金花葵花總黃酮的精制工藝研究

陳亮??辛秀蘭??+蘇東海??+王曉杰??+胡仙妹??+李浡??+劉琦

摘要：通過靜態(tài)吸附解吸試驗從12種樹脂中優(yōu)選出聚酰胺樹脂，其吸附率為38.20%、吸附量為43.93 mg/g，解吸率73.22%，綜合吸附解吸效率最高。聚酰胺樹脂動態(tài)吸附解吸試驗結(jié)果表明，在提取液上樣量50 mL、上樣液濃度4.37 mg/mL、上樣pH值6.0、上樣流速1.0 mL/min、水洗體積5倍、80%乙醇5倍體積洗脫、洗脫流速1.0 mL/min的最佳條件下，金花葵花總黃酮純度可達到72.6%，產(chǎn)品具有很大的開發(fā)潛力。

關(guān)鍵詞：金花葵；黃酮；聚酰胺樹脂；純化工藝

中圖分類號： R284.2文獻標(biāo)志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0339-04

金花葵（Hibiseu smanihot L.）別稱菜芙蓉、野芙蓉、黏干、山榆皮，為一年生草本錦葵科秋葵屬植物[1]。

金花葵含有豐富的黃酮類化合物和Mn、Fe、Mg、Zn、Cu、Cr等微量元素，能顯著調(diào)節(jié)人體內(nèi)分泌、免疫力，增強人體抵抗力，增強機體抗氧化能力，具有抗衰老、防癌、降血脂等功效。金花葵含有豐富的金絲桃苷[2]，對神經(jīng)、循環(huán)、免疫、消化系統(tǒng)等具有調(diào)節(jié)活性，有抗炎、止咳，以及較強的抑制糖醛還原酶活性的作用，具有一定的抗抑郁功效。

金花葵適應(yīng)性強，可廣泛種植，含有極為豐富的黃酮類化合物，是黃酮類化合物提取的較佳原料。但因其發(fā)現(xiàn)時間短，研究還不夠深入，其黃酮類化合物的提取分離方法還不夠完善，關(guān)于其生理活性方面的研究還不夠深入。

本試驗研究了12種樹脂對金花葵花總黃酮純化效果，通過靜態(tài)試驗從中篩選出純化效果最優(yōu)的樹脂，并進行了動態(tài)試驗，得出樹脂純化就金花葵花總黃酮的最優(yōu)工藝參數(shù)。

1材料與方法

1.1材料與儀器

金花葵由河南平頂山軍昊農(nóng)業(yè)有限公司提供；HPD100、HPD400、HPD500、HPD722、HPD826、HPD100B、AB-8、S-8、X-5、D4020、聚酰胺、XDA-7PH型樹脂均為河北滄州寶恩化學(xué)有限公司生產(chǎn)；蕓香苷對照品（純度>98%）為江蘇南京蘇朗醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司生產(chǎn)；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、鹽酸、無水乙醇均為分析純，由天津市津?；び邢薰旧a(chǎn)；其他試劑均為分析純。

AR2140型電子分析天平（奧豪斯國際貿(mào)易有限公司）；601超級恒溫水?。ńK省金壇市醫(yī)療儀器廠）；T6新世紀(jì)型分光光度計（普析通用科技有限公司）；TGL-16高速臺式冷凍離心機（湖南湘儀離心機廠）；LABOROTA 4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Heidolph公司）；LGJ-18B型冷凍干燥機（北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司）。

1.2試驗方法

1.2.1樹脂種類參照夏文寬等的研究[3-5]，選擇12種樹脂：HPD100、HPD400、HPD500、HPD722、HPD826、HPD100B、AB-8、S-8、X-5、D4020、聚酰胺、XDA-7PH型，各樹脂型號及物理參數(shù)見表1。

