大鯢虹彩病毒套式PCR診斷方法的建立及應(yīng)用

王芳??+康超??+李永霞??+余波+周思旋

摘要：根據(jù)GenBank中大鯢虹彩病毒主要衣殼蛋白MCP基因序列，設(shè)計(jì)2對(duì)特異性的引物，通過對(duì)第1步和第2步PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立大鯢虹彩病毒主要衣殼蛋白套式PCR診斷方法。結(jié)果表明，該方法重復(fù)性好，第1次PCR擴(kuò)增敏感性達(dá)10 pg/mL，第2次PCR敏感性是1 fg/mL，對(duì)錦鯉皰疹病毒、斑點(diǎn)叉尾[XCZ11.tif；%95%95，JZ]病毒、嗜水氣單胞菌、檸檬酸桿菌、黃桿菌DNA擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。表明建立的套式PCR方法適合于大鯢虹彩病毒臨床樣品的快速診斷。

關(guān)鍵詞：大鯢虹彩病毒；套式PCR；臨床樣品

中圖分類號(hào)： S852.65+9.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1002-1302（2016）08-0291-03

近年來，大鯢人工養(yǎng)殖發(fā)展迅速，工廠化水平較高，苗種之間流通比較多，加之今年大鯢價(jià)格下降，養(yǎng)殖戶大量采購苗種，忽視引種檢疫，造成疾病大量暴發(fā)。其中，大鯢虹彩暴發(fā)最為嚴(yán)重，在陜西、四川、貴州等地報(bào)道較多，該病毒可引起大鯢大面積死亡[1-3]。目前，大鯢虹彩病毒的疫苗還處于研究階段，市面上還沒有商品化的疫苗[4-6]。因此，對(duì)大鯢虹彩病毒病的早期診斷及防治尤為重要。本研究根據(jù)GenBank中大鯢虹彩病毒主要衣殼蛋白MCP基因序列，設(shè)計(jì)2對(duì)特異性的引物，根據(jù)PCR反應(yīng)條件優(yōu)化，建立大鯢虹彩病毒主要衣殼蛋白套式PCR診斷方法，以期為臨床樣品的快速診斷、防治大鯢虹彩病毒病提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

毒株、菌株和細(xì)胞：大鯢虹彩病毒、錦鯉皰疹病毒、斑點(diǎn)叉尾[XCZ11.tif]病毒、嗜水氣單胞菌、檸檬酸桿菌、黃桿菌均由貴州重大疫病監(jiān)測(cè)防制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。鯉上皮瘤細(xì)胞購自上海拜力生物科技有限公司。

主要試劑：MIX PCR酶、核酸染料、1×TAE電泳緩沖液、DL2000購自北京天根生物科技有限公司。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，病毒基因組DNA提取試劑盒，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中大鯢虹彩病毒主要衣殼蛋白MCP基因序列，設(shè)計(jì)2對(duì)引物。

1.2.2病毒和細(xì)菌核酸的提?。?）病毒細(xì)菌核酸。將大鯢虹彩病毒液接種于鯉上皮瘤細(xì)胞，待細(xì)胞出現(xiàn)病變后收集細(xì)胞毒液，將其放入-70 ℃冰箱反復(fù)凍融3次，5 000 r/min離心10 min，取上清液200 μL用病毒基因組DNA試劑盒提取基因組。（2）細(xì)菌核酸。細(xì)菌核酸DNA提取參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。（3）組織樣品。取患病大鯢肝臟組織約1.0 g，加入0.1 mol/L PBS緩沖液2 mL進(jìn)行研磨，然后置于-70 ℃反復(fù)凍融3次，5 000 r/min離心 10 min，取上清液490 μL加入10%SDS 5 μL，蛋白酶K 5 μL（20 mg/mL），55 ℃孵育30 min，5 000 r/min離心10 min，取上清液200 μL用病毒基因組DNA試劑盒提取基因組。

