益脾養(yǎng)肝方對(duì)大鼠肝癌癌前病變組織PCNA、GGT蛋白表達(dá)的影響 *

劉亞珠，李京濤△，魏海梁，閆曙光，何 超，陳曉婷， 常占杰

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(咸陽(yáng)712000),2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)( 咸陽(yáng)712000)

益脾養(yǎng)肝方對(duì)大鼠肝癌癌前病變組織PCNA、GGT蛋白表達(dá)的影響*

劉亞珠1，李京濤1△，魏海梁1，閆曙光2，何 超2，陳曉婷2， 常占杰1

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(咸陽(yáng)712000),2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)( 咸陽(yáng)712000)

目的：研究益脾養(yǎng)肝方對(duì)二乙基亞硝胺(DEN)誘導(dǎo)的大鼠肝癌癌前病變病理組織和PCNA、GGT蛋白表達(dá)的影響。方法：將大鼠隨機(jī)分成空白組、模型組、益脾養(yǎng)肝方大、小劑量組。采用腹腔注射DEN誘發(fā)大鼠肝癌前病變模型，給藥16周后處死。觀察大鼠一般情況和體重，肝功變化，肝組織HE染色以及免疫組化檢測(cè)PCNA和GGT蛋白表達(dá)。結(jié)果：與模型組比較，養(yǎng)脾益肝方大、小劑量組的ALT、 AST、GGT和ALP均明顯降低，其中YPYGF大劑量組效果最佳(P<0.01)。病理組織結(jié)果顯示，益脾養(yǎng)肝方可以改善大鼠肝癌癌前病變的病理形態(tài)，能顯著抑制肝組織PCNA和GGT的蛋白表達(dá)。結(jié)論：益脾養(yǎng)肝方對(duì)于大鼠肝癌癌前病變具有抑制作用，其作用可能與抗細(xì)胞異常增殖和抗細(xì)胞氧化損傷有關(guān)。

肝癌前病變是具有細(xì)胞不典型性和分化異常的增生性病變，介于正常組織和癌組織之間，如能阻止肝癌癌前病變的惡性進(jìn)展，就有可能阻止或延緩肝癌的發(fā)生發(fā)展。益脾養(yǎng)肝方是陜西省名中醫(yī)常占杰教授治療肝硬化進(jìn)展的驗(yàn)方[1-2]，長(zhǎng)期臨床隨訪提示該方可能具有抗肝癌癌前病變的作用。研究表明PCNA和GGT蛋白的表達(dá)與肝癌細(xì)胞增殖和肝細(xì)胞氧化損傷有密切聯(lián)系[3-4]。本實(shí)驗(yàn)采用二乙基亞硝胺(DEN)誘導(dǎo)大鼠肝癌癌前病變模型，觀察益脾養(yǎng)肝方對(duì)大鼠肝癌癌前病變組織病理和PCNA、GGT蛋白表達(dá)的影響，為益脾養(yǎng)肝方抗肝癌癌前病變提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1 藥品與主要試劑 DEN(0.95 g/ml)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，PCNA、GGT試劑盒購(gòu)買(mǎi)于陜西博達(dá)生物有限公司。DAB染色液、免疫組化染色試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

2 益脾養(yǎng)肝方的制備 益脾養(yǎng)肝方藥(黨參、白術(shù)、熟地、枸杞、姜黃、鱉甲、郁金、半枝蓮、白花蛇舌草)，均由陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科統(tǒng)一購(gòu)買(mǎi)和制備凍干粉，每克含生藥5 g，凍干粉密封保存于4℃冰箱內(nèi)備用，使用時(shí)100℃水溶解，配置為小劑量0.5 g/ml和大劑量1.0 g/ml的藥液。

3 動(dòng)物造模 清潔級(jí)wistar大鼠70只，雄性，體重(100～120)g，購(gòu)于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。大鼠肝癌癌前病變模型制備[5]：大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)，模型組和給藥組均以0.5 ml/100g的DEN腹腔注射，每周50 mg/kg(分2次給，即每84 h 1次)，連續(xù)給藥16周；對(duì)照組給予等量無(wú)菌蒸餾水。

4 分組以及給藥方法 將70只大鼠隨機(jī)分為4組：空白組10只、模型組和益脾養(yǎng)肝方(YPYGF)大、小劑量組各20只/組。造模當(dāng)日起，對(duì)YPYGF大、小組大鼠灌胃給予相應(yīng)劑量藥物：YPYGF小劑量(0.5g/ml)按10 ml/kg大鼠體重灌胃，1次/d。YPYGF大劑量(1.0 g/ml)按10ml/kg大鼠體重灌胃，1次/d?？瞻捉M、模型組大鼠同步灌胃等量無(wú)菌蒸餾水，直至16周末停藥。

