24個(gè)抗瘟基因與哈爾濱市稻瘟病菌互作分析

馬軍韜+張國(guó)民+辛愛(ài)華+張麗艷+鄧凌韋+王永力+王英+肖佳雷+任洋+宮秀杰

摘要：為明確24個(gè)抗瘟基因與哈爾濱市稻瘟病菌的互作情況，應(yīng)用田間自然感病結(jié)合室內(nèi)接種的方式完成試驗(yàn)，得出以下結(jié)論：（1）2012年有[WTBX][STBX]Pi-12（t）、Pi-7（t）、Pi-9（t）、Pi-z5、Pi-20、Pi-ta2[WTBZ][STBZ]和[WTBX][STBX]Pi-sh[WTBZ][STBZ] 7個(gè)基因?qū)Φ疚敛”憩F(xiàn)免疫，2014年又新增[WTBX][STBX]Pi-km和Pi-5（t）[WTBZ][STBZ] 2個(gè)基因表現(xiàn)免疫；（2）Pi-i和Pi-k是植株發(fā)病率和葉片發(fā)病率上升幅度最大的基因，Pi-t和Pi-z是植株發(fā)病率和葉片發(fā)病率下降幅度最大的基因；（3）2012年病情指數(shù)最高的3個(gè)基因?yàn)镻i-z、Pi-kh和Pi-k，其病情指數(shù)分別為14.04、13.50和12.40，2014年病情指數(shù)最高的3個(gè)基因?yàn)镻i-k、Pi-a和Pi-i，其病情指數(shù)分別為65.39、33.64、29.38，葉片發(fā)病率與病情指數(shù)相關(guān)度最高；（4）從室內(nèi)接種結(jié)果看，24個(gè)抗瘟基因都存在被稻瘟病菌侵染的風(fēng)險(xiǎn)，其致病性相似系數(shù)介于0.20～0.75之間。綜合分析，24個(gè)抗瘟基因?qū)Φ疚敛〉目剐栽谀觌H間存在波動(dòng)，稻瘟病菌的致病性呈集中化趨勢(shì)。

關(guān)鍵詞：水稻單基因系；抗瘟基因；稻瘟病菌；病情指數(shù)

中圖分類號(hào)： S435.111.4+1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1002-1302（2016）08-0164-05

哈爾濱市是北方粳稻主產(chǎn)市之一，年種植面積超過(guò) 60萬(wàn)hm2，稻瘟病是該區(qū)域水稻生產(chǎn)上的主要病害，年均產(chǎn)量損失超過(guò)5.00%[1-2]。目前，當(dāng)?shù)厣a(chǎn)上主要通過(guò)化學(xué)藥劑來(lái)進(jìn)行病害的防控，成本高，污染環(huán)境[3-4]，不是病害的最佳解決途徑。以往的研究表明，水稻抗性品種對(duì)稻瘟病具有明顯的抵抗能力，而水稻品種的抗性主要來(lái)源于其自身攜帶的抗瘟基因。因此，分析水稻抗瘟基因?qū)Φ疚敛〉奶镩g真實(shí)抗性，可以為抗性品種選育及品種合理布局奠定理論基礎(chǔ)。

