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    外源過氧化物酶在畢赤酵母中的優(yōu)化表達

    2017-02-15 18:56:54楊靜吳慧潘一展
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年8期
    關(guān)鍵詞:血紅素微量元素

    楊靜+吳慧+潘一展

    摘要:為提高外源過氧化物酶基因在畢赤酵母中的表達量,對甲醇畢赤酵母誘導(dǎo)表達培養(yǎng)基進行優(yōu)化,在培養(yǎng)基中添加0.5 g/L高鐵血紅素,每12 h補加100%甲醇至終濃度為0.5%,待酵母生長量達到最大值時加入0.5 mL/L微量元素混合物。結(jié)果表明,優(yōu)化后培養(yǎng)基表達量是普通培養(yǎng)基的10.6倍,研究為后期外源蛋白進入發(fā)酵罐生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

    關(guān)鍵詞:過氧化物酶基因;畢赤酵母;優(yōu)化培養(yǎng)基;血紅素;微量元素

    中圖分類號:Q814文獻標(biāo)志碼:

    文章編號:1002-1302(2016)08-0051-02

    近年來,酶工程在生物技術(shù)領(lǐng)域得到很大發(fā)展,過氧化物酶被應(yīng)用于疾病診斷及治療、農(nóng)作物品種選育及病蟲害防治、染料中脫色劑生產(chǎn)[1]、有機物和聚合物合成[2]、農(nóng)業(yè)廢棄物處理[3]等領(lǐng)域。但是,天然酶在開發(fā)和應(yīng)用中受到一定限制。本研究采用基因重組技術(shù)生產(chǎn)酶,研究外源蘿卜過氧化物酶在甲醇畢赤酵母中的表達,旨在探討高表達量的優(yōu)化培養(yǎng)條件。

    1材料與方法

    1.1材料

    菌株:野生型畢赤酵母GS115(GS115)及商丘學(xué)院風(fēng)景園林學(xué)院實驗室構(gòu)建的轉(zhuǎn)蘿卜過氧化物酶基因(RsPrxl)型畢赤酵母GS115(GSRP25)均由該實驗室保存。

    培養(yǎng)基 YPD、BMGY/BMMY組成和配制參見 Invitrogen 公司畢赤酵母操作手冊。

    1.2方法

    1.2.1菌種活化挑取菌株 GSRP25在 YPD上進行平板劃線培養(yǎng),分離后,挑取單菌落進行優(yōu)化誘導(dǎo)培養(yǎng)。

    1.2.2轉(zhuǎn)基因酵母的誘導(dǎo)表達培養(yǎng)挑取2個GSRP25單菌落分別接種于200 mL BMGY培養(yǎng)基中,pH值7.4、26 ℃、0.5%甲醇、225 r/min條件下培養(yǎng)[4]。待D600 nm達到2~3時,靜置,收集菌體分別重懸于20 mL BMMY中和含有0.5 g/L血紅素[5]的20 mL BMMY中培養(yǎng),每12 h補加甲醇至終濃度為 0.5%,80~90 h間酵母生長量達到最大值,此刻向培養(yǎng)基中加入0.5 mL/L微量元素混合物(0.5 g/L MgCl2,30 g/L FeCl2·6H2O,1 g/L ZnCl2·4H2O,0.2 g/L CoCl2·6H2O,1 g/L Na2 MoO4·2H2O,0.5 g/L CaCl2·2H2O,1 g/L CuCl2和0.2 g/L H2BO3)[6]繼續(xù)培養(yǎng)。

    1.2.3各項指標(biāo)的測定每12 h取1 mL菌液,4 ℃、10 000 r/min 離心20 min,取上清,測D600 nm;采用愈創(chuàng)木酚法[7]測過氧化物酶(POD)活性;采用Bradford的微量法[8]測定可溶性蛋白含量,以小牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.2.4表達產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測POD同工酶活性電泳采用垂直板聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳方法,凝膠采用Lopes等的方法[9]制備,電泳后POD用聯(lián)苯胺染色[10]。用天能GIS-1000凝膠成像和分析系統(tǒng)拍照分析。

    2結(jié)果與分析

    2.1不同誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下菌體生長狀態(tài)

    D600 nm代表菌株生長速度,由圖1可知,在2種培養(yǎng)條件下,D600 nm隨時間的延長都有所增加,說明酵母生長比較穩(wěn)定;但從60 h開始,普通培養(yǎng)基培養(yǎng)的酵母生長速度緩慢,而優(yōu)化培養(yǎng)基培養(yǎng)的酵母生長速度開始加快;96 h取樣檢測發(fā)現(xiàn),D600 nm達到72.3,比普通培養(yǎng)基培養(yǎng)的酵母增加了近37%。