5 動(dòng)物處理 于第16周處死大鼠。采用10%水合氯醛(0.3 ml/l00g)腹腔注射給藥麻醉，待大鼠完全麻醉時(shí)，剪去腹毛，剖開(kāi)腹腔，分離整個(gè)肝臟，拍照留取肝臟大體形態(tài)圖。分別切取肝右葉、肝左葉、尾葉適當(dāng)大小肝組織，于10%甲醛溶液常規(guī)固定。

6 肝組織HE染色和 PCNA及GGT蛋白表達(dá) 肝組織常規(guī)HE染色。肝組織于10%中性甲醛液固定24 h，梯度酒精脫水，石蠟包埋，4 μm切片，脫蠟脫水，3%H2O2室溫孵育5～10 min，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min×2，5%～10%山羊血清封閉，室溫孵育10 min，一抗4℃過(guò)2夜，二抗37℃孵30～60 min，滴加適量SABC，37℃孵育10～30 min，顯色劑顯色3～15 min，沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片后顯微鏡下觀察。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，組間比較采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 一般情況和體重 空白組大鼠背毛光澤順滑，活動(dòng)和進(jìn)食水均正常，無(wú)死亡。模型組、YPYGF大、小劑量組從實(shí)驗(yàn)第8周后，大鼠進(jìn)食水量均減少，模型組死亡2只，YPYGF大、小劑量組各死亡1只。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組大鼠體重有顯著差異，體重順序依次為空白組>YPYGF大劑量組>YPYGF小劑量組>模型組。

2 肝功能檢測(cè)結(jié)果 益脾養(yǎng)肝方對(duì)肝癌癌前病變大鼠的肝功影響結(jié)果見(jiàn)表1。與空白組比較，各組大鼠的 ALT、 AST、GGT和ALP均明顯升高。與模型組比較，YPYGF大、小劑量組的ALT、 AST、GGT和ALP均明顯降低，其中YPYGF大劑量組效果最佳。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，YPYGF大劑量組與模型組比較均有顯著性差異(P<0.01)，YPYGF小劑量組與模型組比較，ALT、 AST和GGT有顯著性差異(P<0.05)，而ALP無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表1 各組大鼠第16周肝功比較(U/L)

注： 與模型組比較，*P>0.05；與模型組比較，△P<0.05；與模型組比較，#P<0.01

3 組織病理結(jié)果 益脾養(yǎng)肝方對(duì)大鼠肝癌癌前病變病理組織的影響見(jiàn)圖1?？瞻捉M肝小葉結(jié)構(gòu)、肝索排列以及肝細(xì)胞核均正常，其余各組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，增生細(xì)胞有異型性表現(xiàn)，可見(jiàn)雙核細(xì)胞，肝小葉匯管區(qū)有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和膽管增生等。與模型組比較，YPYGF兩組的增生細(xì)胞異型性顯著變小，雙核細(xì)胞減少，并且炎癥情況較輕，而YPYGF大劑量組效果更佳。

圖1 各組大鼠病理組織結(jié)果比較(HE×100)

4 PCNA和GGT蛋白表達(dá)結(jié)果 益脾養(yǎng)肝方對(duì)大鼠肝癌癌前病變PCNA和GGT蛋白表達(dá)的影響見(jiàn)圖2。由圖可見(jiàn)模型組肝組織PCNA和GGT的表達(dá)均明顯增強(qiáng)，主要見(jiàn)于癌前病變組織和周?chē)M織。YPYGF大、小劑量組均能顯著抑制PCNA和GGT的表達(dá)，大劑量組效果最佳。

圖2 PCNA和GGT蛋白表達(dá)結(jié)果(HE×100)

討 論

肝炎-肝硬化-肝癌，是肝病演進(jìn)的“三部曲”，從肝硬化到肝癌會(huì)經(jīng)歷一個(gè)較長(zhǎng)的肝癌癌前病變階段[6]。2015年《原發(fā)性肝癌規(guī)范化病理診療指南》[7]指出：肝細(xì)胞癌癌前病變的病理類(lèi)型可分為肝細(xì)胞異型增生、異型增生灶、低度異型增生結(jié)節(jié)(LGDN)、高度異型增生結(jié)節(jié)(HGDN)、肝細(xì)胞腺瘤(HCA)。中醫(yī)“治未病”理論強(qiáng)調(diào)：未病先防，既病防變，如能篩選有效中藥復(fù)方或單體延緩、阻斷、甚至逆轉(zhuǎn)肝癌癌前病變的惡性演進(jìn)，從而阻止肝癌的發(fā)生。