1.2.2樹脂預(yù)處理將樹脂分別置于95%乙醇溶液中浸泡12 h，用蒸餾水漂洗至無醇味，再依次用1%鹽酸、蒸餾水、5% NaOH溶液、蒸餾水洗至中性。

1.2.3總黃酮含量測定

1.2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參照Li的方法[6]，稱取 20.00 mg 蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品，加入75%乙醇溶解定容至100 mL容量瓶中，制成濃度為0.20 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液；分別吸取 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL標(biāo)準(zhǔn)液置于25 mL比色管中，加5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻，放置5 min，再加10%硝酸鋁溶液1.0 mL，搖勻，放置5 min。最后加10%氫氧化鈉溶液10.0 mL，搖勻，75%乙醇定容至25 mL刻度放置15 min，以相應(yīng)試劑為空白，在505 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為y=4.780 7x+0.005 1，r2=0.999 6，在0.02～0.14 mg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

1.2.3.2樣品的測定將金花葵提取物樣品置于25 mL比色管中，加5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻，放置5 min，再加10%硝酸鋁溶液1.0 mL，搖勻，放置5 min。最后加10%氫氧化鈉溶液10.0 mL，搖勻，75%乙醇定容至刻度放置15 min，以相應(yīng)試劑為空白，在505 nm波長處測定吸光度， 利用回歸

1.2.5動態(tài)吸附和動態(tài)解吸試驗

1.2.5.1動態(tài)上樣量的確定參考嚴(yán)志慧的方法[5]，將靜態(tài)試驗篩選出的樹脂裝于層析柱（1.0 cm×30 cm）內(nèi)，用95%乙醇清洗滌至無白色渾濁，用蒸餾水洗至無醇味，將黃酮粗提液100 mL于柱頂注入，以1 mL/min的流速動態(tài)吸附，收集流出液，每5 mL為1個樣品，測定吸光度，計算黃酮濃度，繪制樹脂泄漏曲線，確定動態(tài)上樣量。

1.2.5.2水洗體積確定裝柱、進樣方法同“1.2.4.1”節(jié)，以1.0 mL/min的流速動態(tài)洗脫，分別使用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍去離子水洗脫，收集洗脫液，每5 mL為1個樣品，測定其吸光度，計算洗脫液中黃酮濃度，確定最佳水洗體積量。

1.2.5.3醇洗體積確定裝柱、進樣方法同“1.2.4.1”節(jié)，以1.0 mL/min的流速進行動態(tài)洗脫，用去離子水、80%乙醇洗脫，收集洗脫液，每5 mL為1個樣品，測定其吸光度，計算黃酮濃度，繪制動態(tài)解吸曲線，得出最優(yōu)乙醇洗脫體積。

1.2.5.4樹脂純化單因素試驗參考王克勤等的方法[8]，裝柱、進樣方法同“1.2.4.1”節(jié)。在其他因素不變的前提下，對單因素設(shè)定不同水平，以總黃酮吸附率為指標(biāo)進行單因素試驗。單因素試驗設(shè)計如下：（1）上樣液濃度單因素試驗：在 1.0 mL/min 流速吸附、上樣pH值為 4.0、蒸餾水洗脫、80%乙醇1.0 mL/min流速洗脫的條件下，上樣濃度優(yōu)選試驗設(shè)置為2.34、3.35、4.37、5.46、6.24 mg/mL。（2）上樣流速單因素試驗：在上樣濃度6.24 mg/mL、上樣pH值為4.0、蒸餾水洗脫、80%乙醇1.0 mL/min流速洗脫的條件下，上樣流速優(yōu)選試驗設(shè)置為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min。（3）上樣pH值單因素試驗：在上樣濃度6.24 mg/mL、1.0 mL/min流速吸附、蒸餾水洗脫、80%乙醇1.0 mL/min流速洗脫的條件下，上樣pH值優(yōu)選試驗pH值設(shè)置為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0。（4）乙醇洗脫濃度單因素試驗：在上樣濃度6.24 mg/mL、上樣pH值為4.0、1.0 mL/min流速吸附、蒸餾水洗脫、1.0 mL/min 流速洗脫的條件下，乙醇洗脫濃度優(yōu)選試驗設(shè)置為20%、40%、60%、80%、100%。