    2.2POD活性的變化

    由圖2可見,優(yōu)化培養(yǎng)基中POD的活性顯著高于普通培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)基因酵母GSRP25在普通誘導(dǎo)培養(yǎng)基條件下,隨著培養(yǎng)時間延長,外源POD的表達量增加不明顯,在培養(yǎng)72 h后趨于穩(wěn)定。在優(yōu)化后的誘導(dǎo)表達培養(yǎng)基培養(yǎng)下,隨著培養(yǎng)時間延長,外源POD活性顯著增加,在培養(yǎng)72 h后也慢慢趨于穩(wěn)定,培養(yǎng)96 h酶活性達到最大值,為 30.9 U/mL,是普通BMMY培養(yǎng)基酶活性的5.9倍;且在培養(yǎng)12 h時,酶活性為4.7 U/mL,幾乎達到普通培養(yǎng)基培養(yǎng)的最大酶活量,說明優(yōu)化后的誘導(dǎo)表達培養(yǎng)基對酶活性的表達有顯著提高作用。

    2.3可溶性蛋白含量變化

    巴斯德畢赤酵母作為外源基因表達的酵母宿主,自身分泌的蛋白非常少,外源POD的表達量可以用培養(yǎng)基上清中蛋白含量來衡量。由圖3可知,在普通BMMY培養(yǎng)基條件下,外源蛋白的表達量很低,培養(yǎng)96 h后蛋白含量只有 0.018 g/mL;而優(yōu)化BMMY培養(yǎng)基培養(yǎng)的外源蛋白表達量很高,培養(yǎng)36 h后蛋白含量迅速增加,培養(yǎng)72 h后蛋白表達量趨于穩(wěn)定,培養(yǎng)96 h時蛋白表達量達到最大值,為 0.18 g/mL,約是普通 BMMY 培養(yǎng)基表達量的10倍。說明優(yōu)化BMMY培養(yǎng)基顯著提高了外源POD蛋白的表達量。

    2.4SDS-PAGE檢測目的蛋白

    已知目的蛋白的分子量約37 ku,由圖4可見,優(yōu)化后培養(yǎng)基培養(yǎng)目的蛋白的條帶比普通培養(yǎng)基培養(yǎng)的目的蛋白條帶粗、顏色深,說明優(yōu)化后的培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達的蛋白量明顯增多。

    3結(jié)論與討論

    縱觀近年來的文獻報道,提高外源蛋白在巴斯德畢赤酵母中表達量主要有2種途徑,一是優(yōu)化誘導(dǎo)表達的時間、溫度、pH值、搖床轉(zhuǎn)速、通氧量、添加微量元素等,如RsPHGPx在1%甲醇、pH值6、28 ℃條件下誘導(dǎo)60 h后得到最大表達量,產(chǎn)率約為102 mg/L[11]。本研究結(jié)果與文獻報道一致,在0.5%甲醇、pH值7.4、26 ℃、通氣面積1.5 cm2、225 r/min 條件下,有利于蘿卜過氧化物酶RsPrx1表達。二是結(jié)合外源目的蛋白自身的結(jié)構(gòu)特點,利用適合外源蛋白合成的某些誘導(dǎo)劑可以提高重組蛋白的表達量[12]。POD蛋白分子的活性中心含F(xiàn)e(Ⅲ)-原卟啉Ⅸ(血紅素)輔基,只有在輔基存在的條件下,酶才被稱為全酶,具有活性。所以血紅素是組成POD分子的必需基團,在一定程度上增加血紅素含量,有助于輔基卟啉含量的增加,從而促進POD合成。Gu等報道,利用甲醇畢赤酵母GS115表達外源錳過氧化物酶時,在培養(yǎng)基中添加0.5 g/L血紅素,錳過氧化物酶的表達量增加[5]。有報道表明,在添加0.5 g/L高鐵血紅素的培養(yǎng)基中,錳過氧化物酶在曲霉菌中的表達量增加[13]。Conesa等研究證實,用曲霉菌表達錳過氧化物酶,在培養(yǎng)基中加入0.5 g/L血紅素,過氧化物酶的產(chǎn)量達到100 mg/L[14]。以上研究為本研究中添加0.5 g/L高鐵血紅素提供一定的理論依據(jù)。另外,無機鹽或礦物質(zhì)元素在微生物生長過程中提供了各種重要元素,在配制酵母誘導(dǎo)表達培養(yǎng)基時添加必要的微量元素,有助于酵母生長。其中Fe是目的蛋白POD的分子成分,Na+維持滲透壓,Mg2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+可以作為酶的激活劑[15]。表達系統(tǒng)中含有適量的Mg2+、K+、NH+4、Ca2+有利于降低蛋白質(zhì)合成中的錯讀[16]。因此在本研究中,在優(yōu)化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加了各種微量元素。結(jié)合以上理論依據(jù),本研究從培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基成分入手進行改良,結(jié)果表明,在BMMY培養(yǎng)基中添加0.5%甲醇、0.5 g/L高鐵血紅素、0.5 mL/L微量元素,獲得的酶活性達30.9 U/mL,是普通培養(yǎng)基的5.9倍,說明優(yōu)化后的誘導(dǎo)表達培養(yǎng)基有效提高了外源蛋白的表達量。

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