Illumina高通量測(cè)序技術(shù)分析中周羌稞養(yǎng)生酒窖泥細(xì)菌多樣性

覃榮周，王琪林,2，任朝琴,3，戴先芝,3，劉 通，曾權(quán)高

（1.阿壩師范學(xué)院藏羌醫(yī)藥研究所，四川阿壩藏族羌族自治州623001；2.成都體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)與健康研究所，四川成都610041；3.阿壩師范學(xué)院化學(xué)化工與生命科學(xué)系，四川阿壩藏族羌族自治州623001；4.四川省阿壩州中周酒業(yè)有限公司，四川阿壩藏族羌族自治州624000）

Illumina高通量測(cè)序技術(shù)分析中周羌稞養(yǎng)生酒窖泥細(xì)菌多樣性

覃榮周1，王琪林1,2，任朝琴1,3，戴先芝1,3，劉 通1，曾權(quán)高4

（1.阿壩師范學(xué)院藏羌醫(yī)藥研究所，四川阿壩藏族羌族自治州623001；2.成都體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)與健康研究所，四川成都610041；3.阿壩師范學(xué)院化學(xué)化工與生命科學(xué)系，四川阿壩藏族羌族自治州623001；4.四川省阿壩州中周酒業(yè)有限公司，四川阿壩藏族羌族自治州624000）

以不同窖齡（5年、10年、20年和30年）的中周羌稞養(yǎng)生酒窖泥為研究對(duì)象，利用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)窖泥細(xì)菌16S rRNA V4～V5區(qū)進(jìn)行測(cè)序，分析其細(xì)菌多樣性。結(jié)果表明，窖泥中細(xì)菌多樣性（Shannon指數(shù)）和豐富度（Chao指數(shù)）隨著窖齡的增加而顯著提高（P＜0.05）。不同窖齡窖泥的細(xì)菌群落組成存在差異，鹽扁菌科（Haloplasmataceae）、乳酸桿菌科（Lactobacillaceae），瘤胃球菌屬（Ruminococcaceae）和梭菌屬（Clostridium）為不同窖齡窖泥的共有細(xì)菌；類芽孢桿菌屬（Paemibacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、消化球菌科（Peptococcaceae）、喜鹽芽孢桿菌屬（Haloballus）和鏈球菌屬（Streptococcus）只出現(xiàn)在30年窖齡窖泥中；PCA結(jié)果分析表明，相同窖齡窖泥中的細(xì)菌具有更高的相似性，說明窖齡是影響窖泥細(xì)菌群落組成的重要因素之一。

中周羌稞養(yǎng)生酒；濃香型；窖泥；細(xì)菌多樣性；Illumina高通量測(cè)序技術(shù)

白酒是我國(guó)特有的一種由糧食發(fā)酵而來的蒸餾酒，其中以濃香型白酒的產(chǎn)量最多，占白酒總量的70%左右[1-2]。中周羌稞養(yǎng)生酒是四川阿壩地區(qū)著名的濃香型白酒之一，生產(chǎn)過程中以中高溫大曲配合窖泥發(fā)酵，由于其原料為青稞而呈現(xiàn)出其特有的風(fēng)味，并深受當(dāng)?shù)厝嗣竦南矏踇3]。窖泥經(jīng)過不同時(shí)間的演化具有其獨(dú)特的微生物特性[4]，因此，對(duì)中周羌稞養(yǎng)生酒不同窖齡的窖泥進(jìn)行微生物多樣性的研究有助于揭示窖泥的演變過程。

傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法只能對(duì)窖泥中少數(shù)的微生物進(jìn)行鑒定，研究表明，窖泥中不易培養(yǎng)或者不能培養(yǎng)的微生物（如厭氧或者兼性厭氧微生物）在濃香型白酒生產(chǎn)中也發(fā)揮了重要的作用[5-6]。目前，變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）是微生物多樣性研究中最常用的方法之一，它能夠?qū)Νh(huán)境中不能培養(yǎng)的微生物進(jìn)行鑒定，但是此技術(shù)并不能用于定量，且通量小，只能鑒定環(huán)境中的少部分微生物[7-8]。Illumina高通量測(cè)序技術(shù)是近年來興起的分析微生物多樣性的技術(shù)，具有一定的優(yōu)越性，可準(zhǔn)確的對(duì)環(huán)境中的微生物進(jìn)行定量，且具有較高的通量，能夠較為全面的揭示環(huán)境中微生物的特性[9-10]。因此，本研究利用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)窖齡為5年、10年、20年和30年的中周羌稞養(yǎng)生酒窖泥進(jìn)行細(xì)菌的多樣性分析，以期揭示不同窖齡中周羌稞養(yǎng)生酒窖泥微生物的多樣性，為優(yōu)質(zhì)濃香型白酒的生長(zhǎng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 窖泥樣品

本試驗(yàn)中的窖泥均為阿壩中周羌稞養(yǎng)生酒優(yōu)質(zhì)窖泥，采自四川省阿壩州中周酒業(yè)有限公司，窖齡分別為5年、10年、20年和30年。每個(gè)窖齡的窖泥分別采自5口窖池，分別編號(hào)為5年（1、2）、10年（3、4）、20年（5、6）、30年（7、8）。取樣方法為從每個(gè)窖齡窖池的上層、中層和底部分別取樣，混合均勻后于-20℃保藏待用[11]。

1.1.2 主要試劑

土壤DNA提取試劑盒、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）純化試劑盒、DNA Marker D2000：北京天根生化科技有限公司；無水乙醇（分析純）：鄭州中天實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；瓊脂糖（分析純）：北京沃比森科技有限公司。細(xì)菌16S rRNA V4～V5區(qū)引物515F和907R 149：北京諾禾致源生物信息科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；PL203型電子分析天平：唐山藍(lán)箭電子衡器有限公司；DZKW-S-8恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；DYY-10C型電泳儀：北京市六一儀器廠；illumina Miseq PE250高通量測(cè)序儀：上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 窖泥細(xì)菌DNA提取及PCR擴(kuò)增

根據(jù)鄧杰等[12]的報(bào)道采利用DNA提取試劑盒（MIBIO UltraClean Soil DNA Isolation Kit）對(duì)不同窖齡的窖泥細(xì)菌DNA進(jìn)行提取。以不同窖齡窖泥細(xì)菌總DNA為模板，引物采用細(xì)菌16S rRNA V4～V5區(qū)引物515F（5′-148-GTGCCA GCMGCCGCGG-3′）和907R 149（5′-CCGTCAAATTCMT TTRAGTTT-3′）[13]進(jìn)行TouchDownPCR擴(kuò)增，TouchDown PCR反應(yīng)條件參考TIAN W等[14]的方法。

1.3.2 PCR產(chǎn)物純化

利用PCR純化試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，之后利用2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，并在紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察條帶，利用分光光度計(jì)檢測(cè)DNA擴(kuò)增產(chǎn)物在波長(zhǎng)230 nm、260 nm和280 nm處的吸光度值，并計(jì)算OD260nm/OD280nm和OD260nm/OD230nm，確定擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度和純度，滿足純度要求后用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.3 Illumina高通量測(cè)序

利用Illumina高通量測(cè)序儀對(duì)窖泥細(xì)菌DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，為了確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及普遍性，需對(duì)獲得的原始序列進(jìn)行適當(dāng)?shù)暮Y選，去掉低質(zhì)量的序列，進(jìn)而獲得滿足后續(xù)分析要求的高質(zhì)量序列。通過與核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)（ribosomal database project，RDP）已知序列的比對(duì)，修剪適配器和核糖體標(biāo)簽來減少測(cè)序錯(cuò)誤率[15]。利用Mothur軟件識(shí)別和消除嵌合體來改善序列質(zhì)量。

1.3.4 生物信息學(xué)分析

利用微生物生態(tài)學(xué)的定量分析（quantitative insights into microbial ecology，QIIME）平臺(tái)對(duì)窖泥細(xì)菌DNA序列進(jìn)行高級(jí)生物信息分析，每個(gè)樣品剩余的高質(zhì)量序列用于劃分操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）。在97%相似度的OTUs進(jìn)行同源性比對(duì)的基礎(chǔ)上，評(píng)估窖泥樣品細(xì)菌的豐富度（Chao指數(shù)）和多樣性（Shannon指數(shù)）[16]。此外，主成分分析（principal component analysis，PCA）用來反映不同窖泥樣本之間細(xì)菌組成的差異。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，并利用SPSS17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，選擇Tukey's檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)可視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 窖泥樣品DNA擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量檢驗(yàn)