（5）洗脫流速單因素試驗：在上樣濃度6.24 mg/mL、1.0 mL/min 流速吸附、上樣pH值為4.0、蒸餾水洗脫、80%乙醇洗脫的條件下，洗脫流速優(yōu)選試驗設(shè)置為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min。

2結(jié)果與分析

2.1靜態(tài)試驗結(jié)果

2.1.1靜態(tài)吸附從表2可以看出，12種樹脂吸附量、吸附率大小順序為AB-8>聚酰胺>HPD826>HPD722>HPD100B>HPD100>D4020>HPD400>HPD500>X-5>S-8>XDA-7PH，其中AB-8的吸附率、吸附量最高，分別為38.81%和 44.63 mg/g，其次是聚酰胺，吸附率為38.20%，吸附量為 43.93 mg/g。

2.1.2靜態(tài)解吸由表3可知，12種樹脂解吸率大小順序為HPD500>HPD400>D4020>聚酰胺>HPD100>XDA-7PH>X-5>HPD826>HPD100B>S-8>HPD722>AB-8。[JP3]HPD500解吸率最大，為81.75%，其次是HPD400，解吸率為7954%，聚酰胺解吸率為73.22%，AB-8解吸率為45.65%。

2.1.3樹脂優(yōu)選圖1表明，綜合吸附率和解吸率選擇聚酰胺樹脂作為純化金花葵花總黃酮樹脂。

2.2動態(tài)試驗

2.2.1上樣量的確定圖2表明，流出液中總黃酮濃度隨上樣量增加而增大，上樣量達50 mL（第10管）時，流出液中總黃酮濃度為 0.66 7 mg/mL，約為上樣濃度6.24 mg/mL的 1/10，即樹脂達飽和吸附[7]，故上樣量確定為50 mL。

2.2.4聚酰胺樹脂純化條件確定

2.2.4.1上樣濃度的確定圖5表明，上樣濃度在2.34～4.37 mg/mL 之間時吸附率隨上樣濃度的升高而增大，且上樣濃度為4.37 mg/mL時，吸附率達最大值22.92%，隨后吸附率下降，故確定上樣濃度為4.37 mg/mL。

2.2.4.2上樣流速的確定圖6表明，上樣流速0.5～1.0 mL/min 之間時，吸附率隨之增大，并于1.0 mL/min時吸附率達最大值，上樣流速繼續(xù)增大，則吸附率下降，故上樣流速確定為10 mL/min。

2.2.4.3上樣pH值的確定由圖7可以看出，上樣pH值為2.0～6.0之間時，吸附率隨pH值的增加而增大，且pH值為6.0時達到最大值，pH值繼續(xù)增大，則吸附率下降，故確定上樣pH值為6.0。

2.2.4.4乙醇洗脫濃度的確定由圖8可以看出，乙醇洗脫濃度在20%～80%之間時，洗脫液中總黃酮含量隨乙醇濃度的[CM（25]升高而增大，濃度為80%時達到最大值，乙醇洗脫濃度在[CM）]

80%～100%時總黃酮含量隨之降低，故確定乙醇洗脫濃度為80%。

2.2.4.5洗脫流速的確定由圖9可知，洗脫流速在0.5～1.0 mL/min 時，洗脫液中總黃酮含量隨流速的增加而增大，流速1.0 mL/min時達最大值36.07 mg/g，而洗脫流速在 1.0～2.5 mL/min時總黃酮含量逐漸降低，故洗脫流速確定為1.0 mL/min。

