白藜蘆醇對(duì)高脂脅迫團(tuán)頭魴抗氧化能力、非特異免疫機(jī)能和抗病力的影響

閆亞楠 夏斯蕾 田紅艷 徐 超 賈二騰 劉文斌 張定東

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院, 江蘇省水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南京 210095)

白藜蘆醇對(duì)高脂脅迫團(tuán)頭魴抗氧化能力、非特異免疫機(jī)能和抗病力的影響

閆亞楠 夏斯蕾 田紅艷 徐 超 賈二騰 劉文斌 張定東

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院, 江蘇省水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南京 210095)

為探討白藜蘆醇(RSV)對(duì)高脂脅迫團(tuán)頭魴特定生長(zhǎng)率、抗氧化能力、非特異免疫機(jī)能和抗病力的影響,試驗(yàn)設(shè)計(jì)5組飼料: 正常脂組(脂肪水平5%)、高脂組(脂肪水平11%)以及在高脂組中分別添加0.04%、0.36%、1.08% RSV。養(yǎng)殖試驗(yàn)持續(xù)10周, 在采樣結(jié)束后, 進(jìn)行嗜水氣單胞菌攻毒試驗(yàn), 記錄攻毒后96h的成活率。結(jié)果表明: 團(tuán)頭魴的特定生長(zhǎng)率和日均采食量在添加1.08% RSV組出現(xiàn)最小值, 并顯著低于其他各組, 且團(tuán)頭魴的飼料效率表現(xiàn)出相似趨勢(shì)。長(zhǎng)期高脂飼喂可導(dǎo)致團(tuán)頭魴血漿GSH含量顯著下降, 血漿MDA和NO含量顯著升高, 形成氧化應(yīng)激。而長(zhǎng)期氧化應(yīng)激狀態(tài), 可使團(tuán)頭魴血漿溶菌酶活性和補(bǔ)體C3含量顯著降低, 肝臟中HSP70和HSP90應(yīng)激調(diào)控基因表達(dá)上調(diào), TNF-α炎癥反應(yīng)基因表達(dá)也上調(diào)。添加0.04% RSV組顯著降低了血漿中SOD活性; 添加0.36%和1.08% RSV組顯著降低血漿MDA和NO含量, 顯著抑制了血漿SOD和CAT活性,且添加1.08% RSV組顯著增加了魚體血漿GSH含量。添加0.04%、0.36%和1.08%RSV組均顯著提高了團(tuán)頭魴血漿補(bǔ)體C3含量和溶菌酶活性, 顯著下調(diào)了高脂脅迫團(tuán)頭魴肝臟中HSP70、HSP90與TNF-α mRNA的表達(dá)量。嗜水氣單胞菌攻毒后團(tuán)頭魴的成活率顯著受到RSV的影響, 并且在1.08% RSV添加組成活率最大。綜上結(jié)果表明, 團(tuán)頭魴攝食高脂日糧之后, 機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài), 導(dǎo)致魚體非特異免疫力和抗病力低下。而添加適宜劑量的RSV能夠改善機(jī)體這種氧化應(yīng)激的狀態(tài), 提高魚體的非特異免疫力和抗病力, 其中以1.08%的添加量最優(yōu)。

白藜蘆醇; 高脂脅迫; 抗氧化; 非特異性免疫; 團(tuán)頭魴

白藜蘆醇(Resveratrol, RSV), 是一種含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類的多酚化合物, 分子式C14H12O3,結(jié)構(gòu)為3,4,5-三羥基二苯乙烯(trans-3,4,5-Tri-hydroxystilbene), 廣泛存在于花生、葡萄、桑葚等種子植物中[1]。近年來, 國(guó)內(nèi)外的學(xué)者對(duì)其藥理作用進(jìn)行研究, 發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有抗氧化、抗菌消炎、抗白血病、降脂和提高機(jī)體免疫力等功能。大量動(dòng)物體內(nèi)和體外試驗(yàn)的研究都發(fā)現(xiàn), RSV可以通過上調(diào)沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Sirtuin1, SIRT1)的酶活性, 抑制SREBP下游基因的表達(dá), 調(diào)節(jié)機(jī)體糖脂代謝, 并且RSV還能調(diào)節(jié)AMP依賴的蛋白激酶[Adenosine 5'-monophosphate (AMP)-activated protein kinase, AMPK]代謝調(diào)控因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá), 進(jìn)而調(diào)控動(dòng)物體內(nèi)的物質(zhì)和能量代謝, 從而達(dá)到預(yù)防和治療一些代謝性疾病的作用[2，3]。

