protein was in the expected line. The established indirect ELISA has high accuracy. This recombinant peptide antigen expressed inE.colihas good potential for serum testing.

      dengue virus; antigen protein; prokaryotic expression; serological evaluation

      Xu Jun-fa, Email:imxujunfa@163.com

      10.3969/j.issn.1002-2694.2017.01.006

      徐軍發(fā),Email:imxujunfa@163.com

      1. 廣東醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所,東莞 523808; 2.東莞市第八人民醫(yī)院, 東莞 523808

      R373.3

      A

      1002-2694(2017)01-0032-06

      2016-10-24 編輯:劉岱偉

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