互花米草NHX1基因的cDNA全長(zhǎng)克隆、序列信息及定量表達(dá)分析

徐璐??+尹海波??+張俠??+曹雪霖??+盧楠楠??+閆麗華??陳世華??郭善利

摘要：以鹽生植物互花米草（Spartina alterniflora）為試驗(yàn)材料，利用RACE技術(shù)克隆到編碼Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的[WTBX][STBX]NHX1[WTBZ][STBZ]基因的cDNA全長(zhǎng)序列。利用生物信息學(xué)軟件及網(wǎng)站對(duì)獲得的基因核苷酸序列及編碼的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該核苷酸序列長(zhǎng)度為2 277 bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)? 623 bp，編碼540個(gè)氨基酸殘基，且該基因所編碼的蛋白質(zhì)與植物的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NHX1 同源，所以命名為[WTBX][STBX]SaNHX1[WTBZ][STBZ]基因。同時(shí)氨基酸序列比對(duì)顯示，其與蘆葦（Phragmites australis NHX，BAD95562.1）、玉米（Zea mays NHX，XP_008653443.1）、水稻（Oryza sativa NHX，BAA83337.1）等的NHX親緣關(guān)系相近，同源相似性依次為94%、92%、91%。利用Qiagene Rotor Gene Q熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀對(duì)不同時(shí)間鹽處理及ABA處理的互花米草材料進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在鹽處理及ABA處理的不同處理時(shí)期，該基因的相對(duì)表達(dá)量都發(fā)生了明顯的變化，這表明該基因受到了鹽脅迫及ABA脅迫的誘導(dǎo)，由此可以看出[WTBX][STBX]SaNHX1[WTBZ][STBZ]基因與植物的耐鹽性有著密切的關(guān)系。

關(guān)鍵詞：耐鹽性；互花米草；[WTBX][STBX]NHX1[WTBZ][STBZ]基因；相對(duì)定量表達(dá)

中圖分類(lèi)號(hào)： Q785；Q786文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

隨著土壤鹽堿化面積的不斷增加，植物面臨著越來(lái)越嚴(yán)峻的高鹽挑戰(zhàn)。土壤中高濃度的鹽分會(huì)給植物帶來(lái)生理干旱、離子毒害等多種危害，嚴(yán)重影響到植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育，從而抑制農(nóng)作物的高產(chǎn)。對(duì)于大部分植物來(lái)說(shuō)，高鹽脅迫對(duì)植物的危害主要是由高濃度的Na+積累所導(dǎo)致的。雖然不同植物的耐鹽機(jī)制存在差異，但是其基本策略都是保持胞內(nèi)Na+的平衡[1]。其中，植物體內(nèi)的液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（vacuolar Na+/H+antiporter）在植物抗鹽堿的過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，它可以將細(xì)胞質(zhì)中過(guò)多的Na）隸屬禾本科米草屬，是典型高度耐鹽的泌鹽鹽生植物。它起源于美洲大西洋沿岸和墨西哥灣，適宜生活于潮間帶，同時(shí)具有很好的耐淹、抗風(fēng)浪能力。它體內(nèi)也存在著一類(lèi)Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，以此來(lái)減輕Na+毒害。因此，互花米草材料對(duì)于研究植物耐鹽機(jī)制是一個(gè)很好的選擇，但是目前我國(guó)關(guān)于互花米草作為耐鹽基因資源方面的研究并不多見(jiàn)。為了進(jìn)一步了解互花米草抗鹽性的分子機(jī)制，本研究以互花米草為材料，克隆得到了互花米草Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因[WTBX][STBX]SaNHX1[WTBZ][STBZ]，利用生物信息學(xué)軟件及網(wǎng)站對(duì)獲得的基因核苷酸序列及編碼的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析，利用Qiagene Rotor Gene Q熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀對(duì)互花米草在NaCl及ABA不同處理時(shí)間條件下表達(dá)量的變化情況進(jìn)行檢測(cè)，為的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

互花米草種子來(lái)源于山東萊州海濱，放置于4 ℃保存。取出保存的種子播種于耶土 ∶[KG-*3]黑土=1 ∶[KG-*3]1 的培養(yǎng)基質(zhì)中，于25 ℃、光照16 h、黑暗8 h的溫室條件下進(jìn)行培養(yǎng)，2周后選取長(zhǎng)勢(shì)一致的植株移栽到小方盆中繼續(xù)培養(yǎng)至4～5葉齡。用于基因克隆的取材：用 600 mmol/L NaCL溶液澆灌幼苗 48 h；用于定量表達(dá)分析的取材：分別用600 mmol/L NaCl溶液和 100 μmol/L ABA溶液對(duì)幼苗進(jìn)行澆灌和噴灑，處理時(shí)間為0（對(duì)照）、3、6、12、24、48 h，每個(gè)處理重復(fù)3次。所有取材均經(jīng)液氮速凍后于-80 ℃保存。