脂肪肝是由遺傳-環(huán)境-代謝應(yīng)激相關(guān)因素導(dǎo)致的以肝細(xì)胞脂肪變性為主的一種代謝性疾病, 臨床上有酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝(NAFLD)之分, 目前研究較多的是NAFLD, 其發(fā)生與胰島素抵抗(IR)密切相關(guān), 因此糾正代謝紊亂對(duì)該病的治療有重要作用[4]。而隨著高密度水產(chǎn)養(yǎng)殖的發(fā)展, 飼料中脂肪含量過高、過度投喂、蛋能比失調(diào)等營(yíng)養(yǎng)素原因造成養(yǎng)殖魚類營(yíng)養(yǎng)性脂肪肝問題越來越突出。而肝臟作為魚類重要的代謝器官, 其損傷或病變將導(dǎo)致機(jī)體代謝機(jī)能紊亂和抗病力降低, 極易造成繼發(fā)傳染性疾病的暴發(fā)和肝膽綜合征的肆虐,嚴(yán)重威脅著集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展[5]。

團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala), 俗稱武昌魚, 是我國(guó)養(yǎng)殖的主要經(jīng)濟(jì)魚類之一, 生產(chǎn)中面臨嚴(yán)峻的脂肪肝問題。Lu等[6]研究表明, 長(zhǎng)期攝食高脂日糧能夠誘導(dǎo)團(tuán)頭魴產(chǎn)生肥胖和IR, 患上脂肪肝,可以為研究魚類脂肪肝的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)防和治療機(jī)制提供較理想的動(dòng)物模型。基于此, 本研究擬在團(tuán)頭魴高脂日糧中添加RSV, 通過測(cè)定團(tuán)頭魴抗氧化能力、非特異免疫機(jī)能和抗病力, 評(píng)估RSV作為添加劑, 應(yīng)用于緩解高脂協(xié)迫以及預(yù)防和治療魚類脂肪肝的潛在作用, 以期為今后生產(chǎn)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和飼料配方

試驗(yàn)飼料配方見表 1, 設(shè)計(jì)兩個(gè)對(duì)照組, 即正常脂組(Normal-fat diet, NFD; 脂肪水平5%)和高脂組(High-fat diet, HFD; 脂肪水平11%), 參考RSV在小鼠和大鼠上的研究[2,3], 本試驗(yàn)在高脂日糧中以0.04%、0.36%、1.08%的梯度添加白藜蘆醇。白藜蘆醇(HPLC純度＞98%)購(gòu)自湖北巨勝科技有限公司。根據(jù)飼料配方將各個(gè)原料粉碎、稱重、充分混合均勻后, 加適量水, 使用小型飼料顆粒機(jī)制成粒徑2 mm水穩(wěn)性良好的沉性顆粒料, 于通風(fēng)處晾干后置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 養(yǎng)殖試驗(yàn)

養(yǎng)殖試驗(yàn)在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)浦口基地戶外網(wǎng)箱進(jìn)行, 試驗(yàn)塘規(guī)格: 100 m×50 m (長(zhǎng)×寬), 水深平均1.7 m。試驗(yàn)幼魚購(gòu)自江蘇廣陵長(zhǎng)江系家魚原種場(chǎng)。馴化一周后, 選取規(guī)格整齊體格健壯的幼魚[初重: (28±0.10) g]320尾, 隨機(jī)分配到20個(gè)網(wǎng)箱(規(guī)格: 1.0 m×1.0 m×1.0 m)中, 每個(gè)網(wǎng)箱16尾, 投喂5組飼料, 每組設(shè)4個(gè)重復(fù)。戶外養(yǎng)殖期間, 每天定時(shí)投餌3次(7:30, 12:00和16:30), 飽食投喂, 養(yǎng)殖期為10周。試驗(yàn)期間定期檢測(cè)水質(zhì): 水溫23—31℃, DO＞5.0 mg/L, pH 7.0—7.5。

表 1 試驗(yàn)飼料配方與營(yíng)養(yǎng)水平Tab. 1 Formulation and proximate composition of the experimental diets

