GLP體系中轉基因生物檢測試驗的質量保證：以轉基因玉米MON863環(huán)境評價前期試驗為例

宋君+郭靈安+雷紹榮

摘要：轉基因生物檢測試驗是轉基因生物環(huán)境安全評價試驗的前期小型短期試驗，涉及到供試品和對照品的制備、基因組DNA的分離純化以及目的核酸片段數(shù)量的放大和分離等步驟。在良好實驗室規(guī)范（GLP）體系中，轉基因生物檢測試驗的質量保證有其特殊性。為了加強轉基因生物安全評價研究的質量保證，從轉基因生物檢測試驗步驟、執(zhí)行GLP的要求、試驗關鍵階段的檢查、原始資料的審查等方面分析了轉基因生物檢測試驗的質量保證要求和注意事項，為我國建設轉基因生物安全評價GLP實驗室提供有益探索。

關鍵詞：轉基因成分檢測；質量保證；良好實驗室規(guī)范

中圖分類號： S513.01文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0336-03

轉基因生物是科學家根據(jù)現(xiàn)代社會發(fā)展對農作物提出的“高產(chǎn)、高抗和優(yōu)質”等需求在實驗室里采用“剪切和重組”甚至“人工合成”等基因操作和化學合成等現(xiàn)代科學技術手段“制造”出的新型生物，包括轉基因動物、植物和微生物。目前，轉基因生物已經(jīng)在全球推廣種植約20多年[1]，但是由于潛在的安全問題[2-4]，轉基因生物及產(chǎn)品仍然未被社會廣泛接受。為了保護生物安全和生物多樣性，我國農業(yè)部組建了30多家轉基因生物安全檢測實驗室（包括擴項實驗室），其中有10多家實驗室具有轉基因生物環(huán)境安全評價資質。目前，這些實驗室都通過了基于ISO/IEC 17025—2005《檢測和校準實驗室能力的通用要求》的實驗室資質認定和部門審查認可，但是轉基因生物環(huán)境安全評價不純粹是一項“產(chǎn)品檢測”工作，而是一項研究周期至少長達1年，涉及植物保護學、生態(tài)學、栽培學、雜草學、昆蟲學、動物分類學、分子生物學以及數(shù)理統(tǒng)計學等8門學科在內的研究。轉基因生物環(huán)境安全評價是在對生物多樣性影響、基因漂移和生存競爭力等田間試驗以及大量的統(tǒng)計學數(shù)據(jù)基礎上，獲得轉基因生物對生態(tài)環(huán)境影響的總體評價的研究結論，而不是單一的理化“檢測數(shù)據(jù)”?！爱a(chǎn)品檢測”（通過質量控制）強調檢測數(shù)據(jù)的“準確性和重復性”，而轉基因生物環(huán)境安全評價試驗（通過質量保證）強調評價數(shù)據(jù)的真實性、可靠性和重現(xiàn)性，在此基礎上通過客觀、可靠的數(shù)據(jù)，科學得出轉基因植物環(huán)境安全與非轉基因植物環(huán)境安全的差異性結論。因此，良好的實驗室規(guī)范（good laboratory practices，GLP）比ISO/IEC 17025：2005質量體系更適合轉基因生物安全評價試驗。

GLP是指“有關機構運行以及非臨床健康和環(huán)境安全研究的計劃、實施、監(jiān)督、記錄、存檔和報告的運行條件的一套質量體系”，適用于法規(guī)要求的所有非臨床健康和環(huán)境安全研究，包括醫(yī)藥、農藥、食品和飼料添加劑、化妝品、獸藥和工業(yè)化學品的注冊或申請許可證[5-8]。隨著現(xiàn)代生物醫(yī)學技術的發(fā)展和人類環(huán)境保護意識的加強，很多產(chǎn)品也需要進行生態(tài)毒理學評價[9]，如抗蟲轉基因作物對非靶標昆蟲的毒理學評價。目前，國內外尚無關于轉基因生物環(huán)境安全評價研究的GLP報道，本研究嘗試按照GLP體系中質量保證的要求，對轉基因玉米MON863環(huán)境安全評價研究的前期小型試驗，轉基因玉米MON863“身份鑒定”試驗的步驟、執(zhí)行GLP的要求、試驗關鍵階段的檢查和原始資料的審查等方面的質量保證進行了分析，以期為我國轉基因生物安全檢測機構的GLP建設奠定基礎，加快我國與國際轉基因生物安全評價的MAD （mutual acceptance of data，數(shù)據(jù)互認），縮短我國農產(chǎn)品出口周期，促進我國轉基因生物產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