前人的相關(guān)研究主要集中在以抗瘟基因?yàn)殍b別體系，在分析稻瘟病菌致病性變化的同時(shí)，分析基因的抗性價(jià)值。馬軍韜等應(yīng)用日本清澤鑒別體系對(duì)黑龍江省稻瘟病菌生理小種進(jìn)行分析后認(rèn)為，抗瘟基因[WTBX][STBX]Pi-ta2、Pi-zt[WTBZ][STBZ]可在黑龍江省優(yōu)勢(shì)小種區(qū)利用，Pi-ks、Pi-t不可大規(guī)模利用[5]。劉文德等分析了24個(gè)抗瘟基因?qū)Ω＝ㄊ〉疚敛【目剐郧闆r，結(jié)果顯示，Pi-kh抗性最強(qiáng)，抗性頻率為98.15%，是優(yōu)質(zhì)抗源[6]。蘭波等分析了30個(gè)水稻抗瘟基因品系對(duì)江西省稻瘟病菌的抗性情況，結(jié)果顯示，Pi-zt和Pi-k抗性最強(qiáng)，抗性頻率分別為85.11%和82.95%，是優(yōu)質(zhì)抗源[7]。此外，李湘民等也進(jìn)行過(guò)類似研究[8-10]。上述研究都對(duì)解決當(dāng)時(shí)、當(dāng)?shù)氐疚敛∥：?wèn)題起到了積極的推動(dòng)作用，但在研究方法上均采用室內(nèi)接種方式，由于試驗(yàn)條件極為適宜，易導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果偏重情況的出現(xiàn)；此外，由于供試菌株數(shù)量多寡及采集地點(diǎn)不均衡等問(wèn)題，易導(dǎo)致菌株群體代表性不強(qiáng)情況的出現(xiàn)，造成人為誤差。本研究在對(duì)外部環(huán)境進(jìn)行測(cè)評(píng)的前提下，結(jié)合田間自然感病和室內(nèi)接種2種鑒定方式進(jìn)行分析，可以部分彌補(bǔ)上述不足，相對(duì)較好地反映抗瘟基因的真實(shí)抗性。

本研究以哈爾濱市道外區(qū)民主鄉(xiāng)為試驗(yàn)地點(diǎn)，該區(qū)域地理、氣候條件適中，既利于水稻連片種植，也利于稻瘟病菌定殖、擴(kuò)繁，直接導(dǎo)致當(dāng)?shù)氐疚敛￠L(zhǎng)期發(fā)生。以此為契機(jī)，本研究以區(qū)域內(nèi)稻瘟病菌為試驗(yàn)靶標(biāo)，通過(guò)田間自然感病的方式，分析了24個(gè)水稻單基因系與區(qū)域內(nèi)稻瘟病菌的互作情況；通過(guò)室內(nèi)接種的方式，分析了24個(gè)水稻單基因系的抗性及稻瘟病菌的致病性情況，以期為抗瘟基因綜合評(píng)價(jià)及抗性未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)等研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

水稻單基因系，24個(gè)，各含有1個(gè)已知抗瘟基因；感病對(duì)照品種為麗江新團(tuán)黑谷（LTH），不含任何抗瘟基因，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供。供試菌株，18個(gè)，于2014年從哈爾濱市道外區(qū)民主鄉(xiāng)感病水稻植株上分離獲得，由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院耕作栽培研究所提供。田間自然感病菌株，為混合菌株群，分別來(lái)源于2012年和2014年哈爾濱市道外區(qū)民主鄉(xiāng)。

1.2試驗(yàn)方法

水稻單基因系田間發(fā)病情況分析，采用田間自然發(fā)病方法完成試驗(yàn)。每個(gè)水稻單基因系播1行，15株，每行單基因系間插播1個(gè)誘發(fā)行，品種為蒙古稻，3次重復(fù)，四周保護(hù)行品種也為蒙古稻。2012年，環(huán)境條件適宜后，當(dāng)年混合菌群首先在誘發(fā)品種和部分高感單基因系上完成初侵染，形成大量分生孢子后，逐步完成多次再侵染，發(fā)病完全后，按下列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行調(diào)查[11]。病情分為6級(jí)，即0級(jí)：葉片上無(wú)任何病斑；1級(jí)：直徑小于0.50 mm的褐色病斑；2級(jí)：直徑為0.50～1.00 mm 的褐色病斑；3級(jí)：直徑為1.00～3.00 mm的橢圓形病斑，周?chē)稚?，中央灰白色?級(jí)：紡錘形病斑，直徑超過(guò) 3 mm，病斑無(wú)融合或略微融合；5級(jí)同4級(jí)，但由于病斑融合，葉片上半部枯死。統(tǒng)計(jì)分析時(shí)，將0～3級(jí)歸為抗病反應(yīng)型，4～5級(jí)歸為感病反應(yīng)型。于2014年在相同地點(diǎn)、應(yīng)用相同方法，以當(dāng)年混合菌群為侵染源，完成重復(fù)性試驗(yàn)。