1.3 樣品采集及分析

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后, 禁食24h以排空腸道內(nèi)容物。使用MS-222(濃度100 mg/L; Sigma, 美國(guó))麻醉,依次清點(diǎn)尾數(shù)并分箱稱重, 計(jì)算其特定生長(zhǎng)率。每網(wǎng)箱隨機(jī)取4尾魚在冰袋上進(jìn)行尾靜脈采血和肝臟樣本采集。血液采集后放入抗凝管(肝素鈉處理),于3000 g和4℃下離心10min, 吸取上清液標(biāo)記分裝后存入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩８闻K采集后用4℃預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈, 然后用濾紙吸干, 放入1 mL凍存管中用液氮速凍后置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 飼料常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分分析

水分測(cè)定使用烘箱105℃烘至恒重, 粗蛋白使用瑞士Foss公司生產(chǎn)的半自動(dòng)凱氏定氮儀, 粗灰分采取馬弗爐中550℃充分灼燒6h, 粗脂肪采用索氏抽提裝置進(jìn)行測(cè)定7h, 能量采用通用熱彈能儀測(cè)定。

1.5 血漿免疫指標(biāo)測(cè)定

血漿溶菌酶活性, 使用濁度比色法測(cè)定[7]; 血漿補(bǔ)體C3采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定; 總蛋白采用雙縮脲法測(cè)定; 血漿中白蛋白含量采用微量酶標(biāo)儀法;血漿酸性磷酸酶(Acid phosphatase, ACP)含量采用磷酸苯二鈉法測(cè)定。以上試劑盒均購(gòu)自南京建成生物科技有限公司。

血漿超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)采用氮藍(lán)四唑光化還原法測(cè)定, 過氧化氫化酶(Catalase, CAT)采用用H2O2還原法測(cè)定, 丙二醛(Malondialdehyde, MDA)采用硫代巴比妥比色法測(cè)定, 谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-PX)和谷胱甘肽還原酶(Glutathione reductase, GSH)采用酶偶聯(lián)連續(xù)監(jiān)測(cè)法。以上試劑盒均購(gòu)自南京建成生物科技有限公司。

1.6 嗜水氣單胞菌攻毒試驗(yàn)

本試驗(yàn)使用的嗜水氣單胞菌菌種(WJ2011BJ44)由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心提供。在無菌條件下, 取-80℃保存菌種劃線接種在瓊脂固體平板培養(yǎng)基中, 恒溫箱28℃培養(yǎng)20h后, 挑取單獨(dú)菌落接種于5 mL肉湯液體培養(yǎng)基中, 28℃搖床恒溫過夜培養(yǎng)(180 r/min)。使用肉湯液體培養(yǎng)基將菌液按10倍系列濃度稀釋(1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010CFU/mL), 通過在團(tuán)頭魴腹部注射不同濃度梯度的嗜水氣單胞菌攻毒預(yù)試驗(yàn), 從而獲得該菌的半致死濃度為1×107CFU/mL。

在采樣結(jié)束后, 將室外網(wǎng)箱內(nèi)每組剩余的實(shí)驗(yàn)魚挪到室內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)內(nèi), 適應(yīng)3d后, 每組魚腹腔注射稀釋好的菌液(1×107CFU/mL), 注射劑量為每100 g魚注射1 mL。注射結(jié)束后, 觀察統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)魚攻毒后6h、12h、24h、48h、72h、96h時(shí)的存活尾數(shù)。

1.7 肝臟熱休克蛋白70(HSP70)、熱休克蛋白90(HSP90)及腫瘤壞死因子α (TNF-α)基因表達(dá)的測(cè)定

肝臟總RNA提取: 取大約50—100 mg的團(tuán)頭魴肝臟樣品, 放入含有1 mL RNA-iso Plus (Takara公司)的離心管中, 之后按照RNA-iso Plus試劑盒中說明書操作, 提取總RNA。最終獲得的樣品總RNA其OD260/OD280在1.8—2.0。

反轉(zhuǎn)錄: 按照Takara Prime Script?RT reageat Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作, 所得cDNA保存于-20℃冰箱備用。

