新牧1號苜蓿兩種抗逆相關(guān)啟動子的功能分析

晁朝霞，任燕萍，錢進(jìn)，姚正培，許磊，張樺*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.江蘇金色農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，江蘇 鹽城 224100；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

新牧1號苜蓿兩種抗逆相關(guān)啟動子的功能分析

晁朝霞1，任燕萍1，錢進(jìn)2，姚正培1，許磊3，張樺1*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.江蘇金色農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，江蘇 鹽城 224100；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

前期已成功克隆了新牧1號苜蓿MvP5CS與MvNHX1基因和二者的啟動子序列。在此基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)分別構(gòu)建了含有Mvp5cs和Mvnhx1啟動子的調(diào)控GUS報(bào)告基因的植物表達(dá)載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法得到了含有Mvnhx1與Mvp5cs啟動子的轉(zhuǎn)基因煙草植株。PCR檢測證明了兩種啟動子已穩(wěn)定的整合到煙草基因組中；GUS組織染色證明兩種啟動子均具有啟動基因表達(dá)的功能。通過測量GUS活性來探究兩種不同的誘導(dǎo)型啟動子在4種非生物脅迫下(干旱、鹽、脫落酸、赤霉素)的表達(dá)活性。結(jié)果表明，1)Mvnhx1與Mvp5cs啟動子均響應(yīng)鹽、脫落酸、赤霉素、干旱脅迫，與CaMV35S啟動子相比，差異顯著。2)Mvnhx1啟動子在鹽脅迫、脫落酸脅迫下所起誘導(dǎo)作用要優(yōu)于Mvp5cs啟動子。在48 h 100 mmol/L、150 mmol/L NaCl脅迫處理時(shí)，Mvnhx1啟動子GUS活性分別是Mvp5cs啟動子的2.03和3.23倍，差異顯著。在25 μmol/L、 50 μmol/L ABA處理下，Mvnhx1啟動子的活性整體高于另兩種啟動子，差異顯著。3)Mvp5cs啟動子在干旱脅迫、赤霉素脅迫所起誘導(dǎo)作用優(yōu)于Mvnhx1啟動子。干旱脅迫時(shí)，Mvp5cs啟動子的GUS活性在36 h是同時(shí)間Mvnhx1啟動子的2.22倍。70 μmol/L GA處理時(shí)，Mvp5cs啟動子在36 h達(dá)到最大值，是同時(shí)間段Mvnhx1啟動子的1.79倍。

啟動子；Mvnhx1；Mvp5cs；遺傳轉(zhuǎn)化；非生物脅迫；GUS活性

啟動子是一段位于結(jié)構(gòu)基因5′端上游區(qū)的DNA序列，能夠活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準(zhǔn)確的相結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性[1]，在基因表達(dá)調(diào)控過程中起著重要作用。啟動子按照作用方式和功能可以分為3種，組成型啟動子、組織特異性啟動子和誘導(dǎo)型啟動子。組成型啟動子在所有組織中都有表達(dá)，不具有時(shí)空特異性，表達(dá)量相對恒定，如目前在植物基因工程中廣泛使用的如花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子[2-3]、玉米泛素基因Ubiquitin啟動子、根癌農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因NOS啟動子等。組織特異性啟動子可以使外源基因只在特殊的組織部位啟動基因表達(dá)，已報(bào)道的組織特異型啟動子有水稻(Oryzasativa)綠色組織特異表達(dá)基因的啟動子PDX1[4]、大豆(Glycinemax)中的維管組織特異表達(dá)的蔗糖結(jié)合蛋白啟動子GmSBP2[5]，但應(yīng)用不夠廣泛。誘導(dǎo)型啟動子在特定誘導(dǎo)的情況下啟動基因表達(dá)，當(dāng)誘導(dǎo)因素不存在時(shí)就不再開啟基因表達(dá)，不會持續(xù)表達(dá)基因，這樣可以減少物質(zhì)和能量浪費(fèi)，有效調(diào)控下游基因在特定的條件下表達(dá)。已報(bào)道的誘導(dǎo)型啟動子有擬南芥(Arabidopsisthaliana)rd29A啟動子[6]，毛白楊(Populustomentosa)TIR啟動子[7]等。組成型啟動子容易造成大量代謝產(chǎn)物的積累，增加植物的負(fù)荷，阻礙了植物的正常生長[8-11]。因此，在植物基因工程中，尋找表達(dá)特異性更加明顯的組織特異型啟動子和誘導(dǎo)型啟動子來替代組成型啟動子顯得尤為重要。

Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白合成基因(Na+/H+antiporter gene，NHX1)在高鹽環(huán)境下，將Na+逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡膜中，減少細(xì)胞質(zhì)中Na+濃度。研究表明，將擬南芥AtNHX1基因轉(zhuǎn)入玉米(Zeamays)[12]、花生(Arachishypogaea)[13]中可以有效緩解鹽脅迫的損傷，提高作物的耐鹽性。Δ′—二氫吡咯—5—羧酸合成酶(pyrroline-5-carboxylate synthase，P5CS)基因是植物脯氨酸生物合成中的限速酶，制約著植物體內(nèi)脯氨酸的積累速度。脯氨酸能維持穩(wěn)定滲透壓平衡，阻止水分散失。研究表明，野生大豆P5CS基因可以調(diào)控內(nèi)源脯氨酸合成，在干旱和鹽環(huán)境等逆境下大量表達(dá)，顯著提高植株的抗逆能力[14]。大量游離脯氨酸的積聚為植株從逆境狀態(tài)恢復(fù)至常態(tài)提供了能量和還原劑，有效地提高了植物的抗逆能力[15-16]。

本實(shí)驗(yàn)室前期已成功從新牧1號苜蓿中克隆了MvP5CS基因(GenBank登錄號為EU371644)和MvNHX1基因(GenBank登錄號為EU375310)[17]及二者的啟動子序列。其中MvP5CS基因啟動子Mvp5cs1429 bp，GenBank登錄號：KU963587；MvNHX1基因啟動子Mvnhx1 1655 bp，GenBank登錄號：KU987821。已證明這2個(gè)基因在干旱和鹽的脅迫下表達(dá)上調(diào)，經(jīng)轉(zhuǎn)基因功能分析驗(yàn)證為抗旱耐鹽相關(guān)基因[18]，但未研究這2個(gè)基因啟動子的功能特點(diǎn)。本試驗(yàn)構(gòu)建Mvp5cs啟動子和Mvnhx1啟動子調(diào)控GUS基因表達(dá)的植物表達(dá)載體；利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，于2015年7月份左右獲得轉(zhuǎn)基因煙草(Nicotianatabacum)；在2016年1月份時(shí)通過干旱和不同濃度梯度的鹽脅迫、脫落酸脅迫、赤霉素脅迫分析GUS基因的表達(dá)情況，研究這兩種啟動子在不同脅迫處理下的調(diào)控外源基因表達(dá)特征，從而明確兩種啟動子的作用特點(diǎn)，對研究植物抗逆分子調(diào)控機(jī)制具有重要的理論價(jià)值，在抗逆植物基因工程研究中有較好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料和主要試劑

根瘤農(nóng)桿菌EHA105菌株、植物表達(dá)載體pCAMBIA1304、本賽姆氏煙草由本實(shí)驗(yàn)室留存。TaKaRa T4 Ligase，限制性內(nèi)切酶購自寶信生物科技有限公司；凝膠回收試劑盒，pEASY-T1 simple Cloning Kit，DH5α感受態(tài)，DNA Marker購自北京全式金生物公司。質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技有限公司。抗生素購自Biosharp。引物由華大基因合成。其他試劑為國產(chǎn)分析純。