[WTHZ]1轉基因玉米MON863身份鑒定試驗與執(zhí)行GLP的要求

GLP機構接受委托單位開展轉基因玉米MON863環(huán)境安全評價研究，TFM（testing facility management，機構負責人）與委托單位（sponsor）簽署委托協(xié)議書。TFM分別任命負責轉基因玉米MON863環(huán)境安全評價的SD（study director，專題負責人）和QAM（quality assurance management，質量保證負責人）。SD撰寫試驗計劃書（試驗方案），QAM審核并保存計劃書副本，TFM審查批準計劃書。SD開始組織研究人員按照計劃書開展試驗（計劃書中首要小型試驗）。對轉基因玉米MON863身份鑒定試驗本質上是GLP機構對委托方提供的供試品身份確認。身份鑒定試驗主要包括供試品制備、供試品DNA的分離純化、MON863轉化事件核酸片段（目的片段）的擴增、電泳分離目的片段、染色與成像6個主要步驟。

為了保證研究質量，GLP規(guī)定QAU（quality assurance unit，質量保證部門）應制訂轉基因玉米MON863身份鑒定試驗的質量保證計劃（通?；谘芯康臋z查、設施的檢查以及過程的檢查）；質量保證人員要對試驗進行檢查，以確定其是否遵守GLP原則，確定研究人員是否持有并遵守研究計劃和標準操作程序；在檢查中質量保證人員要詳細記錄檢查的內容、發(fā)現(xiàn)的問題、采取的措施等并在記錄上簽名保存?zhèn)洳椤４送?，由于MON863玉米身份鑒定是分子操作試驗，容易污染實驗室和試驗體系導致假陽性結果。因此，在該試驗的檢查中還應重點檢查安全衛(wèi)生防護措施以避免試驗中的任何污染，包括檢查研究人員的著裝、實驗室正負壓系統(tǒng)、操作間的分區(qū)等。

2試驗關鍵階段的檢查

試驗關鍵階段的研究質量直接影響整個試驗的質量，因此對關鍵階段的檢查非常重要。質量保證人員首先要識別試驗的關鍵段。MON863身份鑒定試驗共分為6個階段，每個階段都存在直接影響試驗結果的干擾因素。在制樣階段，研究人員按照試驗方案要對供試品進行粉碎。試驗室的制樣設備（干磨杯）不是一次性耗材，往往經(jīng)過洗滌、烘干重復使用。若使用的干磨杯經(jīng)清洗后仍然殘留肉眼看不見的樣品（如干燥的樣品成分）就會污染下一次的試驗樣品。因此，質量保證人員在該階段應重點檢查研究人員是否執(zhí)行干磨杯清洗標準操作程序（如筆者實驗室的《干磨杯（制樣儀）清洗標準操作規(guī)范》）及記錄。檢查研究人員的記錄里有無證明干磨杯清洗后無原殘留樣品成分的證明試驗及結果。筆者實驗室用上一次試驗樣品的內源基因引物來擴增MON863玉米DNA。若能擴增出上一次樣品的內源基因，說明研磨MON863玉米的干磨杯沒有洗凈。在DNA提取階段，樣品間很容易交叉污染，所以質量保證人員還要檢查DNA提取階段是否設置了陰性、試劑空白以及提取空白對照。此外，從核酸分離、PCR到凝膠電泳的每個階段都應使用專用微量移液器，避免因使用過程中劇烈吸、排液體產(chǎn)生氣溶膠從而污染移液器。質量保證人員應重點檢查移液器的滅菌情況。PCR體系的預混階段也是最容易污染的環(huán)節(jié)，質量保證人員應根據(jù)標準操作手冊檢查PCR體系的“陽性、陰性、空白對照以及環(huán)境對照”是否設置；檢查PCR體系預混室負壓裝置運行情況；是否使用專用移液器；根據(jù)標準操作規(guī)范，重點檢查PCR體系配制與PCR體系的DNA模板加入是否分別在不同區(qū)間或超凈工作臺進行。PCR體系配制完畢是否通過單向傳遞到擴增室。電泳、染色與成像3個階段主要應檢查：（1）是否根據(jù)擴增的預期MON863片段大小配制恰當?shù)沫傊菨舛龋皇欠裨诳紤]了電泳槽正負兩極間的距離基礎上，恰當設置了電壓，以便合理控制目的片段在凝膠中的速度（除了凝膠的濃度外，分子運動速度也是影響電泳效果的因素）；是否根據(jù)標準操作規(guī)范配制電泳緩沖液，重點檢查電泳槽中正在使用的緩沖液使用時間是否超過規(guī)定的有效期（使用超過規(guī)定時間的緩沖液電泳，其緩沖能力下降會影響電泳效果甚至導致電泳失敗）。（2）染色階段重點檢查正在使用的EtBr溶液使用時間（次數(shù)）是否超過標準操作規(guī)范規(guī)定的時間（EtBr溶液濃度下降會影響染色效果）；檢查廢棄的EtBr溶液是否無害化處置。（3）最后階段重點檢查是否正確設置成像系統(tǒng)的曝光時間以及廢棄凝膠的無害化處理。