定量PCR: (1) 引物設(shè)計(jì): 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列, 使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)內(nèi)參基因β-actin[8,9]、熱休克蛋白70(HSP70)、熱休克蛋白90(HSP90)、腫瘤壞死因子α (TNF-α), 引物序列參見表 2, 引物由上海Invitrogen公司合成。 (2)實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng): 根據(jù)SYBR?Premix Ex Taq TM II (TaKaRa公司)試劑盒說明書進(jìn)行加樣上機(jī), 結(jié)果采用2-??Ct方法分析。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 兩個(gè)對(duì)照組采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)法分析, 高脂組和RSV添加組則采用單因素方差(One-Way ANOVA)中Duncan's多重比較法分析, 結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤來表示。使用Graph Pad Prism 5和Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行圖形繪制。

表 2 定量PCR引物序列Tab. 2 The primers used in quantitative real-time PCR

2 結(jié)果

2.1 RSV對(duì)投喂高脂日糧團(tuán)頭魴特定生長(zhǎng)率(SGR)的影響

如圖 1所示, NFD和HFD兩組的飼養(yǎng)期間成活率、SGR、日均采食量和飼料效率(FCR)均無顯著差異; 高脂組和高脂添加RSV組飼養(yǎng)期間成活率無顯著差異, 而1.08%RSV組的SGR和日均采食量均顯著低于其他各組, 且該組團(tuán)頭魴的飼料效率也低于其他各組。

2.2 RSV對(duì)投喂高脂日糧團(tuán)頭魴血漿抗氧化指標(biāo)的影響

由圖 2可以得出, 與正常脂日糧相比, 投喂高脂日糧之后團(tuán)頭魴血漿SOD、CAT、MDA和NO顯著提高, 而血漿GSH顯著降低。添加0.36% RSV和1.08% RSV之后, 血漿CAT、MDA和NO與高脂組相比顯著降低; 而血漿GSH僅在RSV1.08%添加水平顯著升高, 在0.04% RSV和0.36%RSV添加水平,血漿GSH雖然有所升高, 但無顯著差異; 添加0.04%—1.08%水平的RSV, 與高脂組相比, 可顯著降低血漿SOD。

2.3 RSV對(duì)投喂高脂日糧團(tuán)頭魴血漿免疫指標(biāo)的影響

從圖 3可以得出, 與正常脂日糧相比, 投喂高脂日糧之后, 團(tuán)頭魴血漿白蛋白有所降低, 但無顯著差異, 但血漿補(bǔ)體C3、總蛋白、球蛋白、溶菌酶以及ACP都顯著降低。在添加RSV之后, 與高脂組相比, 不同添加量的RSV均顯著提高了血漿補(bǔ)體C3和溶菌酶含量; 血漿總蛋白、白蛋白、球蛋白以及ACP僅在HFD+0.04% RSV組顯著升高, 而其他各組相比高脂組均無顯著差異。

2.4 RSV對(duì)投喂高脂日糧團(tuán)頭魴肝臟HSP70、HSP90及TNF-α mRNA表達(dá)量的影響

圖 1 RSV對(duì)投喂高脂日糧團(tuán)頭魴飼養(yǎng)期間成活率、SGR、日均采食量和飼料效率(FCR)的影響Fig. 1 Effects of RSV supplementation on survival rate, SGR, average daily feed intake and feed efficiency rate of blunt snout bream fed high-fat diets高脂組和高脂添加RSV組中,a,b,c字母不同表示差異顯著(P＜0.05); 正常脂與高脂組采用T-檢驗(yàn), *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001,nsP＞0.05; 下同; 飼養(yǎng)成活率=100×(實(shí)驗(yàn)?zāi)~數(shù)量/實(shí)驗(yàn)初魚數(shù)量), 特定生長(zhǎng)率=100×ln(W末重/W初重)/t (養(yǎng)殖天數(shù)), 日均采食量=總采食量/飼養(yǎng)天數(shù)(d), 飼料效率=增重(g)/攝食量(g)Among HFD and HFD+RSV groups, mean values with different letters were significantly different (P＜0.05); student's T-test analysis were used to explore the difference between NFD and HFD: *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001,nsP＞0.05; the same applies below. Feeding survival rate=100×(the number of survival fish after feeding/ the number of fish before feeding), Specific growth rate, SGR=100×ln(Wfinalweight/Winitialweight)/t, Average daily feed intake=total feed intake/t (d), Feed efficiency rate=weight (g)/food intake (g)

由圖 4可以得出, 團(tuán)頭魴肝臟HSP70、HSP90與TNF-α mRNA的表達(dá)量顯著受飼料中脂肪水平和RSV添加的影響。與正常脂日糧相比, 投喂高脂日糧之后團(tuán)頭魴肝臟HSP70、HSP90與TNF-α mRNA的表達(dá)量顯著升高。在添加RSV之后, 與高脂組相比, 團(tuán)頭魴肝臟HSP70、HSP90與TNF-α mRNA的表達(dá)量顯著下降。

