鉛暴露對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及機制研究

嚴(yán)偉偉 賈仰民 韓靜茵 王淑娟

鉛暴露對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及機制研究

嚴(yán)偉偉 賈仰民 韓靜茵 王淑娟

目的 研究鉛暴露對小鼠學(xué)習(xí)記憶、海馬凋亡細(xì)胞及乙酰膽堿酯酶（AChE）活性的影響。方法健康昆明小鼠30只，隨機分為對照組、醋酸鉛暴露組，每組15只，分別予7mg/kg的生理鹽水、醋酸鉛連續(xù)腹腔注射8天。采用Morris水迷宮實驗檢測小鼠學(xué)習(xí)記憶功能，羥胺比色法測定乙酰膽堿酯酶（AChE）活性、TUNEL染色檢測海馬凋亡細(xì)胞。結(jié)果Morris水迷宮實驗顯示，醋酸鉛暴露組小鼠第4、5天逃避潛伏期[（22.20±4.09）s、（19.73±2.88）s]、穿越平臺時間[（15.54±3.72）s]均較對照組[（13.64±2.93）s、（11.79±2.24）s、（3.24±2.24）s]明顯延長（P＜0.05）。醋酸鉛暴露組小鼠AChE表達(dá)較對照組顯著增高[（0.498±0.131）U/ug比（0.229±0.042）U/μg，P＜0.05]，且海馬細(xì)胞凋亡率較對照組顯著增多[（8.79±0.37）%比（2.79±0.04）%，P＜0.05]。結(jié)論鉛暴露可明顯損傷小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，小鼠海馬凋亡細(xì)胞增加、中樞神經(jīng)系統(tǒng)ACh含量的降低是其學(xué)習(xí)記憶功能障礙的一個可能機制。

小鼠；鉛；學(xué)習(xí)記憶；凋亡細(xì)胞；乙酰膽堿酯酶

既往研究表明，鉛是一種具有神經(jīng)毒性的重金屬，能影響兒童神經(jīng)行為發(fā)育[1]，導(dǎo)致成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變[2-3]，包括記憶力損傷、阿爾茨海默癥樣病變及神經(jīng)退行性病變等。但迄今為止，鉛對學(xué)習(xí)記憶行為影響的機制仍未完全闡明。本研究通過建立醋酸鉛暴露小鼠模型，觀察其對學(xué)習(xí)記憶行為、海馬凋亡細(xì)胞及乙酰膽堿酯酶（AchE）活性的影響，探討鉛暴露對學(xué)習(xí)記憶行為影響的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實驗動物 健康昆明小鼠30只，清潔級，雄性，體質(zhì)量20g～30g，由江蘇常州卡文斯實驗動物有限公司提供，實驗動物合格證號：SCXK（蘇）2011-0003。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度18～22℃，濕度50～60%。

1.1.2 試 劑 TUNEL凋亡檢測試劑盒（凱基）、DAPI細(xì)胞染料（碧云天上海股份有限公司）、乙酰膽堿酯酶（AchE）測試盒（南京建成生物有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型構(gòu)建及分組 健康清潔級昆明小鼠30只，隨機分為對照組、醋酸鉛暴露[4]組，每組15只。醋酸鉛暴露組予醋酸鉛7mg/（kg·d）腹腔注射，連續(xù)8天；對照組予等劑量生理鹽水腹腔注射，連續(xù)8天。

1.2.2 Morris水迷宮實驗 所有小鼠在造模后8天行水迷宮實驗，并測試逃避潛伏期。將平臺放入任一象限中央，進(jìn)行定位航行實驗，用于檢測小鼠對空間記憶的獲得能力：將小鼠從A、B、C、D 4個入水點面向池壁依次放入水中，觀察60s內(nèi)小鼠找到并爬上平臺所用的時間（逃避潛伏期）。若60s內(nèi)未能找到平臺，則將其引導(dǎo)到平臺并在平臺上停留15s，潛伏期記為60s?？臻g探索實驗用于檢測小鼠對平臺區(qū)域的準(zhǔn)確記憶能力，是在水迷宮實驗第5日、定位航行實驗后撤去平臺，由第2象限入水點面向池壁放入小鼠，觀察小鼠60s內(nèi)穿越平臺區(qū)域的次數(shù)及平臺象限游泳路程。

