茶多酚糊劑治療口腔潰瘍動物實驗研究

吳枝武 杜昳陽 姚 宇 馮劍穎

茶多酚糊劑治療口腔潰瘍動物實驗研究

吳枝武 杜昳陽 姚 宇 馮劍穎

目的 研究茶多酚糊劑對大鼠口腔潰瘍愈合的影響及機(jī)制。方法30只SD大鼠采用化學(xué)灼燒法在大鼠左右頰黏膜建立口腔潰瘍模型，左側(cè)潰瘍面涂甘油，為甘油對照組，右側(cè)潰瘍面涂茶多酚糊劑，為茶多酚糊劑組，每天給藥3次，分別于給藥的0天、2天、4天、6天、8天各處死6只大鼠。大體觀察口腔潰瘍黏膜面，測量潰瘍面積，免疫組化法檢測成纖維細(xì)胞因子1（FGF1）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）在潰瘍區(qū)的表達(dá)。結(jié)果（1）茶多酚糊劑組給藥4天、6天后潰瘍面積較甘油對照組小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；（2）茶多酚糊劑組4天后炎癥細(xì)胞浸潤較少；（3）給藥4天，茶多酚糊劑組與甘油對照組比較，F(xiàn)GF1表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但α-SMA表達(dá)較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[（0.32±0.01）比（0.30±0.01），P＜0.05]；給藥6天和8天后，茶多酚糊劑組[FGF1：（0.57±0.02）、（0.66±0.02）；α-SMA：（0.34±0.01）、（0.32±0.02）]較甘油對照組[FGF1：（0.53± 0.02）、（0.43±0.23）；α-SMA：（0.32±0.02）、（0.28±0.03）]FGF1與α-SMA表達(dá)均升高，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論茶多酚糊劑在大鼠口腔潰瘍的中后期有助于潰瘍愈合，其愈合機(jī)制可能與抗炎、抗氧化及增高FGF1、α-SMA的表達(dá)有關(guān)。

大鼠；口腔潰瘍；茶多酚糊劑；FGF1；α-SMA

復(fù)發(fā)性口腔潰瘍（recurrent oral ulcer，ROU）是最常見的口腔黏膜潰瘍類疾病，潰瘍灼痛明顯患病率高，且具有周期性、復(fù)發(fā)性、自限性等特征[1-2]。研究[2-4]認(rèn)為口腔潰瘍可能與遺傳、免疫、環(huán)境、精神生理和微循環(huán)障礙等有關(guān)。茶多酚（tea polyphenol，TP）是從茶葉中提取的30多種酚類化合物的復(fù)合體。大量研究發(fā)現(xiàn)茶多酚具有抗氧化、抗炎、抗氧自由基等作用[5-7]，因其具有抑菌、護(hù)齒、防齲的作用也逐步用于口腔保健產(chǎn)品。本文通過茶多酚糊劑應(yīng)用于大鼠口腔潰瘍，探討茶多酚對口腔潰瘍愈合過程的影響。

1 材料與方法

1.1 動 物 清潔級SD實驗大鼠30只，雌性，體質(zhì)量（190±10）g，實驗動物合格證號：SCXK（滬）2013-0016。實驗動物由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，普通飼料飼養(yǎng)。

1.2 主要藥品 茶多酚糊劑：AVERTEAX，Star Health and Beauty，LLC，美國（美國佐治亞大學(xué)Stephen Hsu教授惠贈）；99%甘油（華東醫(yī)藥股份有限公司）。

1.3 方 法 2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，使用口徑處理為5mm且管口內(nèi)塞有棉花的巴氏管吸取飽和氫氧化鈉溶液，將巴氏管口貼于大鼠的頰黏膜上，持續(xù)時間為60s。大鼠左右側(cè)頰黏膜均做相同處理。建模24h后肉眼觀察,大鼠口腔黏膜形成一個直徑約5mm的潰瘍。潰瘍中央凹陷，表面有黃白色假膜覆蓋，周圍有出血且伴充血水腫。HE染色可見黏膜上皮脫落，固有層有炎癥細(xì)胞浸潤。顯示造模成功，見圖1（封二）。30只大鼠建模成功，左側(cè)潰瘍面涂甘油，為甘油對照組，右側(cè)潰瘍面涂茶多酚糊劑，為茶多酚糊劑組，每天給藥3次，給藥方式為1mL圓頭針管推擠0.1mL藥劑至潰瘍面。分別在給藥0、2、4、6、8天隨機(jī)處死大鼠各6只，完整取下潰瘍黏膜及肌層，游標(biāo)卡尺測量計算潰瘍面積。組織塊制作石蠟切片，HE染色，免疫組化SP法檢測成纖維細(xì)胞因子1（FGF1）和α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的表達(dá)（FGF1單抗抗體：美國santa cruz公司；α-SMA單抗抗體：丹麥DAKO公司），應(yīng)用Image-Pro Plus6.0測量平均光密度值半定量蛋白表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析、t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠不同時間口腔潰瘍面積比較 建模后，甘油對照組與茶多酚糊劑組大鼠口腔潰瘍的面積不斷減少。給藥0天、2天甘油對照組與茶多酚糊劑組潰瘍面積無明顯差異，在給藥4天、6天后茶多酚糊劑組潰瘍面積小于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），給藥8天兩組黏膜均愈合，見圖2（封二）。