水稻單基因系室內(nèi)發(fā)病情況分析，通過(guò)噴霧接種的方式完成。稻瘟病菌株的分離、培養(yǎng)及擴(kuò)繁參照周江鴻等的方法[12]。幼苗以草碳土、黑土為基質(zhì)，育秧盤(pán)育苗，每個(gè)水稻單基因系保苗15株，3次重復(fù)。待幼苗長(zhǎng)至3葉1心時(shí)，搬入人工氣候室，應(yīng)用孢子懸浮液進(jìn)行噴霧接種，懸浮液濃度為 5×105 個(gè)孢子/mL（含0.025%吐溫-20），劑量為每盤(pán) 100 mL。接種完成后，在26 ℃、相對(duì)濕度100%條件下暗培養(yǎng)30 h，光照培養(yǎng)96～144 h，發(fā)病完全后按上述標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行調(diào)查[11]。將能夠給水稻單基因系植株造成4～5級(jí)傷害的稻瘟病菌株稱為致病菌株，其余稱為非致病菌株。

1.3數(shù)據(jù)分析

[JZ（]植株發(fā)病率=100%×（發(fā)病分蘗數(shù)/植株總分蘗數(shù)）；[JZ）]

[JZ（]葉片發(fā)病率=100%×（發(fā)病葉片數(shù)/總?cè)~片數(shù)）；[JZ）]

葉瘟病情指數(shù)=100×∑（發(fā)病葉片數(shù)×發(fā)病級(jí)別）/（總?cè)~片數(shù)×最高發(fā)病級(jí)別）；

[JZ（]室內(nèi)發(fā)病率=100%×（致病菌株數(shù)/總菌株數(shù)）。[JZ）]

將抗瘟基因與稻瘟病菌的互作反應(yīng)型作為性狀，當(dāng)抗瘟基因?qū)Φ疚敛【憩F(xiàn)抗病時(shí)記為“1”，表現(xiàn)感病時(shí)記為 “0”，構(gòu)成二態(tài)性狀。利用DPSv7.05分析軟件，以類平均法進(jìn)行致病性相似度聚類分析，相似系數(shù)=1-相異系數(shù)。以SNK法進(jìn)行抗瘟基因間差異顯著性分析，同時(shí)應(yīng)用該軟件進(jìn)行指標(biāo)間的相關(guān)分析。

應(yīng)用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與計(jì)算。

2結(jié)果與分析

2.1水稻單基因系田間植株發(fā)病情況分析

以當(dāng)年田間混合菌株群為選擇壓力，對(duì)水稻單基因系植株發(fā)病情況進(jìn)行了分析，結(jié)果（表1）顯示：2012年，在24個(gè)供試基因中，對(duì)稻瘟病菌表現(xiàn)免疫的基因有7個(gè)，分別為[WTBX][STBX]Pi-12（t）、Pi-7（t）、Pi-9（t）、Pi-z5、Pi-20、Pi-ta2[WTBZ][STBZ]和Pi-sh。在表現(xiàn)感病的17個(gè)基因中，其發(fā)病率介于2.58%～47.03%之間，平均發(fā)病率為19.93%。其中，[WTBX][STBX]Pi-11[WTBZ][STBZ]基因發(fā)病率最低，Pi-k基因發(fā)病率最高。此外，感病對(duì)照品種麗江新團(tuán)黑谷發(fā)病嚴(yán)重，發(fā)病率為73.13%。

2個(gè)免疫基因。在表現(xiàn)感病的15個(gè)基因中，其葉片發(fā)病率介于2.21%～81.74%之間，平均發(fā)病率為18.83%，升高趨勢(shì)明顯。其中，Pi-zt基因發(fā)病率最低，Pi-k基因發(fā)病率最高。此外，感病對(duì)照品種麗江新團(tuán)黑谷發(fā)病加重，發(fā)病率升至 90.18%。