圖1 植物表達(dá)載體構(gòu)建 Fig.1 Plant expression vector schematicA：pCAMBIA1304質(zhì)粒結(jié)構(gòu)簡圖 pCAMBIA1304 plasmid structure diagram; B：pMvp5cs-1304質(zhì)粒簡圖 pMvp5cs-1304 plasmid structure diagram; C：pMvnhx1-1304質(zhì)粒簡圖 pMvnhx1-1304 plasmid structure diagram; SacⅠ、NcoⅠ：酶切位點(diǎn) Restriction enzyme cutting site; LB：左邊界 T-border (L); RB：右邊界 T-border (R).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1Mvp5cs與Mvnhx1啟動子表達(dá)載體的構(gòu)建 分別回收經(jīng)過NcoⅠ和SacⅠ雙酶切的Mvp5cs與Mvnhx1啟動子片段，同時(shí)回收NcoⅠ和SacⅠ雙酶切切除35S啟動子的pCAMBIA-1304載體片段。T4 Ligase連接啟動子片段與載體片段，分別獲得與GUS基因的融合表達(dá)載體pMvp5cs-1304和pMvnhx1-1304(圖1)。

1.2.2 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草 采取凍融法將pMvp5cs-1304表達(dá)載體質(zhì)粒、pMvnhx1-1304表達(dá)載體質(zhì)粒、pCAMBIA1304表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105菌株中。

分別將3種重組質(zhì)粒農(nóng)桿菌在發(fā)根農(nóng)桿菌培養(yǎng)基(Agrobacterium rhizogene medium，YEB)液體培養(yǎng)基[卡那霉素(kanamycin，Kan)50 mg/mL，利福平(rifampicin, Rif)50 mg/mL]中培養(yǎng)至OD600=0.6，4000 r/min離心10 min，棄上清，MS(MS culture medium)液體培養(yǎng)基中懸浮至OD600=0.6。選取幼嫩的非轉(zhuǎn)基因煙草葉片去除邊緣及葉脈部分，剪成0.5 cm×0.5 cm大小，置于MS菌液中浸染10 min，用濾紙吸干菌液，葉片背面朝上，平放于共生培養(yǎng)基[MS固體培養(yǎng)基+萘乙酸(1-naphthylacetic acid，NAA)0.1 mg/L+6-芐氨基嘌呤(6-benzylaminopurine，6-BA) 1 mg/L)]上；暗培養(yǎng)2 d后移至篩選培養(yǎng)基[MS固體培養(yǎng)基+NAA 0.1 mg/L+6-BA 1 mg/L+Kan 100 mg/L+頭孢霉素(cefotaxime sodium，Cef)500 mg/L]中；4周左右將煙草不定芽移至生根培養(yǎng)基(1/2MS固體培養(yǎng)基+NAA 0.1 mg/L+Cef 500 mg/L)中[19-21]；待生根完全后煉苗，移栽到滅菌土中。

1.2.3 煙草再生植株的分子鑒定 采用CTAB一步法提取煙草再生植株與野生煙草基因組DNA，通過HPT引物(F：5′-CGATTTGTGTACGCCCGACAGTC-3′，R：5′-CGATGTAGGAGGGCGTGGATATG-3′)、GUS基因引物(F：5′-AGACTATCCCGCCGGGAATGG-3′，R：5′-GCGGTGATACATATCCAGCCA-3′)與啟動子引物(pMvp5csF:5′-ATCGAGCTCCCTTTCAAGAGAAGCCCATT-3′，R：5′-TCACCATGGGCAAGAGACAGTTCACGTA-3′；pMvnx1 F:5′-TACGACGGCAGTGCAGCTTGCATGC-3′，R：5′-TGGCTCGAGCTTAGCATTAGTCAGT-3′)共3對引物進(jìn)行PCR檢測。

