松杉靈芝分離純化及ITS分子鑒定

鄒莉+孫婷婷+王旭彤+方釋慧+王世新+崔嶸

摘要：以采自黑龍江省大興安嶺圖強地區(qū)的野生松杉靈芝為試驗材料，采用組織分離法分別對其菌蓋處、菌蓋與菌柄交界處和菌柄處的組織進行分離純化；通過測定生長速度和污染率等方法，研究分離純化的最適培養(yǎng)基和最佳部位；最后將分離物進行ITS序列分析，計算遺傳距離，并采用鄰接法構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，分離純化最適培養(yǎng)基為PDA+子實體煮水培養(yǎng)基；菌蓋與菌柄交界處為最佳分離部位，菌絲生長速度快，菌絲長勢好，污染率低；分離物經(jīng)ITS序列測定，系統(tǒng)發(fā)育分析證實其為松杉靈芝。本研究獲得了松杉靈芝的純培養(yǎng)菌株，為松杉靈芝的進一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：松杉靈芝；組織分離；ITS序列分析；系統(tǒng)發(fā)育分析

中圖分類號： S567.3+10.1文獻標(biāo)志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0278-03

松杉靈芝（Ganoderma tsugae Murr.）為擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌[1]，是一種生長于針葉樹上的靈芝，是靈芝中的上品[2]。松杉靈芝入藥在我國已有悠久的歷史，是中藥寶庫中一味珍貴藥材，具有增強免疫、抑制腫瘤、保肝解毒、安神健腦、調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)機能、潤肺平喘、抗氧化、美容養(yǎng)顏等多種功效[3-4]。近年來，由于人為地?zé)o序采摘，加之生態(tài)條件的異常變化，目前野生松杉靈芝已到了一芝難求的狀況[5]。本研究以采自黑龍江省大興安嶺地區(qū)的野生松杉靈芝為試驗材料，通過組織分離法對其進行菌種分離純化以及ITS序列測定，為今后深入研究松杉靈芝和進一步實現(xiàn)人工馴化栽培及產(chǎn)業(yè)化發(fā)展奠定良好的基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試菌種

以采自黑龍江省大興安嶺圖強林業(yè)局過火樹樁上的松杉靈芝作為供試種菇，試驗材料選擇朵形正常、無病害、無蟲孔、無破損、生長健壯的子實體。

1.2試驗方法

1.2.1培養(yǎng)基的制備

本試驗共4種培養(yǎng)基，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，碳源為葡萄糖，其他培養(yǎng)基分別添加前人研究的最適氮源和無機鹽等作為比較。

PDA培養(yǎng)基（A）：馬鈴薯200 g（去皮），葡萄糖20 g，瓊脂18 g，水1 000 mL，pH值自然。將馬鈴薯切成1 cm×1 cm×1 cm 小塊放于鍋中加水煮20～30 min，過濾取濾液，加入葡萄糖與瓊脂煮沸4～5 min，分裝于三角瓶中，滅菌。滅菌采用高壓蒸汽滅菌，121 ℃滅菌20 min。

PDA+酵母膏培養(yǎng)基（B）：在1 L PDA培養(yǎng)基中加入5 g酵母膏[6]配制而成的培養(yǎng)基。

PDA+無機鹽培養(yǎng)基（C）：在1 L PDA培養(yǎng)基中加入1 g MgSO4、3 g KH2PO4[7]配制而成的培養(yǎng)基。

PDA+子實體煮水培養(yǎng)基（D）：松杉靈芝子實體用水煮后的濾液代替水配制而成的培養(yǎng)基。

1.2.2子實體不同部位對分離的影響

采集野外過火樹樁上的松杉靈芝，選取新鮮尚未完全成熟的子實體作為分離材料，用75%乙醇擦拭2～3遍后置于超凈工作臺中，在無菌條件下進行菌種分離。用無菌解剖刀分別在松杉靈芝子實體的菌蓋、菌蓋與菌柄交界處和菌柄處切取菌肉組織塊，接種在PDA平板培養(yǎng)基中，每個培養(yǎng)皿接1塊菌肉，20組重復(fù)，用封口膜進行封口后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每天觀察長勢并記錄。

1.2.3不同培養(yǎng)基對分離的影響

分別制備“1.2.1”中的4種培養(yǎng)基，對松杉靈芝進行分離培養(yǎng)。從上述試驗選出的最佳分離部位處取菌肉接于4種培養(yǎng)基中，每個平板接種1塊菌肉，重復(fù)20組，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，觀察菌絲長勢并記錄。

1.2.4DNA的提取、擴增和鑒定

采用快捷型植物基因組 DNA 提取試劑盒（天根，北京）分別對松杉靈芝的子實體和分離培養(yǎng)得到的菌絲體進行基因組 DNA 的提取。子實體用無菌的接種鉤鉤取其純凈的菌肉，放于研缽中，加入液氮充分研磨；菌絲體用無菌的小勺在分離培養(yǎng)基上刮取后放于研缽中，加入液氮充分研磨。其余步驟參照說明書。

采用通用引物ITS1和ITS4（ITS1：5′-TCCGTAGGT-GAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）用于rDNA ITS 區(qū)段的 PCR 擴增[8]。擴增體系為50 μL，其中去離子水為35.5 μL，10×PCR buffer 5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）4 μL，ITS1、ITS4 引物各2 μL，Taq DNA 酶（5 U/μL）0.5 μL，模板DNA 1 μL（濃度20～50 ng/μL）；PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，35個循環(huán)；72 ℃反應(yīng)7 min。對PCR擴增產(chǎn)物進行電泳檢測后送至哈爾濱博仕公司進行測序。

