吐溫40作為谷氨酸發(fā)酵促進(jìn)劑的機(jī)制研究進(jìn)展

賴木蘭，萬(wàn)方，朱薔云，陳雪嵐

(江西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌，330022)

吐溫40作為谷氨酸發(fā)酵促進(jìn)劑的機(jī)制研究進(jìn)展

賴木蘭，萬(wàn)方，朱薔云，陳雪嵐*

(江西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌，330022)

吐溫(Tween)是一種安全的非離子型表面活性劑，被廣泛應(yīng)用于乳化劑、油類物質(zhì)的增溶劑和微生物發(fā)酵促進(jìn)劑等。其中Tween 40被發(fā)現(xiàn)可以明顯提高谷氨酸棒桿菌等棒桿菌屬產(chǎn)谷氨酸的量，因此引起了相關(guān)科研工作者對(duì)其作用機(jī)制的關(guān)注。文中主要對(duì)Tween 40誘發(fā)谷氨酸棒桿菌高產(chǎn)谷氨酸的機(jī)制進(jìn)行綜述，并分析研究過(guò)程中亟待解決的問(wèn)題及發(fā)展趨勢(shì)。

吐溫40；谷氨酸；谷氨酸棒桿菌；作用機(jī)制

吐溫(Tween)化學(xué)名為聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯，簡(jiǎn)稱聚山梨酯，為兩親性物質(zhì)，其分子中同時(shí)含有親水基團(tuán)(聚氧乙烯基)和親油基團(tuán)(脂肪酸鏈和烷基)；在水溶液中難解離，屬于非離子型表面活性劑[1]。由于Tween的特殊性質(zhì)，使其作為乳化劑[2-4]、增溶劑[5-6]以及濕潤(rùn)劑[7]等在石油、化工、塑料、機(jī)械、涂料、皮革、化妝品等工業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。

根據(jù)脂肪酸鏈的不同，Tween主要分為Tween 20(聚環(huán)氧乙烷山梨糖醇單月桂酸酯)、Tween 40(聚氧乙烯山梨醇酐棕櫚酸酯)、Tween 60(聚氧乙烯山梨糖醇酐單硬脂酸酯)和Tween 80(聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯)，其中Tween 40和Tween 80作為一種能顯著提高目的產(chǎn)物產(chǎn)量的發(fā)酵促進(jìn)劑常用于發(fā)酵工程中[8]。如LUO等[9]利用EscherichiacoliW3110-ZDrr重組菌進(jìn)行發(fā)酵，當(dāng)培養(yǎng)基存在Tween 80時(shí)，色氨酸產(chǎn)量提高到原來(lái)的兩倍，達(dá)25.5 g/L；龍輝等[10]在谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)發(fā)酵生產(chǎn)L-異亮氨酸對(duì)數(shù)期中后期(18h)添加Tween 80，單位細(xì)胞產(chǎn)酸的能力提高13.3%；在抗生素發(fā)酵中，朱鳳等[11]在螺旋霉素發(fā)酵過(guò)程中加入Tween 80，其螺旋霉素產(chǎn)量提高11.9%，其發(fā)酵效價(jià)達(dá)28 176 U/mL；曹艷[12]在谷氨酸發(fā)酵過(guò)程中添加Tween 40，使得谷氨酸產(chǎn)量達(dá)到80 g/L。由此可見(jiàn)Tween給利用微生物生產(chǎn)的發(fā)酵工業(yè)帶來(lái)了巨大的效益。

C.glutamicum作為一類遺傳背景清楚且不產(chǎn)毒素的菌株，被廣泛應(yīng)用于各種氨基酸的生產(chǎn)并相應(yīng)地作為試驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行了各種生理生化機(jī)制的研究。其中，Tween 40促進(jìn)該菌株產(chǎn)谷氨酸的機(jī)制也得到逐步的剖析。從目前的文獻(xiàn)報(bào)道分析，對(duì)其作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)主要經(jīng)歷了滲透模型、谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)改變機(jī)制以及谷氨酸合成網(wǎng)絡(luò)的酶活調(diào)控機(jī)制3種。本文主要介紹Tween 40促進(jìn)C.glutamicum分泌谷氨酸的3種機(jī)制，并結(jié)合本課題組的研究結(jié)果分析亟待解決的問(wèn)題及發(fā)展趨勢(shì)。