大腸桿菌DH5α為實(shí)驗(yàn)室保存；pMD18-T載體、Taq DNA聚合酶、T4 DNA Ligase、dNTP Mix、DNA限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自TaKaRa公司；BIOZOL RNA Kit購(gòu)于BIOFLUX公司；Reverse Transcriptase試劑盒購(gòu)于Promega公司；Kanamycin Sulfate購(gòu)于Sigma公司；試驗(yàn)中所用其他試劑大多為國(guó)產(chǎn)分析純，部分試劑是參照文獻(xiàn)[13]自行配制的，所有引物的合成均由北京華大六合基因公司合成。

1.2試驗(yàn)方法

反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性 10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s；40個(gè)循環(huán)），并分析試驗(yàn)結(jié)果。

1.3數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Origin 8.0進(jìn)行處理，利用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，差異顯著性水平α=0.05。

2結(jié)果與分析

2.1互花米草的克隆及序列分析

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室互花米草轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果及Blast比對(duì)分析設(shè)計(jì)特異引物，分別進(jìn)行5′RACE及3′RACE（圖1），根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)拼接獲得[WTBX][STBX]SaNHX1[WTBZ][STBZ]基因全長(zhǎng)序列信息（圖2）。

基因全長(zhǎng)序列為2 277 bp，開(kāi)放閱讀框（ORF）為1 623 bp，編碼540個(gè)氨基酸殘基（圖2）。ExPASy 在線程序預(yù)測(cè)其編碼的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為 59.4 ku，等電點(diǎn)為8.89。經(jīng)TMHMM在線程序分析得SaNHX1蛋白是一個(gè)典型的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，預(yù)測(cè)其含有11個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（圖3），這一結(jié)果與之前的報(bào)道[4，14]是一致的。將克隆到的基因序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其與蘆葦、玉米、水稻等的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NHX親緣關(guān)系相近，相似性依次為94%、92%、91%。取高度相似（相似度>70%）的部分同源序列，使用Clustal X軟件進(jìn)行同源序列比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NHX1 蛋白序列具有高度保守區(qū)，且在 SaNHX1 蛋白上含有NHX抑制劑氨氯吡嗪脒結(jié)合位點(diǎn) [15]及糖基化位點(diǎn)（圖4）。從構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖5）上可以看到NHX主要分為兩大類(lèi)，一類(lèi)是定位于液泡膜上的蛋白，如AtNHX1、AtNHX2等；另一類(lèi)是定位于質(zhì)膜上的蛋白，如AtNHX5、AtNHX6，其中SaNHX1蛋白歸屬于液泡膜蛋白。同時(shí)定位到液泡膜上的蛋白又分為單子葉與雙子葉兩類(lèi)，這說(shuō)明單子葉植物和雙子葉植物的NHX在進(jìn)化上存在差異[16]，其中SaNHX1蛋白與單子葉植物的NHX蛋白親緣關(guān)系較近。[FL）]

3結(jié)論與討論

隨著土壤鹽漬化的加重，Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)于植物抵抗外界鹽漬環(huán)境具有非常重要的意義。本試驗(yàn)從鹽生植物互花米草中克隆得到了編碼液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因，對(duì)其編碼的蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，SaNHX1具有典型的跨膜結(jié)構(gòu)域，且跨膜區(qū)數(shù)目與之前的報(bào)道一致，同時(shí)該蛋白上還存在NHX抑制劑氨氯吡嗪脒結(jié)合位點(diǎn)及糖基化位點(diǎn)，這些都是NHX的重要特性。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，SaNHX1屬于液泡膜型NHX，而且與單子葉植物聚為一類(lèi)，這表明單子葉植物與雙子葉植物NHX在進(jìn)化上可能存在著一為進(jìn)一步探討互花米草的耐鹽機(jī)制，本研究利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀對(duì)互花米草在NaCl 及ABA不同脅迫時(shí)間條件下，其[WTBX][STBX]SaNHX1[WTBZ][STBZ]表達(dá)量進(jìn)行分析。研究結(jié)果顯示，無(wú)論是在鹽脅迫下，還是在ABA脅迫下，[WTBX][STBX]SaNHX1[WTBZ][STBZ]的表達(dá)量都發(fā)生了定的差異。

[CM（24]很大的變化，這說(shuō)明在這2種脅迫下

目前，隨著土壤鹽漬化問(wèn)題地日益加重，依靠分子生物學(xué)手段來(lái)克隆相關(guān)耐鹽基因[17-18]，并將其轉(zhuǎn)移到非抗鹽的作物中，以培育出耐鹽的轉(zhuǎn)基因新品種顯得尤為重要，這不僅可以在一定程度上開(kāi)發(fā)利用鹽堿土地，而且對(duì)于提高農(nóng)作物的產(chǎn)量具有非常重要的意義。目前關(guān)于[WTBX][STBX]SaNHX1[WTBZ][STBZ]的過(guò)量表達(dá)試驗(yàn)正在進(jìn)行中。

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