3討論與結(jié)論

金花葵花總黃酮經(jīng)聚酰胺樹脂純化后具有一定的濃縮富集作用，粗提物純度為38.21%，聚酰胺樹脂純化后產(chǎn)品純度為72.6%，產(chǎn)品精制倍數(shù)為1.9倍，得到了良好的純化效果。

樹脂的極性是影響吸附性能的重要因素之一，極性不同吸附特點不同[9]。非極性樹脂是由偶極矩很小的單體聚合而成，與小分子疏水部分作用吸附有機物，適于吸附極性溶劑中的非極性物質(zhì)，如芳香族化合物。中極性樹脂含酯基表面兼有疏水和親水2個部分，既可在極性溶劑中吸附非極性物質(zhì)，又可在非極性溶劑中吸附極性物質(zhì)。極性樹脂含酰胺基、氰基、酚羥基等，通過靜電相互作用吸附極性物質(zhì)，如丙烯酰胺[10]。被吸附化合物的分子量大小和極性的強弱對吸附效果也有影響。例如同一種樹脂，對分子量較大的化合物吸附作用較強[11]。本研究選取的12種樹脂包含了極性（S-8、HPD826、HPD500）、弱極性（AB-8、聚酰胺、HPD722、XDA-7PH）、非極性（X-5、D4020、HPD100、HPD100B）和中極性（HPD400）4種類型，純化試驗結(jié)果表明，弱極性樹脂純化效果較好，其原因是金花葵花中的黃酮類化合物具有酚羥基和糖苷鍵，是弱極性的物質(zhì)，根據(jù)相似相容原理，弱極性的聚酰胺樹脂較為理想，其酰胺鍵與黃酮類化合物的酚羥基相結(jié)合吸附效果優(yōu)于其他樹脂。吳名全等采用聚酰胺純化乙醇回流提取金花葵花總黃酮，得到了較好的純化效果[12]。

影響樹脂吸附效果的主要因素為上樣液濃度、上樣液pH值、上樣流速及洗脫劑濃度、流速等。被吸附物濃度增加吸附效果增加，但被吸附物濃度增加有一定的限度，不能超過樹脂的吸附容量。若上樣濃度較低，部分樹脂未達到吸附飽和，而濃度過高時，黃酮提取液容易發(fā)生絮凝和沉淀，無法與樹脂充分接觸。在樹脂的吸附容量不是很大的情況下，一般低濃度下進行吸附效果較好[11]。陸志科等研究了大孔樹脂對竹葉黃酮的吸附分離特性，結(jié)果表明，上樣濃度為3.5 mg/mL時，大孔樹脂吸附率最高[13]。

黃酮類化合物為多羥基酚類，呈弱酸性，因而要達到高效的吸附效果，必須在弱酸性或酸性條件下進行吸附。pH值過大，金花葵花總黃酮中的酚羥基與聚酰胺以氫鍵的形式結(jié)合，堿性增大，酚羥基上的氫解離形成酸根離子，與樹脂結(jié)合力減弱，影響吸附率。肖坤福等采用PDH-600樹脂對多穗柯總黃酮的吸附性能研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pH值為5時吸附量最大，效果最好[14]。王冬梅等利用大孔吸附樹脂對翅果油樹葉中總黃酮進行了分離研究，翅果油樹葉樣液pH值為4時，LSA-10樹脂對總黃酮的吸附量最大[15]。

上樣流速主要是影響溶質(zhì)向樹脂內(nèi)表面擴散，決定吸附效果，如果吸附液流速太快，被吸附物質(zhì)的分子未被樹脂充分吸附就提早發(fā)生泄露。劉錫建等利用X-5樹脂對沙棘中總黃酮進行精制研究，結(jié)果表明，吸附速度為2 mL/min效果最好[16]。任順成等研究AB-8樹脂對玉米須總黃酮的純化效果，結(jié)果表明，吸附速度為12 mL/min效果最理想[17]。