1 滲透模型

滲透模型認(rèn)為在外界條件的誘導(dǎo)下，通過(guò)改變細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的通透性，使谷氨酸能夠通過(guò)滲透作用分泌到胞外，同時(shí)胞內(nèi)谷氨酸的含量降低，解除了反饋抑制，增加了谷氨酸合成。細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的改變包括細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和細(xì)胞膜磷酯成分的改變，下面分別就Tween 40對(duì)這兩種結(jié)構(gòu)的改變與促進(jìn)谷氨酸高產(chǎn)的相關(guān)性進(jìn)行介紹。

1.1 細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的改變

C.glutamicum細(xì)胞壁主要是由糖肽化合物聚合而成的多層網(wǎng)狀大分子結(jié)構(gòu)所組成，其細(xì)胞壁外層另有一層分支菌酸層，它通過(guò)阿拉伯半乳聚糖以共價(jià)鍵的形式與肽聚糖層緊緊相依，成為了細(xì)胞的第一道滲透屏障。分支菌酸層含有大量的糖脂，如海藻糖分支菌酸脂等。GEBHARDT等[13]構(gòu)建海藻糖缺失菌株LP△treS△otsA△treY，使分支菌酸的合成受阻，發(fā)現(xiàn)其賴氨酸、谷氨酸產(chǎn)量增加。由此說(shuō)明分支菌酸層在氨基酸分泌中具有一定的滲透屏障的作用。HASHIMOTO等[14]通過(guò)氣象色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析發(fā)現(xiàn)在Tween 40誘導(dǎo)的條件下，C.glutamicum產(chǎn)谷氨酸的量得到提高，而其分支菌酸的含量降低到原來(lái)的60%。因此認(rèn)為Tween 40可以通過(guò)影響分支菌酸層的合成，從而影響細(xì)胞壁的滲透性，使谷氨酸的分泌量增加。

1.2 細(xì)胞膜磷酯成分的改變

細(xì)胞膜是谷氨酸分泌到胞外所必須通過(guò)的一道屏障，細(xì)胞膜的完整性對(duì)谷氨酸的分泌有顯著影響。脂類是細(xì)胞膜重要組成成分，其由dtsR編碼的乙酰-CoA羧化酶以及其他一系列酶催化反應(yīng)形成，脂類成分的改變會(huì)影響細(xì)胞的通透性。KUMAR等[15]在C.glutamicum發(fā)酵時(shí)添加Tween 40，并監(jiān)測(cè)DtsR蛋白的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著Tween 40添加量的增加，DtsR表達(dá)量呈明顯的下降趨勢(shì)，谷氨酸的產(chǎn)量卻有顯著的提高。究其原因，發(fā)現(xiàn)DtsR合成受阻會(huì)改變細(xì)胞膜磷脂成分，從而提高了細(xì)胞膜分泌谷氨酸的閥值。為了探究Tween的作用靶點(diǎn)是細(xì)胞膜，NAMPOOTHIRI等[16]分別過(guò)表達(dá)與磷脂合成有關(guān)的基因，包括acp、fadD15、cma、cls、pgsA、cdsA和plsC等，發(fā)現(xiàn)重組菌的磷脂的組成成分發(fā)生了改變，且無(wú)Tween誘導(dǎo)時(shí)，谷氨酸的產(chǎn)量由原始菌的0.2 mmol/L分別變?yōu)?.8、0.3、0.3、7.1、3.6、3.8和0 mmol/L，這結(jié)果顯示谷氨酸的分泌受到細(xì)胞膜磷脂組成成分的強(qiáng)烈影響。當(dāng)原始菌受1.5 mg/mL Tween 60或Tween 40誘導(dǎo)時(shí)，谷氨酸的產(chǎn)量可以達(dá)到91 mmol/L；當(dāng)上述重組菌分別受1.5 mg/mL的Tween誘導(dǎo)時(shí)，過(guò)表達(dá)acp、fadD15或cdsA的重組菌的谷氨酸的積累反而降低了，且acp過(guò)表達(dá)使得谷氨酸產(chǎn)量顯著降低，降為了24 mmol/L；而過(guò)表達(dá)cma、cls或plsC的重組菌積累谷氨酸的能力增加，谷氨酸產(chǎn)量均超出100 mmol/L，其中過(guò)表達(dá)plsC的重組菌谷氨酸產(chǎn)量達(dá)到109 mmol/L。這些現(xiàn)象作者認(rèn)為Tween依賴的谷氨酸分泌可能是通過(guò)激活或失活與磷脂合成相關(guān)的基因，從而改變細(xì)胞膜磷酯組成，進(jìn)而影響谷氨酸的產(chǎn)量。