益脾養(yǎng)肝方由黨參、白術(shù)、熟地、枸杞、姜黃、鱉甲、郁金、半枝蓮、白花蛇舌草九味藥物組成，具有益脾養(yǎng)肝、行氣活血，解毒散結(jié)的功效。本研究顯示益脾養(yǎng)肝方能夠改善大鼠肝癌癌前病變的病理形態(tài)，益脾養(yǎng)肝方兩組的增生細(xì)胞異型性顯著變小，雙核細(xì)胞減少，并且炎癥情況較輕，而益脾養(yǎng)肝方大劑量組效果更佳，說(shuō)明益脾養(yǎng)肝方對(duì)肝癌癌前病具有抑制作用。

肝癌癌前病變的形成和惡性進(jìn)展與細(xì)胞異常增殖、細(xì)胞氧化損傷密切相關(guān)[8-10]。PCNA的合成、表達(dá)與細(xì)胞增殖顯著相關(guān)，在多種腫瘤的發(fā)生過(guò)程中均有著重要意義。PCNA陽(yáng)性表達(dá)與肝細(xì)胞的異常增殖密切相關(guān)，PCNA 陽(yáng)性細(xì)胞更具有癌變傾向。GGT的表達(dá)與肝細(xì)胞的氧化損傷明顯相關(guān)，在癌變過(guò)程中GGT陽(yáng)性顆粒的出現(xiàn)程度與肝細(xì)胞癌變過(guò)程呈正相關(guān)，GGT為肝癌發(fā)生的早期標(biāo)志酶。本研究顯示大鼠肝癌癌前病變肝組織PCNA和GGT均大量表達(dá)，PCNA主要在肝癌癌前病變組織和周?chē)M織，而益脾養(yǎng)肝方能顯著抑制PCNA和GGT的蛋白表達(dá)，大劑量組效果優(yōu)于小劑量組。

綜上所述，益脾養(yǎng)肝方對(duì)于大鼠肝癌癌前病變具有抑制作用，其作用可能通過(guò)抑制PCNA和GGT蛋白的表達(dá)，達(dá)到抗細(xì)胞異常增殖和抗細(xì)胞氧化損傷的作用。該研究結(jié)果為益脾養(yǎng)肝方抗肝癌前病變作用機(jī)制的深入探討和進(jìn)一步研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] 李京濤, 郭 師, 席 奇,等. 益脾養(yǎng)肝方聯(lián)合肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)治療原發(fā)性肝癌的療效觀察[J]. 陜西中醫(yī), 2015,36(8):944-945.

[2] 南 然, 宋春榮. 常占杰教授用益脾養(yǎng)肝法治肝病經(jīng)驗(yàn)談[J]. 光明中醫(yī), 2012, 27(12):2408-2409.

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[7] 中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)肝癌專(zhuān)業(yè)委員會(huì), 中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)肝癌學(xué)組, 中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)病理專(zhuān)業(yè)委員會(huì), 等. 原發(fā)性肝癌規(guī)范化病理診斷指南(2015年版) [J]. 中華肝膽外科雜志, 2015,21(3):145-151.

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(收稿：2016-09-11)

Compound Yipi Yanggan decoction exerts inhibits liver precancerous lesion by mediating expression of PCNA and GGT proteins

Liu Yazhu,Li Jingtao,Wei Hailiang ,et al.

The Hospital Affiliated to Shaanxi University of Chinese Medicine( Xianyang 712000)

Objective:To study the effects of Yipi Yanggan decoction on the amelioration of pathological morphology and expression of PCNA and GGT proteins in diethylnitrosamine (DEN) induced rat liver precancerous lesion. Methods : Rats were randomly divided into the normal control, the DEN group, and two Yipi Yanggan decoction (0.5, and 1.0 g/ml) treatment groups. The hepatic precancerous lesion model of male Wistar rats induced by intraperitoneal injection of DEN was used. After 16 weeks of administration, rats were sacrificed. To observate general conditions, body weight and liver function of rats. Liver tissues were measured by HE staining, and the expression of PCNA and GGT proteins of liver tissues were measured by immunohistochemical detection. Results : Compared with model group, ALT, AST, GGT and ALP of two Yipi Yanggan decoction groups were significantly lower, which the best was high-dose group of Yipi Yanggan decoction (P<0.01). Conclusion: Yipi Yanggan decoction can improve the rat liver precancerous pathological morphology, and can remarkably inhibit the cell abnormal proliferation and cellular oxidative damage.

Liver neoplasms/traditional Chinese medicine therapy @ Liver precancerous lesion @ Yipi Yanggan decoction Animal experimentation Rsts @PCNA

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81603612) 陜西省科技廳課題(2012SF2-11，2014K11-02-04-06, 2016SF-234)

肝腫瘤/中醫(yī)藥療法 @肝癌前病變 @益脾養(yǎng)肝方 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 大鼠 @PCNA

R735.7

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2017.02.058

陜西省中醫(yī)藥管理局課題(15-JC009)

北京醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)勵(lì)基金會(huì)課題(YJHYXKYJJ-276)

△通訊作者