1.2.3套式PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化對(duì)套式PCR的退火溫度（50、55、60 ℃）和引物濃度（5、10、20 μmol/L）進(jìn)行優(yōu)化。第1次和第2次PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序相同：在25 μL體系中加上下游引物各1 μL（5、10、20 μmol/L）、MIX PCR酶 12.5 μL、模板2 μL，ddH2O加至25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃（55 ℃、60 ℃）1 min，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳。

1.2.4敏感性試驗(yàn)將提取的病毒和細(xì)菌核酸用核酸蛋白儀檢測(cè)后，進(jìn)行10倍稀釋用于套式PCR反應(yīng)。從每個(gè)稀釋度中取2 μL作為模板進(jìn)行第1次PCR擴(kuò)增，如第1次PCR擴(kuò)增為陰性，再將第1次PCR產(chǎn)物取出2 μL作為模板，進(jìn)行第2次PCR擴(kuò)增，以確定建立的套式PCR敏感性。

1.2.5特異性試驗(yàn)以大鯢虹彩病毒、錦鯉皰疹病毒、斑點(diǎn)叉尾[XCZ11.tif]病毒、嗜水氣單胞菌、檸檬酸桿菌、黃桿菌DNA為模板分別進(jìn)行第1次和第2次PCR反應(yīng)，以確定建立的套式PCR特異性。

1.2.6建立的套式PCR對(duì)臨床樣品的檢測(cè)應(yīng)用建立的套式PCR對(duì)貴州省20個(gè)大鯢養(yǎng)殖場(chǎng)采集的46份大鯢肝臟（其中，21份為有臨床癥狀的病鯢，25份為無臨床癥狀但感染虹彩病毒的養(yǎng)殖場(chǎng)采集的樣品），44份大鯢餌料魚病料，20份大鯢養(yǎng)殖場(chǎng)水樣（其中9個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)以前發(fā)生過虹彩病毒），20份引種的鯢苗進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)參照Mao等建立的普通PCR方法[7]進(jìn)行對(duì)比。

2結(jié)果與分析

2.1套式PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

25 μL反應(yīng)體系中最佳反應(yīng)條件為退火溫度55 ℃，引物濃度10 μmol/L，第1次和第2次PCR能有效擴(kuò)增出目的片段，分別為700、300 bp，引物間無非特異性片段產(chǎn)生（圖1）。序列送生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序，結(jié)果與GenBank中大鯢虹彩病毒MCP基因相似性為99.9%。

2.2敏感性試驗(yàn)

大鯢虹彩病毒DNA經(jīng)蛋白質(zhì)核酸儀測(cè)定濃度為 1 μg/mL，經(jīng)10倍稀釋的病毒核酸進(jìn)行套式PCR，以檢測(cè)方法的敏感性。結(jié)果（圖2）表明，第1次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小約700 bp，大鯢虹彩病毒 DNA最低檢測(cè)量為10 pg/mL。在第1次PCR擴(kuò)增未見DNA亮帶，取第1次PCR產(chǎn)物2 μL進(jìn)行第2次PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物大小約300 bp。第2次PCR敏感性為1 fg/mL（圖3）。

2.3特異性試驗(yàn)

以大鯢虹彩病毒、錦鯉皰疹病毒、斑點(diǎn)叉尾[XCZ11.tif]病毒、嗜水氣單胞菌、檸檬酸桿菌、黃桿菌DNA為模板用2對(duì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。結(jié)果（圖3、圖4）顯示，大鯢虹彩病毒DNA第1次和第2次擴(kuò)增均為陽性，而錦鯉皰疹病毒、斑點(diǎn)叉尾[XCZ11.tif]病毒、嗜水氣單胞菌、檸檬酸桿菌、黃桿菌DNA第1次和第2次擴(kuò)增均為陰性。

2.4建立的套式PCR對(duì)臨床樣品的檢測(cè)

應(yīng)用建立的套式PCR檢測(cè)46份大鯢肝臟樣品陽性率為36.9%（17/46），普通PCR方法陽性率為19.5%（9/46）。套式[CM（25]PCR檢測(cè)44份大鯢餌料魚病料陽性率為0%，普通PCR[CM）]