2 谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)改變機(jī)制

滲透模型使人們普遍認(rèn)為谷基酸的分泌即僅僅是跨膜擴(kuò)散機(jī)制，但此模型無(wú)法解釋在胞外大量積累谷氨酸而胞內(nèi)谷氨酸濃度不受滲透作用的影響。在C.glutamicum中，賴氨酸、異亮氨酸以及蘇氨酸等都是由相應(yīng)的輸送載體所介導(dǎo)輸送至細(xì)胞外。由此科研工作者推斷，細(xì)胞膜上可能存在一種轉(zhuǎn)運(yùn)谷氨酸的蛋白質(zhì)。NAKAYAMA等[17]對(duì)C.glutamicumΔNCgl1221菌株給予誘導(dǎo)劑(Tween 40，青霉素等)處理時(shí)，發(fā)現(xiàn)其谷氨酸分泌受阻，胞內(nèi)谷氨酸積累，這結(jié)果實(shí)際上否定了滲透模型；若過(guò)表達(dá)NCgl1221，則胞外谷氨酸積累幅度大量提高；作者將C.glutamicum的NCgl1221進(jìn)行序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)它與E.coil的一種機(jī)械敏感性通道膜蛋白YggB具有很高的同源性。HASHIMOTO等[18-19]通過(guò)電生理學(xué)分析確定NCgl1221是一種機(jī)械敏感性通道膜蛋白，并確認(rèn)其能特異性地轉(zhuǎn)運(yùn)谷氨酸。YAO等[20]將NCgl1221與綠色熒光蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，確定了NCgl1221蛋白位于細(xì)胞膜上且NCgl1221是一種C端在胞質(zhì)內(nèi)的四次跨膜蛋白質(zhì)；當(dāng)誘導(dǎo)劑Tween 40的存在時(shí)，脂肪酸的合成會(huì)因?yàn)槭艿揭种贫淖兡さ闹|(zhì)組成，這種改變使膜的張力及滲透性發(fā)生改變的同時(shí)也使機(jī)械敏感性離子通道膜蛋白——NCgl1221谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的空間構(gòu)像也發(fā)生了相應(yīng)的改變，而這種改變使之運(yùn)輸谷氨酸到細(xì)胞外的能力大幅提高，從而提高谷氨酸的產(chǎn)量。這個(gè)機(jī)制能解釋滲透模型所不能回答的問(wèn)題。雖然以上研究否定了滲透模型，但與NAMPOOTHIRI等研究結(jié)果不沖突，是其研究結(jié)果的深入，正是細(xì)胞膜磷脂成分的改變等而導(dǎo)致NCgl1221谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的空間構(gòu)像發(fā)生變化，從而促進(jìn)了谷氨酸的分泌。

圖1 谷氨酸棒桿菌中谷氨酸的生物合成途徑Fig.1 The biosynthetic pathways of glutamate in Corynebacterium glutamicum

3 谷氨酸合成網(wǎng)絡(luò)的酶活調(diào)控機(jī)制

目前報(bào)道Tween 40影響谷氨酸合成網(wǎng)絡(luò)的酶活調(diào)控包括α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合物(α-oxoglutarate dehydrogenase complex，ODHC)的酶活調(diào)控和丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PC)的酶活調(diào)控。

3.1 α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合物(ODHC)的酶活調(diào)控

谷氨酸的生物合成網(wǎng)絡(luò)主要包括糖酵解途徑(glycolytic pathway，EMP)，三羧酸循環(huán)途徑(tricarboxylic acid cycle，TCA)，乙醛酸循環(huán)途徑以及回補(bǔ)途徑等，如圖1所示。α-酮戊二酸作為谷氨酸的前體物質(zhì)是三羧酸循環(huán)途徑的中間代謝產(chǎn)物，其可通過(guò)ODHC催化形成琥珀酰-CoA，也可在谷氨酸脫氫酶的催化下形成谷氨酸。因此，ODHC的表達(dá)如受到抑制，則代謝流將集中流向谷氨酸合成途徑[21-22]。