圖 2 RSV對(duì)投喂高脂日糧團(tuán)頭魴血漿抗氧化指標(biāo)的影響Fig. 2 Effects of RSV supplementation on plasma antioxidant capacity of blunt snout bream fed high-fat diets

圖 3 RSV對(duì)投喂高脂日糧團(tuán)頭魴血漿免疫指標(biāo)的影響Fig. 3 Effects of RSV supplementation on innate immunity of blunt snout bream fed high-fat diets

2.5 攻毒試驗(yàn)累計(jì)死亡率

圖 5為團(tuán)頭魴攻毒后96h成活率, 試驗(yàn)結(jié)果表明: 飼料中脂肪水平可影響團(tuán)頭魴的成活率, 正常脂組48h和72h成活率顯著高于高脂組, 96h時(shí)則無顯著差異; 團(tuán)頭魴攻毒后的成活率又受RSV影響, RSV顯著提高了團(tuán)頭魴48h和72h的成活率, 并且96h時(shí)1.08% RSV添加組的成活率最高, 顯著高于高脂組。

圖 4 團(tuán)頭魴肝臟HSP70、HSP90與TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig. 4 Relative mRNA expression analysis of HSP70, HSP90 and TNF-α in the liver of blunt snout bream fed high-fat diets

圖 5 嗜水氣單胞菌攻毒后96h的存活率(%)Fig. 5 Survival rates (%) of blunt snout bream after 96h of Aeromonas hydrophila challenge成活率(%)=(攻毒試驗(yàn)結(jié)束存活魚數(shù)/攻毒試驗(yàn)開始魚總數(shù))× 100%Survival rate (%)=(the number of survival fish after infection/the number of fish before infection)×100%

3 討論

3.1 RSV對(duì)投喂高脂日糧團(tuán)頭魴生長(zhǎng)性能的影響

SGR是指生長(zhǎng)率與生長(zhǎng)天數(shù)的比值, 是衡量生長(zhǎng)狀況的一個(gè)常用指標(biāo), 和增重率趨勢(shì)相同, 但又比增重率更加形象具體的反映動(dòng)物的生長(zhǎng)狀況, SGR越小, 代表每天的體重增長(zhǎng)越慢[10]。 本試驗(yàn)中, 1.08% RSV添加組的SGR顯著低于其他各組, 表明1.08%劑量的RSV能夠調(diào)控高脂脅迫下的團(tuán)頭魴的體重, 這可能與RSV的降脂和攝食神經(jīng)調(diào)節(jié)[11]作用有關(guān)。 許多研究表明, RSV能夠減少脂肪在一些組織和器官中過度沉積, 而其對(duì)動(dòng)物體體重的調(diào)節(jié)受到RSV的劑量、試驗(yàn)的動(dòng)物種類和膳食結(jié)構(gòu)等多種因素的影響[12,13]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究也證實(shí)了添加較高劑量的RSV可導(dǎo)致團(tuán)頭魴體增重明顯下降, 其原因可能是: 一方面隨著RSV劑量的升高,肝臟脂肪和腹部脂肪含量呈下降趨勢(shì), 且肝臟脂肪含量在RSV添加量為1.08%時(shí)顯著低于高脂組; 另一方面魚體內(nèi)過多的RSV通過某種機(jī)制影響團(tuán)頭魴采食, 減少餌料攝入。在本試驗(yàn)中添加1.08%的RSV顯著影響團(tuán)頭魴的日均采食量, 并且該組的飼料效率也顯著降低, 這可能與RSV對(duì)物質(zhì)和能量代謝的調(diào)控作用有關(guān)[3]。上述因素導(dǎo)致了本試驗(yàn)中1.08% RSV添加組團(tuán)頭魴的SGR顯著低于其他各組。RSV能夠調(diào)節(jié)動(dòng)物體的糖脂代謝, 調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[13,14], 并能影響采食量。在嚙齒動(dòng)物上也有類似的研究結(jié)果, 并認(rèn)為RSV能夠通過血腦屏障, 減少動(dòng)物體的食物攝入[11,15]。因此, 在團(tuán)頭魴高脂日糧中添加RSV既能緩解高脂脅迫又不影響生長(zhǎng)性能的最低有效劑量, 仍需要我們進(jìn)一步的研究。