圖1 窖泥樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of PCR amplification products of pit mud samples

表1 窖泥樣品PCR產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果Table 1 Detection results of PCR amplification products of pit mud samples

由圖1可知，窖泥樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰單一，不存在拖帶或者引物二聚體，條帶大小在500 bp左右，符合16S rRNA V4～V5區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物要求。同時(shí)由表1可知，8個(gè)窖泥樣品DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的OD260nm/OD280nm值都在1.8～2.0之間，OD230nm/OD260nm值都＞2.0，說明PCR產(chǎn)物的濃度和純度都較高，可以滿足Illumina高通量測(cè)序分析的要求。

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)的合理性分析

為了進(jìn)一步分析測(cè)序數(shù)據(jù)的合理性，對(duì)窖泥樣品進(jìn)行稀疏曲線分析，以樣本中隨機(jī)抽取測(cè)序序列數(shù)為橫坐標(biāo)，OTU數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制出稀疏曲線，結(jié)果如圖2所示，圖中稀疏度是一定測(cè)序數(shù)量中所測(cè)出的OTU數(shù)量的多少，是通過高通量測(cè)16s RNA相關(guān)序列，比對(duì)序列的同源性，由軟件分析得到。由圖2可知，隨著測(cè)序數(shù)量增加，各窖泥樣品的稀疏曲線先經(jīng)過陡坡期，然后趨于平坦，說明繼續(xù)增加測(cè)序的數(shù)量對(duì)產(chǎn)生的OTU數(shù)量的影響較少，樣品的測(cè)序條數(shù)能夠滿足試驗(yàn)的后續(xù)要求，可以用于進(jìn)一步的樣品細(xì)菌多樣性分析。

圖2 窖泥樣品的稀疏曲線分析Fig.2 Rarefaction curves analysis of pit mud samples

2.3 不同窖齡窖泥中細(xì)菌豐富度和多樣性分析

表2 不同窖齡窖泥樣品細(xì)菌多樣性和豐富度比較Table 2 Comparison of bacterial diversity and abundance of pit mud with different cellar ages

由表2可知，8個(gè)樣品共有548 313條序列，進(jìn)行抽平（subsample）后，計(jì)算alpha多樣性和beta多樣性，經(jīng)過深度抽平處理后，每個(gè)樣品最后的序列為19 353條，此序列的數(shù)量能夠覆蓋整個(gè)樣品序列的98%以上，這說明得到的樣品序列質(zhì)量較高，能夠用于窖泥中細(xì)菌多樣性的研究。在97%相似度水平下，所有窖泥樣品序列總共被歸類為7 925個(gè)OTUs。其中5年、10年、20年和30年窖泥中細(xì)菌的OTUs分別為254±5.41、321±13.11、452±13.23和558±17.59，隨著窖泥窖齡的增加，樣品中OTUs的數(shù)量顯著增加（P＜0.05）。

通過對(duì)不同窖齡窖泥樣品細(xì)菌多樣性（Shannon指數(shù)）和豐富度（Chao指數(shù)）分析可知，所有窖泥樣本中細(xì)菌的多樣性和豐富度都較高，這說明窖泥中的細(xì)菌群落特征較為復(fù)雜。此外，Shannon指數(shù)和Chao指數(shù)都隨著窖泥窖齡的增加而顯著增加（P＜0.05）。

2.4 不同窖齡窖泥中細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)分析

利用Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)窖泥細(xì)菌DNA PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，通過數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)得到窖泥細(xì)菌的種類，并進(jìn)一步計(jì)算各種細(xì)菌所占細(xì)菌總數(shù)的比例（即相對(duì)含量），結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同窖齡窖泥中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Analysis of bacterial community structure in pit mud with different cellar ages