洗脫速度一般都較慢，因為流速過快，洗脫性能差，洗脫帶寬，且拖尾嚴(yán)重，洗脫不完全；而流速過慢，會延長時間[17]。因此，在洗脫時，一定要確定合適的洗脫速度，常用的解吸流速為0.5～3 mL/min[18]。

本試驗對所選用12種不同極性的樹脂進行靜態(tài)試驗，結(jié)合靜態(tài)吸附率和靜態(tài)解吸率選出聚酰胺是純化金花葵花總黃酮的最理想樹脂，因其含有酰胺鍵可與黃酮的酚羥基結(jié)合，使純化效果更佳。對聚酰胺樹脂動態(tài)試驗條件優(yōu)化，確定了提取液上樣量50 mL、水洗體積5倍、醇洗體積5倍、上樣濃度4.37 mg/mL、上樣pH值6.0、上樣流速1.0 mL/min、80%乙醇溶液以1.0 mL/min流速洗脫的條件下，純化后的金花葵花總黃酮純度可達 72.6%。

參考文獻：

[1]吳明全. 珍稀植物——金花葵[J]. 現(xiàn)代園藝，2008（10）：16-17.

[2]彭志兵，吳正平. 高效液相色譜-質(zhì)譜法分析金花葵花中金絲桃苷[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（23）：10028-10029.

[3]夏文寬. 菜芙蓉花中黃酮的提取及抗氧化性分析[D]. 鎮(zhèn)江：江蘇大學(xué)，2007.

[4]蔡碧瓊. 稻殼黃酮類化合物的提取、精制及抗氧化活性研究[D]. 福州：福建師范大學(xué)，2008.

[5]嚴(yán)志慧. 芹菜黃酮的分離與純化技術(shù)研究[D]. 長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[6]Li W X. Standardization of method for determination of flavone in tartary buckwheat and its products[M]. Beijing：China Agricultural Science & Technology Press，2006：38-45.

[7]吳亞瓊. 柑橘皮黃酮提取、純化和抗氧化性研究[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2008.

[8]王克勤，嚴(yán)志慧，羅軍武，等. 聚酰胺樹脂分離純化芹菜黃酮的工藝研究[J]. 食品與機械，2009，25（3）：46-50.

[9]董珂. 大孔樹脂技術(shù)在中藥研究中的應(yīng)用概況[J]. 藥學(xué)實踐雜志，2006，24（1）：13-16.[ZK）]

[10]李萍. 大孔吸附樹脂在中草藥有效成分研究中的應(yīng)用[J]. 天津藥學(xué)，2002，14（3）：9-11.

[11]郭永學(xué)，李楠，楊美燕，等. 大孔吸附樹脂在中草藥研究中的應(yīng)用進展[J]. 藥品評價，2004，1（5）：378.

[12]吳名全，雷波. 金花葵花中總黃酮的提取純化及含量測定[J]. 農(nóng)技服務(wù)，2009，26（10）：127，138.

[13]陸志科，謝碧霞.大孔樹脂對竹葉黃酮的吸附分離特性研究[J]. 經(jīng)濟林研究，2003，21（3）：1-4.

[14]肖坤福，廖曉峰，于容，等. HPD-600樹脂對多穗柯總黃酮的吸附性能研究[J]. 廣州食品工業(yè)科技，2005，19（4）：10-11.

[15]王冬梅，李瑣，楊秀萍，等. 大孔吸附樹脂提取分離翅果油樹葉總黃酮的研究[J]. 西北植物學(xué)報，2003，23（9）：1621-1624.

[16]劉錫建，王艷輝，馬潤宇.利用大孔吸附樹脂精制沙棘總黃酮工藝的研究[J]. 中國油脂，2004，29（5）：37-39.

[17]任順成，丁霄霖. 大孔樹脂對玉米須類黃酮的吸附分離特性研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2003，29（12）：17-21.

[18]錢庭寶. 吸附樹脂及其應(yīng)用[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，1990.