3.2 RSV對(duì)投喂高脂日糧團(tuán)頭魴抗氧化能力的影響

動(dòng)物機(jī)體在新陳代謝過程中, 活性氧自由基的產(chǎn)生和消除保持著動(dòng)態(tài)平衡[16]。而長(zhǎng)期投喂高脂日糧會(huì)造成魚類的組織及細(xì)胞的線粒體膜超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變, 導(dǎo)致線粒體膜通透性增大, 致使大量活性氧自由基(ROS)擴(kuò)散到細(xì)胞的各個(gè)角落, 引起機(jī)體脂類、蛋白質(zhì)、酶和DNA的氧化, 形成機(jī)體損傷[17]。而SOD可以催化活性氧(O2-)轉(zhuǎn)化為H2O2與O2, H2O2又可通過CAT和谷胱甘肽還原酶轉(zhuǎn)化為H2O, 從而保持了機(jī)體的氧化平衡, 減少了自由基對(duì)機(jī)體的傷害。MDA作為脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物,具有細(xì)胞毒性, 會(huì)引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合, 從而可以作為機(jī)體脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志。在本研究中, 高脂組血漿SOD和CAT活性均顯著高于正常脂組, 可是其血漿中MDA的含量很高,血漿GSH含量卻很低, 說明高脂組魚體ROS的產(chǎn)生量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于機(jī)體自身的清除能力。而在添加RSV之后, 各組血漿兩種抗氧化酶的活性都有所降低,血漿MDA的含量顯著降低, 血漿GSH含量顯著升高, 說明魚體ROS的產(chǎn)生量未超出機(jī)體清除能力。在段勝紅[18]有關(guān)RSV對(duì)大鼠非酒精性脂肪肝的保護(hù)作用的研究發(fā)現(xiàn)RSV顯著降低模型組大鼠肝組織MDA含量, 同時(shí)在高妍等[19]有關(guān)烏克蘭鱗鯉的研究中發(fā)現(xiàn)當(dāng)飼料中添加80—160 mg/kg RSV時(shí),烏克蘭鱗鯉血漿MDA含量顯著降低。以上研究與本試驗(yàn)結(jié)果一致, 說明RSV能夠提高動(dòng)物機(jī)體的抗氧化能力, 抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。有研究表明, NO與氧化性肝損傷相關(guān), 大量的NO則反而引起肝細(xì)胞損傷, 而適量的NO則對(duì)心血管起保護(hù)作用[20]。在本試驗(yàn)中, 高脂組血漿NO含量顯著高于正常脂組, 而添加RSV之后血漿NO含量顯著降低, 該現(xiàn)象也表明RSV可減緩高脂脅迫誘導(dǎo)的肝臟損傷。在大鼠的研究中也得到相似的結(jié)果[21], 說明RSV可能通過降低iNOS活性及升高cNOS活性從而糾正了機(jī)體NO代謝的紊亂。TNF-α不僅是NAFLD的一個(gè)易感因子, 而且也是介導(dǎo)肝損傷的主要細(xì)胞因子之一,同時(shí)TNF-α及其誘導(dǎo)產(chǎn)生的一些細(xì)胞因子, 又可引起游離脂肪酸的增多, 從而進(jìn)一步促進(jìn)NAFLD的發(fā)展[22,23]。在本試驗(yàn)中, 高脂組肝臟中TNF-α mRNA表達(dá)量顯著高于正常脂組, 表明高脂日糧可誘導(dǎo)團(tuán)頭魴肝臟炎癥反應(yīng), 而添加RSV之后, 各試驗(yàn)組中肝臟中TNF-α mRNA表達(dá)量均顯著低于高脂組, 說明RSV能夠減輕肝臟炎癥損傷。小鼠上也得到了類似的結(jié)果[24], 研究表明RSV在一定程度上能夠上調(diào)小鼠組織或細(xì)胞中SIRT1的表達(dá), 進(jìn)而調(diào)控炎癥因子及相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路, 從而抑制炎癥反應(yīng)[25,26]。