1.2.4 GUS組織染色 分別剪取3種鑒定成功的轉(zhuǎn)基因煙草葉片、根、莖、花，丙酮固定30 min，沖洗后加入GUS染色液，抽真空處理后37 ℃染色12 h，75%乙醇脫色至煙草組織底色為無色，拍照[22]。

1.2.5 脅迫處理和GUS活性的檢測 分別剪取3種鑒定成功的轉(zhuǎn)基因煙草葉片進(jìn)行以下濃度的脅迫處理，1)NaCl：50，100，150 mmol/L，剪取3種植株葉片分別浸入以上鹽溶液中；2)脫落酸：10，25，50 μmol/L，均勻噴灑在離體煙草葉片上；3)赤霉素：30，50，70 μmol/L；均勻噴灑在離體煙草葉片上；4)干旱脅迫：剪取離體煙草葉片置于室溫干燥處進(jìn)行脅迫。以上4種脅迫分別處理0，4，12，24，36，48 h，其中NaCl脅迫和干旱脅迫增加復(fù)水1和4 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別同時(shí)采取3種轉(zhuǎn)基因煙草葉片，進(jìn)行3個(gè)重復(fù)檢測。GUS熒光檢測具體方法參見Jefferson[22]，檢測到的熒光值除以總蛋白濃度得到GUS的相對活性[23]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行P<0.05水平上的方差分析，并用Excel 2013作圖。

2 結(jié)果與分析

圖2 表達(dá)載體雙酶切驗(yàn)證圖Fig.2 Double digestion of expression vector M：4 kb DNA分子量 4 kb DNA marker; A：pMvnhx1-1304表達(dá)載體質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證 Double digestion of pMvnhx1-1304 plasmid; 1：pMvnhx1-1304表達(dá)載體質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物 Product of double digestion of pMvnhx1-1304 plasmid. B：pMvp5cs-1304表達(dá)載體質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證 Double digestion of pMvp5cs-1304 plasmid; 1：pMvp5cs-1304表達(dá)載體質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物 Product of double digestion of pMvp5cs-1304 plasmid.

2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建

分別回收經(jīng)過NcoⅠ和SacⅠ雙酶切回收的Mvnhx1啟動子片段、Mvp5cs啟動子片段、pCAMBIA1304載體片段，用T4 Ligase將Mvnhx1、Mvp5cs啟動子片段分別和載體片段連接。如圖2所示，經(jīng)過酶切驗(yàn)證后，分別得到1655和1429 bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相同。

2.2 轉(zhuǎn)基因煙草再生植株的獲得

如圖3所示，煙草外植體(圖3A)在篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周左右，長出愈傷組織，并分化出抗性再生芽(圖3B)。再生芽長到3～4 cm時(shí)切下移至生根培養(yǎng)基，4周左右生根(圖3C)。待根系生長健壯后，煉苗，移至滅菌花土中(圖3D)。

圖3 煙草抗性芽的篩選及再生植株的獲得Fig.3 Selection of tobacco resistant bud and regeneration tobacco plants A：共培養(yǎng)葉盤 Col-culture leaves; B：再生芽 Regenerate bud; C:生根植株根系 The root of regenerated plant; D：煙草再生植株Tobacco regenerated plant.

2.3 煙草再生植株的鑒定

通過啟動子引物、GUS基因引物和HPT引物進(jìn)行PCR檢測，3對引物均擴(kuò)增出目的條帶，鑒定為陽性植株。Mvnhx1啟動子目的片段為1665 bp，Mvp5cs啟動子目的片段為1429 bp；GUS基因目的片段為1081 bp；HPT篩選標(biāo)記基因目的片段為812 bp。如圖4所示，轉(zhuǎn)Mvnhx1啟動子得到3株陽性植株，轉(zhuǎn)Mvp5cs啟動子得到2株陽性煙草植株。

2.4 GUS組織染色

利用GUS組織染色法對pMvnhx1：：GUS、pMvp5cs：：GUS、CaMV35S：：GUS煙草植株葉片、根、莖、花進(jìn)行染色。如圖5所示，3種煙草各器官組織呈現(xiàn)不同程度的藍(lán)色，其中葉和花顏色最明顯，根和莖有輕微的藍(lán)色斑點(diǎn)。初步說明3種啟動子具有啟動子活性，能夠驅(qū)使下游GUS基因的表達(dá)，組織特異性不明顯。