1.2.3 AChE活性檢測 水迷宮實驗結(jié)束后，水合氯醛處死實驗小鼠，取出左右大腦半球，立即投入預(yù)冷的生理鹽水中，清除血跡。用濾紙吸干水，去除軟腦膜血管。取右腦稱重，置微型勻漿器中，加無水乙醇0.1mL研磨，再加0.9mL生理鹽水充分研磨制成勻漿。4℃ 4500xg離心15min,取上清液。用羥胺比色法測定AChE活性，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.4 TUNEL染色 取小鼠右腦制成腦片，常規(guī)脫蠟，經(jīng)乙醇水合后PBS漂洗，蛋白酶K工作液消化，再次PBS漂洗，后將切片浸入3%H2O2封閉液中室溫封閉，并再次PBS漂洗。將樣本周圍吸干，依次滴加TdT酶反應(yīng)液、PBS漂洗，滴加FITC工作液、PBS中漂洗，滴加DAPI染料、PBS漂洗，最后使用熒光顯微鏡檢測。結(jié)果說明：DAPI染色成藍(lán)色，代表細(xì)胞核，TUNEL染色為綠色，代表凋亡細(xì)胞。凋亡率計算公式=TUNEL染色細(xì)胞數(shù)/DAPI染色細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠Morris水迷宮實驗結(jié)果 在定位航行實驗中，隨著訓(xùn)練時間的延長，從第4天起，醋酸鉛暴露組小鼠的逃避潛伏期時間較對照組小鼠明顯延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。在空間探索實驗中，醋酸鉛暴露組小鼠穿越平臺時間較對照組小鼠明顯延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；但兩組間穿越平臺的距離差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表1 兩組小鼠定位航行實驗逃避潛伏期比較（s，±s）

表1 兩組小鼠定位航行實驗逃避潛伏期比較（s，±s）

組別正常對照組醋酸鉛暴露組F值P值只數(shù)15 15第1天57.63±1.05 54.54±1.31 0.642 0.997第2天13.42±2.78 13.43±2.34 1.414 0.094第3天16.33±3.756 19.95±3.515 1.142 0.083第4天13.64±2.93 22.20±4.09 0.509 0.043第5天11.79±2.24 19.73±2.88 0.609 0.011

表2 兩組小鼠空間探索實驗比較（±s）

表2 兩組小鼠空間探索實驗比較（±s）

組別正常對照組醋酸鉛暴露組F值P值只數(shù)15 15距離（m）0.73±0.44 1.57±0.49 0.35 0.37時間（s）3.24±2.24 15.54±3.72 0.314 0.07

2.2 兩組小鼠AChE活性比較 醋酸鉛暴露組小鼠AChE表達(dá)（0.498±0.131）U/μg，較對照組小鼠（0.229± 0.042）U/μg顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=6.3882，P=0.0062）。

2.3 TUNEL染色結(jié)果 對照組小鼠海馬細(xì)胞凋亡率（2.79±0.04）%，醋酸鉛暴露組小鼠海馬區(qū)域細(xì)胞凋亡率（8.79±0.37）%，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=6.194，P＜0.05），見圖1（封三）。

3 討 論

鉛是一種廣泛存在的重金屬，可通過消化道、呼吸道及皮膚進(jìn)入機體。Morris水迷宮實驗[5]，包括定位航行實驗和空間探索實驗，常用來評價嚙齒類動物的學(xué)習(xí)記憶功能。本研究發(fā)現(xiàn)，鉛暴露組小鼠的平均逃避潛伏期、穿越平臺區(qū)域時間明顯延長，表明鉛暴露可明顯損傷小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，與既往的研究結(jié)果相符[6]。

海馬是學(xué)習(xí)記憶的重要解剖基礎(chǔ)及神經(jīng)中樞，其神經(jīng)細(xì)胞任何形式的損害都可能導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能障礙[7]。同時，中樞膽堿能系統(tǒng)是形成學(xué)習(xí)記憶的主要通路，乙酰膽堿（ACh）是該通路中一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)[8]，但由于ACh的不穩(wěn)定性，動物實驗中較難檢測ACh的濃度，因此我們選擇其水解酶AChE活性的高低來評估ACh的含量。既往研究表明，AChE可分解ACh，使中樞神經(jīng)系統(tǒng)的ACh含量降低，從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能障礙[9]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，鉛暴露組小鼠海馬區(qū)域細(xì)胞凋亡增加，且鉛暴露組小鼠腦組織內(nèi)AChE表達(dá)顯著增高（P＜0.05），提示小鼠海馬凋亡細(xì)胞增加、中樞神經(jīng)系統(tǒng)ACh含量的降低是其學(xué)習(xí)記憶功能障礙的一個可能機制。因此，調(diào)控海馬神經(jīng)元的凋亡、提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)的ACh含量，可能是改善小鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙的治療方法之一。

［1］李廷玉，張萱，魏小平，等.出生時抗氧化維生素及重金屬水平對兩歲幼兒智力發(fā)育影響的相關(guān)分析［J］.中華兒科雜志，2011，49（6）：439-444.