3.3 RSV對(duì)投喂高脂日糧團(tuán)頭魴免疫功能的影響

HSP70和HSP90均參與應(yīng)激條件下的免疫應(yīng)答反應(yīng), 其表達(dá)量在環(huán)境和生理的變化下都會(huì)隨之改變[27—28], 因此, HSP70和HSP90均是應(yīng)激反應(yīng)的重要指標(biāo)。TNF-α也參與動(dòng)物體內(nèi)的免疫反應(yīng), 在許多病理狀態(tài)下產(chǎn)生增多, 調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能。高脂組團(tuán)頭魴肝臟中HSP70、HSP90 和TNF-α mRNA表達(dá)量均顯著高于正常脂組, 表明試驗(yàn)團(tuán)頭魴已處于應(yīng)激狀態(tài)中。而應(yīng)激和免疫的關(guān)系密切相關(guān), 長(zhǎng)期的氧化應(yīng)激或其他類型的應(yīng)激反應(yīng)都可能會(huì)損害機(jī)體的免疫器官, 降低機(jī)體的免疫功能[29,30]。ACP是魚類體內(nèi)巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志性酶[31]。溶菌酶是魚類防護(hù)病原體入侵的重要非特異性免疫因子, 通過水解致病菌的黏多糖, 來達(dá)到抵抗外界細(xì)菌入侵的目的[32]。補(bǔ)體C3是血清中含量最高的補(bǔ)體成分, 參與機(jī)體抗微生物防御反應(yīng)以及免疫調(diào)節(jié),其水平是衡量動(dòng)物機(jī)體體液免疫的重要標(biāo)志[33]。血漿蛋白作為血漿的重要組成部分, 反映機(jī)體的健康狀況, 血漿蛋白的升高也與免疫力的增強(qiáng)有關(guān),而在所有的蛋白組成中球蛋白是重要的組成成分,在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[34]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示高脂組團(tuán)頭魴血漿ACP和溶菌酶活性以及補(bǔ)體C3、總蛋白和球蛋白含量均顯著低于正常脂組, 表明高脂組魚體受到氧化應(yīng)激, 導(dǎo)致其非特異性免疫力下降, 并伴有肝臟損傷[29]。然而, RSV添加組團(tuán)頭魴血漿補(bǔ)體C3含量和溶菌酶活性均顯著高于高脂組,表明RSV增強(qiáng)了高脂脅迫團(tuán)頭魴的免疫功能。同時(shí), 添加RSV之后團(tuán)頭魴血漿總蛋白、白蛋白、球蛋白含量及ACP活性均高于高脂組, 這再次說明RSV可提高團(tuán)頭魴的免疫力。類似的結(jié)果也發(fā)表在其他動(dòng)物上。在酒劑中添加RSV經(jīng)口灌胃, 能顯著增強(qiáng)小鼠細(xì)胞免疫、體液免疫和單核-巨噬細(xì)胞功能[35]; 在飼料中添加120 mg/kg的RSV可提高血鸚鵡溶菌酶活力[36]; 在日糧中添加0.1%至0.2% RSV有利于提高肉仔雞的免疫功能[37]。

3.4 RSV對(duì)投喂高脂日糧團(tuán)頭魴抗病能力的影響

本試驗(yàn)結(jié)果顯示, 添加適宜水平的RSV提高了團(tuán)頭魴嗜水氣單胞菌感染之后的成活率, 成活率最高值出現(xiàn)在1.08%RSV組, 在日糧中添加0.04%和0.36%的RSV也提高了高脂脅迫下團(tuán)頭魴的成活率。這與本試驗(yàn)抗氧化和非特異免疫指標(biāo)結(jié)果基本一致, 說明RSV通過提高高脂脅迫團(tuán)頭魴魚體的抗氧化能力和免疫力, 提高了抗病力。RSV能通過阻礙生物膜的形成來降低細(xì)菌的耐藥性、阻礙細(xì)菌的毒性因子發(fā)揮作用, 并能抑制創(chuàng)傷弧菌的黏附及RTX毒素的產(chǎn)生, 來達(dá)到保護(hù)宿主細(xì)胞免受細(xì)菌感染引起的毒害和感染的目的[38—42], 推測(cè)RSV本身對(duì)嗜水氣單胞菌生長(zhǎng)有抑制作用, 減弱該菌毒性。有文獻(xiàn)報(bào)道, RSV能通過Fiaf (快速誘導(dǎo)脂類因子)信號(hào)通路調(diào)節(jié)腸道菌群的組分, 改善小鼠高脂膳食引起的腸道菌群生態(tài)失調(diào)[38,43]。而腸道菌群調(diào)控下的腸黏膜系統(tǒng)調(diào)控動(dòng)物的免疫與健康, 腸道是機(jī)體最大的免疫器官[44]。因此, 我們推測(cè)RSV通過調(diào)節(jié)團(tuán)頭魴腸道菌群, 增強(qiáng)團(tuán)頭魴腸道免疫力, 從而提高團(tuán)頭魴的抗病力, 該機(jī)理有待我們后續(xù)研究進(jìn)一步證明。