8個(gè)樣品中的細(xì)菌共包含7個(gè)門，分別為厚壁菌門（Firmicutes）、互養(yǎng)菌門（Synergistaceae）、綠彎菌門（Chloroflexi）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）和黏膠球形菌門（Lentisphaerae），其中厚壁菌門，互養(yǎng)菌門和綠彎菌門為優(yōu)勢(shì)菌門，占細(xì)菌總數(shù)的90.22%。此外，其他相對(duì)含量小于0.01%的所有屬的總和用“Others”表示。隨著窖齡的增加，窖泥中“Others”的比例也隨之增加，這也表明了窖泥中細(xì)菌的多樣性隨著窖齡的增加而增加。

由圖3可知，具有相同窖齡的窖泥中細(xì)菌構(gòu)成較為相似，不同窖齡窖泥之間的群落構(gòu)成存在一定的差異。5年窖齡的窖泥中優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌為：梭菌屬（Clostridium）（26.32± 1.92）%、鹽扁菌科（Haloplasmataceae）（16.72±1.72）%、乳酸桿菌科（Lactobacillaceae）（10.31±0.82）%、互養(yǎng)菌科（Synergistaceae）（9.31±0.32）%和瘤胃球菌屬（Ruminococcaceae）（9.02±0.18）%；10年窖齡的窖泥中優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌為：梭菌屬（Clostridium）（20.15±1.36）%、鹽扁菌科（Haloplasmataceae）（12.35±0.92）%、乳酸桿菌科（Lactobacillaceae）（10.07±1.12）%、瘤胃球菌屬（Ruminococcaceae）（7.22± 1.21）%、互養(yǎng)菌科（Synergistaceae）（7.12±0.81）%、假單胞菌科（Pseudomonadaceae）（7.12±0.48）%和類芽孢桿菌屬（Paemibacillus）（6.56±0.37）%；20年窖齡的窖泥中優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌為：梭菌屬（Clostridium）（20.43±1.09）%、鹽扁菌科（Haloplasmataceae）（13.47±0.76）%、瘤胃球菌屬（Ruminococcaceae）（8.88±0.81）%、喜熱菌屬（Caloramator）（7.66± 0.83）%、乳酸桿菌科（Lactobacillaceae）（7.12±0.63）%、類芽孢桿菌屬（Paemibacillus）（6.92±0.84）%、假單胞菌科（Pseudomonadaceae，5.81±0.64%）、互養(yǎng)菌科（Synergistaceae）（5.32±0.83）%和芽孢桿菌（Bacillus）（1.01±0.03）%；30年窖齡的窖泥中優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌為：梭菌屬（Clostridium）（14.98± 0.84）%、鹽扁菌科（Haloplasmataceae）（9.35±0.73）%、乳酸桿菌科（Lactobacillaceae）（6.05±0.73）%、類芽孢桿菌屬（Paemibacillus）（5.99±0.44）%、喜熱菌屬（Caloramator）（5.91± 0.76）%、假單胞菌科（Pseudomonadaceae）（5.63±0.36）%、瘤胃球菌屬（Ruminococcaceae）（3.16±0.21）%、互養(yǎng)菌科（Synergistaceae）（2.89±0.23）%、喜鹽芽孢桿菌屬（Haloballus）（2.44±0.16）%、鏈球菌屬（Streptococcus）（2.11±0.16）%和消化球菌科（Peptococcaceae）（2.01±0.17）%?？梢婋S著窖齡的增加，窖泥中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)也發(fā)生了變化。而通過不同窖齡窖泥優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的比較可知厚壁菌門中的鹽扁菌科、乳酸桿菌，瘤胃球菌屬和梭菌屬為不同窖齡窖泥的共有細(xì)菌，而類芽孢桿、芽孢桿菌屬、消化球菌科、喜鹽芽孢桿菌屬和鏈球菌屬等可能在高窖齡（30年）中周羌稞養(yǎng)生酒的發(fā)酵中發(fā)揮重要的作用。

2.5 PCA分析

圖4 不同窖齡窖泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)PCA分析Fig.4 PCA analysis of bacterial community structure in pit mud with different cellar ages