將測序結(jié)果在NCBI中作BLASTN比對，找出并下載>95% 相似性序列，用ClustalX 2.0的Alignment程序?qū)λ型葱蛄羞M行多重對位排列。用MEGA 5.0軟件包進行系統(tǒng)發(fā)育分析和進化樹的構(gòu)建。用Kimura2-parame-ter 模式計算遺傳距離，所有對位排列結(jié)果中的空位或缺失數(shù)據(jù)作完全刪除處理，進化距離分析采用鄰位相連法（NJ，neighbor-joining）。系統(tǒng)樹的每個分支的統(tǒng)計學(xué)顯著性分析以自展法進行檢驗，重復(fù)1 000次。

2結(jié)果與分析

2.1子實體不同部位對分離的影響

由表1可知，從松杉靈芝子實體的不同部位所取菌肉組織進行培養(yǎng)后，其中菌蓋與菌柄交界處的菌絲生長速度與其他2個部位相比差異極顯著，菌絲長勢最旺盛，生長速度最快，且污染率最低，都顯著低于其他2個部位的平均污染率。因此，菌蓋與菌柄交界處為最佳分離部位。

3結(jié)論與討論

本試驗采用組織分離法對野生松杉靈芝進行分離純化，結(jié)果表明，野生松杉靈芝可在實驗室條件下成功分離。通過對子實體分離得出結(jié)論：菌蓋和菌柄交界處為最佳分離部位，菌絲不但生長致密潔白、生長速度快，而且菌蓋和菌柄交界處的菌肉組織與外界真菌及細(xì)菌無直接接觸，在該部位進行分離，可有效降低菌絲受污染的概率；此外，本試驗篩選出最適宜分離的培養(yǎng)基為PDA+子實體煮水培養(yǎng)基，用該培養(yǎng)基進行組織分離能提高菌絲生長速度，原因可能是子實體煮水后含有菌絲生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì)和微量元素。

在核基因組研究中，常用核糖體 DNA 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，rDNA ITS 區(qū)）序列對植物和真菌進行鑒定和系統(tǒng)進化分析[9-11]。在進化過程中 ITS 區(qū)所受到的選擇壓力非常小，并且進化速率較快，在大部分的真核生物中都表現(xiàn)出較為廣泛的序列多態(tài)性。親緣關(guān)系很近的2個種都能通過ITS序列來顯示其差異性，表現(xiàn)出二者的系統(tǒng)進化關(guān)系[12-14]。

本試驗采用ITS序列比對法進行松杉靈芝菌種的鑒定，其準(zhǔn)確性高且簡單易行。通過對供試子實體與菌絲體的ITS區(qū)段長度進行比對，驗證供試菌絲體為松杉靈芝的分離物；構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹后驗證供試菌絲體與Ganoderma tsugae、Ganoderma oregonense有較近的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，為今后松杉靈芝的進一步開發(fā)利用提供了種質(zhì)資源與科學(xué)依據(jù)。

參考文獻：

[1]劉超，普瓊惠，王洪慶，等. 松杉靈芝的化學(xué)成分研究（Ⅱ）[J]. 中草藥，2007，38（11）：1610-1612.

[2]閆麗華，陳學(xué)全，王麗，等. 松杉靈芝藥用價值與人工栽培技術(shù)[J]. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技，2009（6）：123.

[3]陳靜，夏永輝，梁玲. 靈芝有效成分生物活性作用的研究進展[J]. 云南中醫(yī)中藥雜志，2009，30（1）：61-63.

[4]孫巍巍，包海鷹. 松杉靈芝提取物體外抗氧化活性的研究[J]. 中國食用菌，2010，29（6）：39-41，51.

[5]邢宗杰. 北緯53°地區(qū)栽培松杉靈芝試驗[J]. 食用菌，2010，32（5）：55-56.

[6]蔡愛群，吳基. 松杉靈芝母種培養(yǎng)基的篩選[J]. 食用菌，2007，29（3）：27-28.

[7]蔡愛群，任安祥，李海勃，等. 粵北地區(qū)桑枝屑栽培松杉靈芝試驗[J]. 食用菌，2008，30（4）：31-32.

[8]Yan H C，Xiao Y Y，Kun H，et al. The MYB transcription factor superfamily of Arabidopsis：expression analysis and phylogenetic comparison with the rice MYB family[J]. Plant Molecular Biology，2006，60（1）：107-124.

[9]寧淑萍，顏海飛，郝剛，等. 植物DNA條形碼研究進展[J]. 生物多樣性，2008，16（5）：417-425.[ZK）]

[10]田 敏，李紀(jì)元，倪穗，等. 基于ITS序列的紅山茶組植物系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究[J]. 園藝學(xué)報，2008（11）：1685-1688.

[11]燕勇，李衛(wèi)平，高雯潔，等. rDNA-ITS序列分析在真菌鑒定中的應(yīng)用[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志，2008，18（10）：1958-1961.

[12]李翠新，張婉潔，王兵，等. 昆明野生鮑魚菇的 ITS分子鑒定[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2014，26（5）：1202-1206.

[13]王化坤，陶建敏，渠慎春，等. 核果類果樹ITS序列分子進化及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究[J]. 園藝學(xué)報，2010，37（3）：363-374.

[14]陳貝貝，李溫平，周晶，等. 天臺山4種鵝耳櫪屬植物ITS序列的克隆與分析[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2011，23（6）：1107-1112.