4 結(jié)論

綜上所述, 在高脂脅迫團(tuán)頭魴的日糧中添加1.08%的RSV時(shí)能夠調(diào)控團(tuán)頭魴的體重和日均攝食量, 能夠顯著提高團(tuán)頭魴的抗氧化能力, 并且能夠提高團(tuán)頭魴的非特異性免疫功能和抗病力。因此,在本試驗(yàn)中團(tuán)頭魴高脂日糧中RSV的適宜添加水平是1.08%。

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EFFECTS OF RESVERATROL SUPPLEMENTATION ON GROWTH PERFORMANCE, IMMUNITY, ANTIOXIDANT CAPABILITY AND DISEASE RESISTANCE OF BLUNT SNOUT BREAM FED HIGH-FAT DIET

YAN Ya-Nan, XIA Si-Lei, TIAN Hong-Yan, XU Chao, JIA Er-Teng, LIU Wen-Bin and ZHANG Ding-Dong
(Jiangsu Key Laboratory of Aquatic Animal Nutrition, College of Animal Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

This study was conducted to investigate the effects of Resveratrol (RSV) supplementation on specific growth rate (SGR), nonspecific immunity function, antioxidant capability and disease resistance of blunt snout bream fed highfat diet. This experiment was designed with five kinds of diets: a normal fat diet (NFD, 5% fat), a HFD (11% fat), and a HFD supplemented with 0.04%, 0.36%, and 1.08% RSV, respectively. At the end of 10-week feeding trial, fish were challenged by Aeromonas hydrophila at the concentration of 1×107CFU/mL, and the survival rate was recorded for the next 96h. The results showed that HFD supplemented with 1.08% RSV significantly reduced the SGR and average daily feed intake of blunt snout bream when compared to the other groups, the similar trend found in feed efficiency rate of blunt snout bream. In comparison with NFD, HFD significantly increased the levels of plasma MDA and NO, and decreased the level of plasma GSH in blunt snout bream. QRT-PCR results demonstrated that long-term HFD consumption induced the up-regulation of TNF-α, HSP70 and HSP90, which means HFD potently weaken antioxidant defenses in blunt snout bream. HFD supplemented with RSV at 0.04% significantly suppressed the activities of the plasma SOD. And yet, it not only significantly reduced the contents of plasma MDA and NO, but also significantly inhibited the activities of plasma SOD and CAT when HFD supplemented with 0.36% and 1.08% RSV. Besides, the plasma GSH content increased significantly when the fish fed HFD supplemented with 1.08% RSV. HFD supplemented with RSV at 0.04%, 0.36% and 1.08% all significantly increased plasma complement 3 content, enhanced lysozyme activities, and down-regulated the mRNA expressions of hepatic HSP70, HSP90 and TNF-α in blunt snout bream. After A. hydrophila challenge, the significant highest survival rate was observed in fish fed 1.08% RSV supplemented diet. In summary, when blunt snout bream was fed with high-fat diet for long time, the body was in a state of oxidative stress. And, the appropriate dose of RSV added could ameliorate the state of oxidative stress in the body, then the optimal dose of resveratrol was 1.08%.

Resveratrol; High-fat diet; Antioxidant ability; Non-specific immunity; Blunt snout bream

S965.1

A

1000-3207(2017)01-0155-10

10.7541/2017.20

2016-08-15;

2016-11-04

國(guó)家大宗淡水魚產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資金(CARS-49-20)資助 [Supported by the National Technology System for Conventional Freshwater Fish Industries (CARS-46-20)]

閆亞楠(1990—), 女, 河南商丘人; 碩士研究生; 主要研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料。E-mail: 2014105073@njau.edu.cn

張定東(1975—), 男, 博士, 副教授; 主要從事水產(chǎn)動(dòng)物生理與營(yíng)養(yǎng)、水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)的研究。E-mail: zdd_7597@njau.edu.cn