2.2 兩組大鼠口腔黏膜組織病理學(xué)觀察 給藥2天，甘油對照組與茶多酚糊劑組潰瘍周圍仍可見水腫且表面均覆蓋黃白色假膜。鏡下觀察固有層有大量炎癥細(xì)胞浸潤，以中性粒細(xì)胞為主。給藥4天，甘油對照組潰瘍表面仍可見部分假膜覆蓋，茶多酚糊劑組假膜基本脫落。鏡下可見茶多酚糊劑組毛細(xì)血管增生明顯。給藥6天，鏡下觀察甘油對照組仍有大量炎癥細(xì)胞浸潤，而茶多酚糊劑組上皮修復(fù)明顯。給藥8天后，茶多酚糊劑組潰瘍范圍不明顯，基本愈合。鏡下可見兩組上皮修復(fù)基本完成。

2.3 免疫組化 給藥后第6、8天茶多酚糊劑組FGF1表達(dá)明顯高于甘油對照組（P＜0.05）。給藥后第4、6、8天α-SMA的表達(dá)明顯高于甘油對照組（P＜0.05），給藥第6天表達(dá)水平最高，第8天表達(dá)有所下降。FGF1和α-SMA在黏膜各層均有不同程度表達(dá)，其中上皮基底層和固有層表達(dá)較多，見圖3（封二）、表1～2。

表1 兩組口腔潰瘍大鼠FGF1表達(dá)（平均光密度值，±s）

表1 兩組口腔潰瘍大鼠FGF1表達(dá)（平均光密度值，±s）

注：與甘油對照組相比，*P＜0.05；FGF1：成纖維細(xì)胞因子1

組別甘油對照組茶多酚糊劑組只數(shù)6 6給藥0天0.53±0.02 0.56±0.03給藥2天0.60±0.03 0.55±0.02給藥4天0.53±0.01 0.54±0.12給藥6天0.53±0.02 0.57±0.02*給藥8天0.43±0.23 0.66±0.02*

表2 兩組口腔潰瘍大鼠α-SMA表達(dá)（平均光密度值，±s）

表2 兩組口腔潰瘍大鼠α-SMA表達(dá)（平均光密度值，±s）

注：與甘油對照組相比，*P＜0.05；α-SMA：α-平滑肌肌動蛋白

組別甘油對照組茶多酚糊劑組只數(shù)6 6給藥0天0.29±0.02 0.27±0.02給藥2天0.29±0.04 0.26±0.02給藥4天0.30±0.01 0.32±0.01*給藥6天0.32±0.02 0.34±0.01*給藥8天0.28±0.03 0.32±0.02*

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，口腔潰瘍的發(fā)生發(fā)展與氧自由基的增多有關(guān)[8]，而茶多酚的結(jié)構(gòu)中富含酚羥基，可提供活潑氫使自由基滅活。Pradip等[7]研究表明，茶多酚可以顯著減少損傷組織丙二醇（MDA）含量，提高超氧化物歧化酶（SOD）活性以提高機(jī)體自由基清除和抗氧化能力。這可能是茶多酚對口腔潰瘍的愈合發(fā)揮作用的機(jī)制之一。Stephen Hsu等[9-11]研究提示，茶多酚可通過MAPK途徑激活Caspase-14以促進(jìn)損傷皮膚的屏障功能修復(fù)，提示茶多酚促進(jìn)口腔潰瘍的愈合與此有關(guān)。

本研究表明，茶多酚糊劑的應(yīng)用可以加速口腔潰瘍的愈合過程，尤其是在給藥的第4天，茶多酚糊劑組口腔潰瘍面積的縮小最為明顯,表明茶多酚發(fā)揮療效的主要階段在潰瘍愈合的中后期。茶多酚糊劑給藥后，黏膜上皮修復(fù)加速，固有層炎癥細(xì)胞浸潤較少。這與茶多酚糊劑抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)再生有關(guān)。Relja等[12]研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚可以通過降低白細(xì)胞介素-6（IL-6）、細(xì)胞間黏附分子－1和磷酸化IkBα的表達(dá)水平發(fā)揮抗炎作用。