2.5 GUS活性的檢測

干旱脅迫時(shí)，如圖6所示，Mvp5cs啟動子的GUS活性在36 h達(dá)到最高，是同時(shí)間Mvnhx1啟動子的2.22倍。復(fù)水后Mvnhx1啟動子與Mvp5cs啟動子的GUS活性均下降，表明2種啟動子在沒有干旱脅迫時(shí)不能有效啟動下游基因表達(dá)。CaMV35S啟動子的GUS活性變化差異不顯著，Mvnhx1啟動子、Mvp5cs啟動子與CaMV35S啟動子相比差異顯著，且Mvp5cs啟動子干旱脅迫的響應(yīng)與Mvnhx1啟動子相比更明顯。

圖4 煙草再生植株的鑒定Fig.4 Identification of regeneration tobacco plants M1：4 kb DNA分子量。 4 kb DNA marker; M2：2 kb DNA分子量。 2 kb DNA marker;1～15：pMvnhx1：：GUS轉(zhuǎn)基因植株的鑒定 Identification of transgenic tobacco plants of pMvnhx1：：GUS; 1～5：Mvnhx1啟動子引物PCR驗(yàn)證 Mvnhx1 promoter primers PCR; 1～3：轉(zhuǎn)基因植株 Transgenic tobacco plants; 4：非轉(zhuǎn)基因煙草 Non-transgenic tobacco; 5：pMvnhx1：：GUS質(zhì)粒 Plasmid of pMvnhx1：：GUS; 6～10：GUS基因引物PCR驗(yàn)證 GUS gene primers PCR; 6～8：轉(zhuǎn)基因植株 Transgenic tobacco plants; 9：非轉(zhuǎn)基因煙草 Non-transgenic tobacco; 10：pMvnhx1：：GUS質(zhì)粒 Plasmid of pMvnhx1：：GUS; 11～15：HPT引物PCR驗(yàn)證 HPT gene primers PCR; 11～13：轉(zhuǎn)基因植株 Transgenic tobacco plants; 14：非轉(zhuǎn)基因煙草 Non-transgenic tobacco; 15：pMvnhx1：：GUS質(zhì)粒 Plasmid of pMvnhx1：：GUS;16～27：pMvp5cs：：GUS轉(zhuǎn)基因植株的鑒定 Identification of transgenic tobacco plants of pMvp5cs：：GUS; 16～19：Mvp5cs啟動子引物PCR驗(yàn)證 Mvp5cs primers PCR; 16～17：轉(zhuǎn)基因植株 Transgenic tobacco plants; 18：非轉(zhuǎn)基因煙草 Non-transgenic tobacco; 19：pMvp5cs：：GUS質(zhì)粒 Plasmid of pMvp5cs：：GUS; 20～23：GUS引物PCR驗(yàn)證 GUS gene primers PCR; 20～21：轉(zhuǎn)基因植株 Transgenic tobacco plants; 22：非轉(zhuǎn)基因煙草 Non-transgenic tobacco; 23：pMvp5cs：：GUS質(zhì)粒 Plasmid of pMvp5cs：：GUS; 24～27：HPT引物PCR驗(yàn)證 HPT gene primers PCR; 24～25：轉(zhuǎn)基因植株 Transgenic tobacco plants; 26：非轉(zhuǎn)基因煙草 Non-transgenic tobacco; 27: pMvp5cs：：GUS質(zhì)粒 Plasmid of pMvp5cs：：GUS.

圖5 GUS組織染色效果Fig.5 GUS tissue staining effect 從上到下：葉片，根，莖橫切面，花。 Top-to-bottom: leaf, root, stem cross section, flower; A： CaMV35S：：GUS煙草 Tobacco of CaMV35S：：GUS; B： pMvnhx1：：GUS煙草 Tobacco leaves pMvnhx1：：GUS; C： pMvp5cs：：GUS煙草 Tobacco leaves pMvp5cs：：GUS.