［2］劉羽，鄭珊，王紅梅，等.鉛對腦屏障系統(tǒng)的損傷及其機制的研究進(jìn)展［J］.癌變·畸變·突變，2015，27（3）：245-248.

［3］黎東霞，楊莉，孫曉梅.血鉛對鉛從業(yè)人員認(rèn)知障礙的影響［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2013，29（21）：3342-3343.

［4］張季，嚴(yán)春臨，張丹參，等.大黃酚對鉛中毒小鼠學(xué)習(xí)記憶的改善作用及其機制研究［J］.中國藥理學(xué)通報，2011，27（11）：1614-1618.

［5］方松，余化霖.Morris水迷宮實驗中海馬相關(guān)空間學(xué)習(xí)記憶的研究進(jìn)展［J］.國際病理科學(xué)與臨床雜志，2010，30（4）：321-326.

［6］李靜，劉芳麗，安偉鋒，等.不同時期鉛暴露對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬組織中β淀粉樣蛋白表達(dá)的影響［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2015，50（3）：323-326.

［7］張明，周民，丁向東.海馬與記憶相關(guān)性的研究進(jìn)展［J］.光明中醫(yī)，2004，19（5）：21-23.

［8］盧昌均，韋冰心，安紅偉，等.血管性癡呆模型大鼠空間記憶障礙與海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡和乙酰膽堿釋放有關(guān)［J］.國際腦血管病雜志，2013，21（12）：898-902.

［9］Lazaris A，Bertrand F，Lazarus C，et a1.Baseline and 8-OH-DPAT-induced release of acetyleholine in the hippocampus of aged rats with different levels of cognitive dysfunction［J］.Brain Research，2003，967（1-2）：181-190.

（收稿：2016-08-09 修回：2016-08-28）

Effects of Lead Exposure on Learning and Memory of Mice and Its Mechanism

YAN Weiwei,JIA Yang min,HAN Jingyin,WANG Shujuan.Department of Occupational Medicine,Hangzhou Red Cross Hospital,Hangzhou (310003),China

Objective To investigate the effects of lead exposure on learning and memory,apoptotic cells in the hippocampus and the activity of acetylcholinesterase（AchE）of mice.MethodsA total of 30 healthy Kunming mice were randomly divided into control group（7mg/kg,normal saline）and lead acetate exposure group（7mg/kg,lead acetate）,with 15 mice in each group.The corresponding fluids were administered through continuously intraperitoneal injection for 8 d.The Morris water maze test was used to detect the learning and memory function of mice, hydroxylamine colorimetric method was used to measure AChE activity,and TUNEL staining was used to detect the apoptotic cells in the hippocampus.ResultsThe Morris water maze test showed that mice exposed to lead acetate group had longer escape latency time on Day 4 and Day 5（22.20±4.09s,19.73±2.88s）and longer time of crossing the platform（15.54±3.72s）than those of control group（13.64±2.93s,11.79±2.24s,3.24±2.24s,all P＜0.05）.The expression of AChE and the number of apoptotic cells in the hippocampus of lead acetate exposure group were sig nificantly higher than those in control group（AChE:0.498±0.131U/μg vs 0.229±0.042U/μg;apoptotic cells:8.79%± 0.37%vs 2.79%±0.04%;all P＜0.05）.ConclusionLead exposure can obviously damage learning and memory ability of mice.The increase of apoptotic cells in the hippocampus and the decrease of AChE in the central nervous system may be a possible mechanism of learning and memory dysfunction in mice.

mice;learning and memory;apoptotic cells;acetylcholinesterase

杭州市衛(wèi)生科技計劃（一般）項目（No.2014A41）

杭州市紅十字會醫(yī)院職業(yè)病科（杭州 310003）

嚴(yán)偉偉，Tel：13666653749；E-mail：ywwzj1006@163.com