方法陽性率為0%。套式PCR檢測(cè)20份大鯢養(yǎng)殖場(chǎng)水樣陽性率為10%（2/20），普通PCR方法陽性率為0%。套式PCR檢測(cè)20份引種的鯢苗陽性率為20%（4/20），普通PCR方法陽性率為15%（3/20）。

46份大鯢肝臟樣品中21份為有臨床癥狀的病鯢套式PCR檢測(cè)陽性率為42.8%（9/21），普通PCR方法陽性率為42.8%（9/21）。25份為無臨床癥狀但感染過虹彩病毒的養(yǎng)殖場(chǎng)采集的樣品陽性率為32%（8/25），普通PCR方法陽性率為4.7%（1/21）。9個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)以前發(fā)生過虹彩病毒水樣陽性率22.2%（2/9），普通PCR方法陽性率為0%。

3討論

近2年，隨著大鯢市場(chǎng)的走低，養(yǎng)殖戶對(duì)大鯢疫病防控的重視度下降。大鯢虹彩病毒是目前養(yǎng)殖大鯢最大的威脅，感染虹彩病毒可導(dǎo)致養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)大規(guī)模大鯢死亡，而虹彩病毒的暴發(fā)多是引種所致。因此，建立快速簡便經(jīng)濟(jì)適用的引種檢疫方法對(duì)大鯢虹彩病毒病的防治尤為重要。

目前，研究者主要依據(jù)大鯢虹彩病毒主要衣殼蛋白設(shè)計(jì)引物建立快速的診斷方法。周勇等根據(jù)大鯢虹彩病毒主要衣殼蛋白設(shè)計(jì)引物，建立大鯢虹彩病毒TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，敏感性約1.1×10-3 pg/μL病毒核酸，較之常規(guī)PCR的敏感度高出約1 000倍[8]。李惠芳等依據(jù)虹彩病毒蛙病毒屬主衣殼蛋白基因，建立虹彩病毒蛙病毒屬病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，該方法對(duì)虹彩病毒蛙病毒屬成員（新加坡石斑魚虹彩病毒除外）的檢測(cè)有高度的特異性，敏感性達(dá)到4.5×10-3 pg/μL，比傳統(tǒng)PCR的敏感度高出100倍[9]。這些熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)人員和設(shè)備的要求較高，在基層水產(chǎn)技術(shù)推廣站推廣多只配備了普通PCR儀器，該方法推廣較難。劉星星等據(jù)大鯢蛙病毒主要核衣殼蛋白MCP設(shè)計(jì)合成4條特異性引物建立環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，最低檢測(cè)限為5 copies/μL，而巢氏PCR和常規(guī)PCR的檢測(cè)限為 50 copies/μL和5×103 copies/μL，該LAMP方法檢測(cè)時(shí)間較快，但成本較高[10]。

套式PCR成本較低，敏感性較普通PCR高100倍左右，敏感性略低于熒光定量PCR，適合基層水產(chǎn)技術(shù)推廣站推廣應(yīng)用。賈坤同等依據(jù)大菱鲆紅體病虹彩病毒的腺苷三磷酸酶基因序列，設(shè)計(jì)了特異性的引物，建立了一種檢測(cè)大菱鲆紅體病虹彩病毒的套式PCR方法，該方法比普通PCR敏感性100倍[11]。本研究建立的診斷方法敏感性達(dá)到1 fg/mL，比普通PCR敏感性1 000倍。對(duì)感染過虹彩病毒的養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行大鯢樣品和養(yǎng)殖用水樣品檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該養(yǎng)殖場(chǎng)還存在陽性樣本，說明該養(yǎng)殖場(chǎng)可能還存在隱性感染。因此，建立的診斷方法可應(yīng)用于大鯢虹彩病毒引種檢疫和隱性感染檢測(cè)，有利于大鯢養(yǎng)殖場(chǎng)虹彩病毒的凈化。

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