圖4 為不同窖齡窖泥細(xì)菌群落結(jié)果的PCA分析圖，由圖4可知，8個(gè)窖泥樣品共分為了4個(gè)組，不同窖齡的4個(gè)窖泥樣品聚成一組，分別為A（1和2號(hào)樣品）、B（3和4號(hào)樣品）、C（5和6號(hào)樣品）和D（7和8號(hào)樣品），這顯示具有相同窖齡的窖泥中具有相似的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，而不同窖齡的窖泥中細(xì)菌的群落結(jié)果則為分散和遠(yuǎn)離現(xiàn)象，說明群落之間有明顯的差異。表明窖泥中細(xì)菌群落的組成與窖泥的窖齡密切相關(guān)。

3 結(jié)論

利用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)能夠較為全面的分析中周羌稞養(yǎng)生酒不同窖齡窖泥中細(xì)菌的多樣性。窖泥中細(xì)菌的生物多樣性和豐富度隨著窖泥窖齡的增加而顯著增加。細(xì)菌的組成也發(fā)生了改變，其中鹽扁菌科、乳酸桿菌、瘤胃球菌屬和梭菌屬為4種窖齡窖泥的共有細(xì)菌，而類芽孢桿、芽孢桿菌屬、消化桿菌科、喜鹽芽孢桿菌屬和鏈球菌屬只出現(xiàn)在高窖齡中周羌稞養(yǎng)生酒窖泥中，PCA分析進(jìn)一步表明中周羌稞養(yǎng)生酒窖泥中細(xì)菌群落的組成與窖泥的窖齡密切相關(guān)。

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Analysis of bacterial diversity in pit mud of Zhong-Zhou highland barley health liquor by Illumina high-throughput sequencing

QIN Rongzhou1,WANG Qilin1,2,REN Chaoqin1,3,DAI Xianzhi1,3,LIU Tong1,ZENG Quangao4(1.Tibetan-Qiang's Medicine Research Institute,ABA Normal University,Aba Tibetan and Qiang Autonomous Prefecture 623001, China;2.Sports Medicine and Health Research Institute,Chengdu Sports University,Chengdu 610041,China;3.Department of Chemical Engineering and Life Science,ABA Normal University,Aba Tibetan and Qiang Autonomous Prefecture 623001,China; 4.Zhong-Zhou Highland Barley Wine Industry Co.,Ltd.,Aba Tibetan and Qiang Autonomous Prefecture 624000,China)

Using pit mudfrom different cellars with the ages(5 years,10 years,20 years and 30 years)of Zhong-Zhou highland barley health liquor as the research objects,16S rRNA V4-V5 sequence of bacteria in the pit mud was detected by Illumina high-throughput sequencing,and the diversity of bacteria was analyzed.The results showed that the diversity(Shannon index)and abundance(Chao index)of bacteria in pit mud with increasing of cellar age were increased significantly(P＜0.05).The bacterial community composition of pit mud with different cellar ages had difference.Haloplasmataceae,Lactobacillaceae,RuminococcceaeandClostridiumwere the common bacteria of pit mud with different cellar ages.Paemibacillus,Bacillus,Peptococcaceae,HaloballusandStreptococcusonly appeared in the pit mud with 30 years cellar age.PCA analysis indicated that the bacteria in the pit mud with the same cellar ages had a higher similarity,which showed that cellar age was one of the important factors that affected the bacterial community of pit mud.

Zhong-Zhou highland barley health liquor;Luzhou-flavor;pit mud;bacterial diversity;Illumina high-throughput sequencing

TS255

0254-5071（2017）01-0138-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.029

2016-07-05

四川省哲學(xué)社會(huì)科學(xué)重點(diǎn)研究基地2014年度課題(QXJ1401)；阿壩師范學(xué)院2014專項(xiàng)基金課題(JY14-02)；四川省羌學(xué)學(xué)會(huì)藏羌地區(qū)醫(yī)藥研究所2015年度資助項(xiàng)目(LYH15-01)

覃榮周(1977-)，男，副教授，碩士，研究方向?yàn)槊褡鍌鹘y(tǒng)醫(yī)學(xué)與公共衛(wèi)生。