在谷氨酸棒狀桿菌中，ODHC是由3種亞基酶組成的復(fù)合物，這3種亞基酶分別是odhA編碼的α-酮戊二酸脫氫酶，sucB編碼的二氫硫辛酰胺琥珀酰轉(zhuǎn)移酶以及l(fā)pd編碼二氫硫辛酰胺脫氫酶。KIM等[23]發(fā)現(xiàn)在Tween 40存在的情況下，ODHC的活性下降，谷氨酸的產(chǎn)量會(huì)得到提高?？梢?jiàn)Tween 40能降低ODHC的活性從而提高谷氨酸產(chǎn)量。

ODHC的活性受OdhI磷酸化的影響，其主要機(jī)制是未磷酸化的OdhI可以通過(guò)其FDH區(qū)域與ODHC中的OdhA亞基結(jié)合，從而抑制ODHC的活性；蛋白激酶G(PknG)可以對(duì)OdhI的第14位蘇氨酸進(jìn)行磷酸化，磷酸化的OdhI可以從OdhA上脫離下來(lái)，從而解除對(duì)ODHC的抑制[24]。SCHULTZ等[25]發(fā)現(xiàn)除PknG外，還有3種磷酸激酶可以磷酸化OdhI，即PknA、PknB、PknL，但PknB起主要作用；作者同時(shí)發(fā)現(xiàn)由ppp編碼的磷酸蛋白磷酸酶Ppp也可將磷酸化的OdhI去磷酸化。綜上所述，ODHC的活性受到OdhI的磷酸化狀態(tài)的調(diào)控。但是Tween 40是如何降低ODHC的活性？是否也對(duì)OdhI磷酸化水平有影響？為了探索Tween 40等誘導(dǎo)劑抑制ODHC酶活性的具體機(jī)制，Kim等[26]通過(guò)Western Blotting定量分析在Tween 40存在的條件下，谷氨酸大量生產(chǎn)時(shí)其胞內(nèi)OdhI的磷酸化水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在Tween 40誘導(dǎo)的條件下，磷酸化和未磷酸化的OdhI均有所提高，但未磷酸化的OdhI明顯高于磷酸化的OdhI。由此可見(jiàn)，Tween 40促進(jìn)谷氨酸高產(chǎn)的可能原因是其可以增加未磷酸化的OdhI的含量從而抑制ODHC的活性，最終增加了谷氨酸的產(chǎn)量。

3.2 丙酮酸羧化酶的酶活調(diào)控

丙酮酸羧化酶(PC)是三羧酸循環(huán)回補(bǔ)途徑中的關(guān)鍵合成酶，其催化丙酮酸合成草酰乙酸。此回補(bǔ)途徑還可以通過(guò)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenopyuvate carboxylase, PEPC)催化磷酸烯醇式丙酮酸合成草酰乙酸，如圖1所示。在TCA循環(huán)中，草酰乙酸和乙酰-CoA合成為α-酮戊二酸的前體物質(zhì)檸檬酸，而α-酮戊二酸是谷氨酸的前體物質(zhì)，因此草酸乙酰合成的增加則能提高谷氨酸的合成。PETERS等[27]通過(guò)過(guò)表達(dá)編碼PC基因已證實(shí)可以提高谷氨酸的積累。SHIRAI等[28]建立葡萄糖13C標(biāo)記的代謝通量分析，通過(guò)氣相色譜質(zhì)譜法實(shí)時(shí)測(cè)定胞內(nèi)蛋白質(zhì)氨基酸13C豐度，分析在Tween 40的誘導(dǎo)下C.glutamicum在谷氨酸生產(chǎn)過(guò)程中兩條回補(bǔ)途徑所扮演的角色。結(jié)果表明在生長(zhǎng)期，由PC催化丙酮酸合成草酰乙酸的途徑代謝通量幾乎為零，由PEPC催化的磷酸烯醇式丙酮酸合成草酰乙酸的途徑代謝通量為38%；在谷氨酸生產(chǎn)期，PC催化的途徑代謝通量明顯增加達(dá)到56%，而由PEPC催化的途徑代謝通量則無(wú)明顯變化。這與HASEGAWA等[29]在Tween 40誘導(dǎo)條件下，對(duì)丙酮酸支點(diǎn)各酶活進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)PC的酶活逐步提高至在15 h達(dá)到最高酶活，提高了1.4倍；而PEPC酶活無(wú)明顯變化這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合。由此可見(jiàn)，在Tween 40誘導(dǎo)谷氨酸生產(chǎn)過(guò)程中，PC扮演著至關(guān)重要的角色，其酶活提高則此回補(bǔ)途徑代謝通量也明顯增加，促使草酰乙酸增加的同時(shí)也為谷氨酸的合成提供更多的前體物質(zhì)——α-酮戊二酸。以上研究結(jié)果表明，在菌株不同生長(zhǎng)階段，Tween 40可能特異地調(diào)控PC的酶活，在谷氨酸生產(chǎn)期，Tween 40能夠激活PC酶，最終誘導(dǎo)谷氨酸的高產(chǎn)。以上機(jī)制的揭示進(jìn)一步補(bǔ)充了Tween 40能提高C.glutamicum合成谷氨酸的本質(zhì)。