從葉片發(fā)病率的年際變化角度分析，感病對(duì)照品種麗江新團(tuán)黑谷發(fā)病明顯且程度較重，證明結(jié)果真實(shí)可信。對(duì)比2012年與2014年水稻單基因系試驗(yàn)結(jié)果，穩(wěn)定中同樣存在較大波動(dòng)，主要存在3種類型：（1）表現(xiàn)免疫的抗瘟基因，包括[WTBX][STBX]Pi-12（t）[WTBZ][STBZ]等7個(gè)基因。（2）葉片發(fā)病率降低的抗瘟基因，包括Pi-z等8個(gè)基因，其中Pi-z基因發(fā)病率下降12.04百分點(diǎn)，降幅最大；[WTBX][STBX]Pi-5（t）[WTBZ][STBZ]基因發(fā)病率下降1.16百分點(diǎn)，降幅最小。（3）葉片發(fā)病率上升的抗瘟基因，包括Pi-k等9個(gè)基因，其中Pi-k基因發(fā)病率上升64.84百分點(diǎn)，升幅最大；[WTBX][STBX]Pi-19（t）[WTBZ][STBZ]基因發(fā)病率上升1.22百分點(diǎn)，升幅最小。

應(yīng)用病情指數(shù)對(duì)葉瘟發(fā)生的普遍率和嚴(yán)重度進(jìn)行了綜合分析，結(jié)果（表3）顯示：2012年，在24個(gè)供試抗瘟基因中，對(duì)稻瘟病菌表現(xiàn)免疫的基因有7個(gè)，分別為[WTBX][STBX]Pi-12（t）、Pi-7（t）、Pi-9（t）、Pi-z5、Pi-20、Pi-ta2和Pi-sh[WTBZ][STBZ]。在表現(xiàn)感病的17個(gè)基因中，其病情指數(shù)介于0.70～14.04之間，平均病情指數(shù)為5.43。其中，[WTBX][STBX]Pi-5（t）[WTBZ][STBZ]基因病情指數(shù)最低，Pi-z基因病情指數(shù)最高。此外，感病對(duì)照品種麗江新團(tuán)黑谷綜合發(fā)病情況嚴(yán)重，病情指數(shù)為32.34。從抗瘟基因差異性角度分析，在0.05、0.01差異水平上，24個(gè)基因均被劃分為10個(gè)差異梯度，其中Pi-kp基因與其他23個(gè)基因表現(xiàn)顯著差異。

3討論

稻瘟病作為一種侵染性病害，其危害程度與環(huán)境條件有直接關(guān)系。針對(duì)哈爾濱市的生產(chǎn)實(shí)際，每年7—9月的溫度、濕度等氣象因子對(duì)稻瘟病菌的侵染及循環(huán)影響較大。2012年哈爾濱市7—9月的平均氣溫分別為23.97、22.1、16.75 ℃，2014年7—9月的平均氣溫分別為23.78、2201、15.97 ℃，比較接近；而且，這2年7—9月的平均相對(duì)濕度均在70%～78%，也比較接近；整體分析，氣象因子在2年間差異不大。此外，本研究中的2年試驗(yàn)是在同一地點(diǎn)、田間無(wú)明顯病株殘留物前提下，應(yīng)用同一類型種質(zhì)完成分析的，試驗(yàn)環(huán)境基本一致。因此，粗略認(rèn)為，整體外部環(huán)境因素在年際間差異較小，病菌致病性及致病力的年際變化可能主要是內(nèi)在變異或與種質(zhì)互作的結(jié)果。

本研究之所以從植株發(fā)病率指標(biāo)和葉片發(fā)病率指標(biāo)進(jìn)行稻瘟病菌分析，主要是因?yàn)檫@2個(gè)發(fā)病率指標(biāo)可以部分代表病菌在水稻中的寄生與分布狀態(tài)。植株發(fā)病率是以水稻的單個(gè)分蘗為調(diào)查基數(shù)，可部分代表病菌在水稻群體中的分布廣度；葉片發(fā)病率是以水稻的單個(gè)葉片為調(diào)查基數(shù)，可部分代表病菌在水稻個(gè)體中的分布集中度。例如：3個(gè)水稻分蘗株上各有1個(gè)葉片發(fā)病和1個(gè)水稻分蘗株上有3個(gè)葉片發(fā)病，粗看結(jié)果一致，都是3個(gè)葉片發(fā)病，但實(shí)際意義不同。前者在水稻群體中分布更廣，后者在水稻個(gè)體中分布更集中，一旦外界環(huán)境適應(yīng)，前者可能造成分散式發(fā)病，后者可能造成有核心的擴(kuò)展式發(fā)病，如果進(jìn)行化學(xué)防治，前者必須全面噴灑農(nóng)藥方能取得理想效果，后者可能在尋找核心發(fā)病區(qū)的基礎(chǔ)之上進(jìn)行有重點(diǎn)的噴灑農(nóng)藥即可取得理想效果。由此可見(jiàn)，進(jìn)行水稻種質(zhì)2個(gè)發(fā)病率指標(biāo)的分別調(diào)查有其科學(xué)性和現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。