3原始資料的審查

與ISO/IEC17025等其他質量體系相比，GLP質量體系最大的特點就是研究質量的保證。GLP不僅強調現(xiàn)場質量檢查，也重視研究過程中所有的原始資料的審查。在本試驗中，質量保證人員應首先審查基于試驗過程的原始資料，包括供試品制備、DNA 提取、PCR擴增、電泳分離、染色以及成像等各環(huán)節(jié)的原始數(shù)據(jù)和記錄，如樣品制備記錄、稱量記錄、DNA提取記錄、提取DNA質量檢測記錄、DNA質量電子影像資料、PCR擴增原始記錄、PCR產(chǎn)物影像資料。在審查這些資料時，要注意檢查記錄是否客觀、完整；記錄有無修改（修改是否規(guī)范）；是否有記錄日期以及研究人員簽名等?？傊?，在GLP體系中記錄審查的唯一指導思想是記錄必須能真實反映試驗的客觀過程。除了基于研究過程的試驗記錄等原始資料的審查外，還應審查研究中設施運行的記錄，比如實驗室正、負壓設施的運行記錄等。

4討論

GLP質量體系與ISO/IEC17025質量體系是目前被國際上大多數(shù)實驗室采用和通過認證的2種質量體系，但兩者主要適用范圍不同。前者主要是規(guī)范安全類研究實驗室的行為，后者主要適用于檢測與校準實驗室。GLP原則是在世界近代藥害事件多次發(fā)生的基礎上必然產(chǎn)生的保障藥物非臨床研究質量的管理體系。從概念上看，雖然GLP體系主要適用于藥物和安全性研究的質量管理，但是GLP提出了一系列保證“研究質量”的原則，本質上適用于一切科學研究工作。GLP的核心是建立一套保證試驗操作規(guī)范、試驗數(shù)據(jù)記錄真實、研究結論科學的管理體系。

GLP法規(guī)建立的初衷是為了杜絕人類臨床用藥前藥物安全性評價中的數(shù)據(jù)偽造、毒理學試驗的操作不規(guī)范等實驗室不端行為。轉基因生物安全包括食用安全和環(huán)境安全。轉基因生物的食用安全一直是近年國際社會關注的熱點，而轉基因生物的環(huán)境安全主要是學術界爭論和研究的焦點。目前，包括我國在內的國際社會尚未將轉基因生物安全評價正式納入GLP質量管理體系，可能是因為截止目前人類發(fā)生的疾病無一例是與食用轉基因食品有關。以美國為首的轉基因生物及產(chǎn)品生產(chǎn)和研發(fā)大國認為轉基因食品實質等同于傳統(tǒng)食品，所以沒有像藥物安全性評價那樣將轉基因生物安全評價納入GLP體系管理。然而近年學術界關于轉基因生物安全研究的失實報道層出不窮，尤其是連國際頂級學術雜志《自然》（Nature）上發(fā)表的關于轉基因生物安全的科學論文也沒能避免數(shù)據(jù)處理、試驗方案設計不合理等問題，如“大斑蝶”[10]和“墨西哥玉米污染”[11]事件。后來經(jīng)科學家審查發(fā)現(xiàn)“大斑蝶”論文作者Losey等的試驗設計沒有合理的對照和具體的供試花粉劑量及毒素濃度[10，12-13]；而“墨西哥玉米污染”論文作者Quist等則因為反向PCR引物設計不當，把從墨西哥當?shù)赜衩灼贩NK1、A3中擴增出的產(chǎn)物誤認為與轉基因玉米品種中的adh1基因同源[11，14-15]。上述轉基因生物環(huán)境安全評價研究[10-11]沒有納入GLP質量管理，在試驗設計方案和試驗數(shù)據(jù)得不到質量保證的情況下，研究人員就將研究結果在國際著名學術雜志《自然》（Nature）上發(fā)表。文章刊出后，作為Bt玉米主要生產(chǎn)商之一的Monsanto公司股價迅速下降了10%；歐洲方面凍結了所有有關生產(chǎn)Bt玉米的申請；美國也對將要種植的Bt玉米品種作了延期處理[16]。目前，世界上有很多政府實驗室和專門研究機構在開展轉基因生物安全評價研究工作[17-18]。為了規(guī)范這些實驗室的研究行為，保證研究的質量，因此非常有必要將轉基因生物安全評價納入GLP法規(guī)管理。我國目前已經(jīng)將藥物、農藥、化學品和化妝品等與人類生命直接相關的安全評價研究納入GLP法規(guī)管理，轉基因生物的安全評價暫時沒有納入GLP管理。本研究按照GLP原則，通過轉基因生物安全評價前期試驗的GLP實踐，提出了在研究過程中的一些質量保證。這些質量保證可能尚未完全覆蓋轉基因生物安全評價試驗的GLP要素，還需在執(zhí)行GLP原則的研究實踐中繼續(xù)補充和完善。本研究報道的GLP質量保證在轉基因生物安全評價研究中的應用是對GLP應用新領域的初步探討，對建設高水平管理的轉基因生物安全評價實驗室有一定參考價值。

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