4 問(wèn)題與展望

Tween 40作為發(fā)酵促進(jìn)劑，對(duì)其引發(fā)C.glutamicum高產(chǎn)谷氨酸的機(jī)制是經(jīng)歷了逐步剖析的過(guò)程。從在Tween 40作用下細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的變化與谷氨酸高產(chǎn)的關(guān)聯(lián)、谷氨酸運(yùn)輸?shù)鞍椎陌l(fā)現(xiàn)及在Tween 40作用下其空間構(gòu)像發(fā)生的變化與谷氨酸高產(chǎn)的關(guān)聯(lián)、在Tween 40作用下谷氨酸合成途徑中多種酶活性的變化與谷氨酸高產(chǎn)的關(guān)聯(lián)等多方面的研究，獲得了主要包括滲透模型(雖然滲透模型已被否認(rèn)，但細(xì)胞膜磷脂成分的改變卻與谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)的改變相關(guān))、谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)的改變和谷氨酸合成網(wǎng)絡(luò)酶活的調(diào)控這些機(jī)制，也正是由于這些Tween 40引起的改變共同促進(jìn)了谷氨酸的高產(chǎn)。同時(shí)，本課題組在敲除鈍齒棒桿菌(與谷氨酸棒桿菌同源性達(dá)到99%)谷氨酸運(yùn)輸?shù)鞍譔Cgl1221、研究Tween 40增加精氨酸(谷氨酸是精氨酸的前體物質(zhì))產(chǎn)量的機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的現(xiàn)象，即磷酸戊糖途徑的基因zwf的轉(zhuǎn)錄水平大幅提高且相應(yīng)胞內(nèi)的NADPH積累增加[30]。因此，從以上Tween 40對(duì)微生物發(fā)酵的影響機(jī)制分析，認(rèn)為依然存在需要進(jìn)一步闡述的問(wèn)題，包括(1)Tween 40與合成磷脂相關(guān)基因的作用靶點(diǎn)；(2)Tween 40如何降低ODHC的酶活，與OdhI磷酸化程度的關(guān)系，其磷酸化程度又是如何調(diào)控的；(3)Tween 40如何調(diào)控PC酶和PEPC酶活性；(4)Tween 40如何提高磷酸戊糖途徑的表達(dá)，從而提高NADPH的供應(yīng)等。相信這些問(wèn)題可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄組、蛋白組學(xué)等手段進(jìn)一步揭示，更全面系統(tǒng)地了解Tween 40誘發(fā)谷氨酸棒桿菌等棒桿菌屬高產(chǎn)谷氨酸本質(zhì)，從而充分利用使其在微生物發(fā)酵工業(yè)領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。

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Researches on the mechanism of Tween 40-triggered glutamate overproduction

LAI Mu-lan, WAN Fang, ZHU Qiang-yun, CHEN Xue-lan*

(School of Life Science, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022,China)

Tween, as a kind of safe nonionic surfactant, has been widely used in emulgator, solubilizer of oily substances, accelerant of microbial fermentation, etc. Among them, Tween 40 was found to significantly improve the yield ofCorynebacteriumglutamicum-producing glutamate, which caused the related researchers to focus on its mechanism. In this article, the research advances on Tween 40-triggered glutamate overproduction byCorynebacteriumglutamicumwere mainly discussed, and problems demanding prompt solution in research process and development trend were analyzed.

Tween 40; glutamate;Corynebacyeriumglutamicum; mechanism

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201701046

學(xué)士(陳雪嵐教授為通訊作者,E-mail: xuelanchen162@163.com)。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31360219)；江西省自然科學(xué)基金(2015BAB)

2016-06-05，改回日期：2016-07-25