FGF1是成纖維生長因子家族的成員之一，可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的增殖生長[13-15]。α-SMA是活化的成纖維細(xì)胞的蛋白標(biāo)志物，它表達(dá)的增高提示著成纖維細(xì)胞的活化增多[16-17]。本實驗中茶多酚糊劑給藥后，F(xiàn)GF1表達(dá)在第6天后顯著增加，α-SMA表達(dá)在4天后明顯增高。表明潰瘍愈合的中后期成纖維細(xì)胞大量活化增殖，參與潰瘍愈合。因此，茶多酚糊劑促進(jìn)口腔潰瘍愈合的機(jī)制可能通過促進(jìn)FGF1的分泌，從而促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖，進(jìn)而活化，使得α-SMA表達(dá)增高。YaQing Tan等[17]認(rèn)為FGF1促進(jìn)組織愈合與其誘導(dǎo)纖維母細(xì)胞的增殖分化、促進(jìn)血管再生以及誘導(dǎo)更多的營養(yǎng)素和氧運(yùn)送至損傷區(qū)域有關(guān)。Lee等[18]研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號通路在組織愈合上發(fā)揮重要作用，當(dāng)β-catenin的表達(dá)下降時，會出現(xiàn)α-SMA減少，組織愈合緩慢。因此α-SMA的表達(dá)還應(yīng)該受Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)節(jié)。

目前口腔潰瘍的治療尚無特效方法，臨床多用糖皮質(zhì)激素、抗炎藥等。對于ROU頻發(fā)的患者，應(yīng)用這些藥物治療可能造成耐藥性、菌群失調(diào)等不良反應(yīng)。茶多酚糊劑涂抹治療口腔潰瘍方便，可避免全身用藥可能出現(xiàn)的并發(fā)癥[11]。糊劑在潰瘍面與口腔之間起到阻隔的作用，減少口腔分泌物對潰瘍的刺激，起到保護(hù)作用。相比于噴霧劑和散劑，糊劑作用時間更長，局部吸收效果更佳，有利于潰瘍的修復(fù)。同時茶多酚結(jié)構(gòu)中的羥基可與細(xì)菌蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)沉淀而導(dǎo)致細(xì)菌死亡，能有效清除口腔中的病菌如牙齦卟啉單胞菌、變形鏈球菌等，避免潰瘍再次受到病菌的感染而造成更為嚴(yán)重的疾病[19-21]。本研究采用的茶多酚以糊劑為載體，有利于黏膜面的吸收和給藥，具有臨床推廣應(yīng)用價值，有待進(jìn)一步研究其潰瘍愈合機(jī)制及聯(lián)合用藥方式。

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（收稿：2016-06-17 修回：2016-08-10）

Therapeutic Effect of Tea Polyphenol Paste on Oral Ulcer in Rats

WU Zhiwu,DU Yiyang,YAO Yu,FENG Jianying. Department of Orthodontics,College of Oral Medicine,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou (310053),China

Objective To study the therapeutic effect of tea polyphenols paste on oral ulcer in rats and the underlying mechanism.MethodsThirty rats were randomly divided into 5 groups with 6 rats in each group.The oral ulcer animal model was established by chemical burning method on both buccal mucosa of rats.Glycerol control group applied glycerol to the ulcer surface of left buccal mucosa,tea polyphenol paste group applied tea polyphenol paste to the right.The rats were administered 3 times per day.Six rats were sacrificed respectively after the administration on Day 0,Day 2,Day 4,Day 6,and Day 8,then the ulcer area was biopsied and measured,and the healing of ulcer was analyzed by detecting fibroblast growth factor 1（FGF1）and αsmooth muscle actin（α-SMA）levels in the ulcer area with histopathologic and immunohistochemical methods.ResultsThe ulcer area of tea polyphenol paste group on Day 4 and Day 6 was significantly smaller than that of glycerol control group（P＜0.05）.Tea polyphenol paste group had less inflammatory cell infiltration on Day 4 after administration.On Day 4, the expression of FGF1 did not differ between two groups（P＞0.05）,but the level of α-SMA was significantly higher in tea polyphenol paste group than that in control group（0.32±0.01 vs 0.30±0.01,P＜0.05）.On Day 6 and Day 8, the expressions of FGF1 and α-SMA in tea polyphenol paste group（FGF1:0.57+0.02，0.66+0.02;α-SMA:0.34+ 0.01，0.32+0.02）were significantly higher than those in control group and the glycerol control group（FGF1:0.53+ 0.02，0.43+0.23;α-SMA:0.32+0.02，0.28+0.03;all P＜0.05）.ConclusionTea polyphenols paste can contribute to the healing of the oral ulcer at the end of the treatment period.The healing mechanism may be related to anti-inflammation,anti-oxidation and the increased expression of FGF1 and α-SMA.

rats;oral ulcer;tea polyphenol paste;FGF1;α-SMA

國家自然科學(xué)基金項目（No.81200802）；浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動計劃暨新苗人才計劃（No.2016R410007）

浙江中醫(yī)藥大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院正畸科（杭州 310053）

馮劍穎，Tel：13093798116；E-mail：twohorsejy@163.com