綜合24個(gè)水稻單基因系植株發(fā)病率、葉片發(fā)病率和葉瘟病情指數(shù)等指標(biāo)的變化情況后認(rèn)為，稻瘟病菌或抗瘟基因可能存在下列幾點(diǎn)變異規(guī)律：（1）表現(xiàn)感病的抗瘟基因數(shù)量在年際間呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明病菌的整體致病性可能呈集中化趨勢(shì)。（2）年際間植株發(fā)病率與葉片發(fā)病率上升基因數(shù)量上多于發(fā)病率下降基因，在變化程度上前者也明顯大于后者，加之感病對(duì)照麗江新團(tuán)黑谷的發(fā)病率也呈明顯上升趨勢(shì)，側(cè)面說(shuō)明病菌的整體致病力可能呈增強(qiáng)趨勢(shì)，同時(shí)也說(shuō)明抗瘟基因群體的整體抗性可能呈下降趨勢(shì)。（3）各個(gè)指標(biāo)的內(nèi)部差值在年際間呈擴(kuò)大趨勢(shì)，抗瘟基因的差異梯度在年際間呈增加趨勢(shì)，說(shuō)明抗瘟基因的抗性差異化趨勢(shì)明顯，高抗性基因與低抗性基因進(jìn)一步分開(kāi)。結(jié)合各個(gè)指標(biāo)的信息綜合評(píng)價(jià)，Pi-k、Pi-i、Pi-ta和Pi-a基因抗性喪失速度過(guò)快，建議不要應(yīng)用；[WTBX][STBX]Pi-12（t）、Pi-9（t）[WTBZ][STBZ]等7個(gè)基因抗性很好且相對(duì)穩(wěn)定，可以廣泛應(yīng)用，這一結(jié)論與蘭波、李進(jìn)斌和張國(guó)民等的研究結(jié)果比較類似；Pi-z基因抗性提升很快，可以有限度的應(yīng)用。

從幾個(gè)指標(biāo)的相關(guān)度方面分析，病菌在水稻個(gè)體中的分布集中度與綜合發(fā)病程度關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)，病菌在水稻群體中的分布廣度與綜合發(fā)病程度關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)，而發(fā)病級(jí)別與病害的綜合發(fā)生程度關(guān)聯(lián)性較差，這可能與2年間發(fā)病程度相對(duì)均勻有直接關(guān)系。

從水稻單基因系的室內(nèi)接種結(jié)果分析，由于選擇壓力更大，侵染條件更加適宜，沒(méi)有出現(xiàn)免疫抗瘟基因，各供試基因都存在或高或低的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。鑒于試驗(yàn)菌株數(shù)量偏少，定量分析結(jié)果可能存在誤差，但仍可以說(shuō)明一定的問(wèn)題：（1）每個(gè)稻瘟病菌株的致病型各不相同，說(shuō)明來(lái)源于相同地點(diǎn)的菌株間仍然存在明顯的致病性分化；（2）菌株彼此間致病性相似系數(shù)差值較大，說(shuō)明菌株間的致病性分化程度比較劇烈；菌株間侵染抗瘟基因的數(shù)量差別較大、平均值不高，說(shuō)明菌株間的致病力存在明顯差別，但目前整體水平不高。

此外，鑒于水稻單基因系都存在發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，需進(jìn)一步關(guān)注新型抗源的應(yīng)用工作。目前，國(guó)內(nèi)外共發(fā)現(xiàn)各類抗瘟基因超過(guò)100個(gè)[13-21]，但轉(zhuǎn)育成水稻單基因系的明顯較少[22]，多數(shù)基因由于缺乏單基因系載體而無(wú)法評(píng)價(jià)其真實(shí)抗性，從而限制了相關(guān)工作的深入開(kāi)展。

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