圖6 干旱脅迫時(shí)GUS活性檢測 Fig.6 GUS activity detection under drought stress 不同小寫字母者表示所有數(shù)據(jù)在P<0.05 水平上差異顯著。Different letters mean all data significantly different at the P<0.05 probability level. 復(fù)1：復(fù)水1 h。 Rewater 1 h; 復(fù)4：復(fù)水4 h。 Rewater 4 h.下同The same below.

3種鹽濃度脅迫時(shí)，如圖7所示，在50 mmol/L鹽濃度處理下，3種啟動子的GUS活性差別不顯著。隨著鹽濃度的提高，CaMV35S啟動子GUS活性變化不大，差異不顯著；Mvp5cs啟動子與Mvnhx1啟動子GUS活性明顯提高，兩種啟動子與CaMV35S啟動子相比較差異性顯著，Mvnhx1啟動子GUS活性明顯高于Mvp5cs啟動子。在48 h， 100和150 mmol/L NaCl處理時(shí)，Mvnhx1啟動子GUS活性分別是Mvp5cs啟動子的2.03和3.23倍，差異顯著。復(fù)水處理后，Mvp5cs啟動子與Mvnhx1啟動子活性均明顯下降，表明2種啟動子在沒有鹽脅迫后不能有效啟動下游基因表達(dá)。比較2種啟動子，Mvp5cs啟動子與Mvnhx1啟動子在鹽脅迫下均能顯著提高下游基因的表達(dá)，Mvnhx1啟動子響應(yīng)能力更強(qiáng)。

圖7 鹽脅迫時(shí)GUS活性檢測Fig.7 GUS activity detection under NaCl stress

脫落酸3種濃度脅迫時(shí)，如圖8所示，CaMV35S啟動子GUS活性整體變化不大，差異不顯著。Mvp5cs啟動子與CaMV35S啟動子相比在低濃度脫落酸處理下差異不顯著，但是在50 μmol/L ABA處理時(shí)，在24和36 h的GUS活性是CaMV35S啟動子的3.11和2.08倍。Mvnhx1啟動子活性隨著脅迫濃度的升高逐漸提高，25和50 μmol/L ABA處理時(shí)，36 h達(dá)到峰值，48 h時(shí)開始下降，其活性整體高于另外兩種啟動子，差異顯著。說明Mvp5cs啟動子與Mvnhx1啟動子均能響應(yīng)脫落酸脅迫，Mvnhx1啟動子在較低濃度就可以啟動下游基因表達(dá)，所以對ABA的響應(yīng)更顯著。

圖8 脫落酸脅迫時(shí)GUS活性檢測 Fig.8 GUS activity detection under ABA(abscisic acid)stress

圖9 赤霉素脅迫時(shí)GUS活性檢測Fig.9 GUS activity detection under GA(gibberellin) stress

在赤霉素脅迫下，如圖9所示，30 μmol/L處理時(shí)，CaMV35S啟動子GUS活性略有升高，但整體差異不明顯；Mvnhx1與Mvp5cs啟動子稍高于CaMV35S啟動子，差異不顯著。50 μmol/L，Mvp5cs啟動子與Mvnhx1啟動子活性明顯升高，呈遞增趨勢，與CaMV35S啟動子相比差異顯著。70 μmol/L處理時(shí)，Mvp5cs啟動子的GUS活性較50 μmol/L升幅更大，在36 h達(dá)到最大值，是同時(shí)間段Mvnhx1啟動子的1.79倍；Mvnhx1啟動子活性雖呈上升趨勢，但比50 μmol/L GA處理有所下降。在50，70 μmol/L GA處理時(shí)，Mvp5cs啟動子、Mvnhx1啟動子與CaMV35S啟動子差異顯著。說明赤霉素脅迫下，Mvp5cs啟動子、Mvnhx1啟動子與CaMV35S啟動子差異顯著，均能響應(yīng)赤霉素脅迫，Mvp5cs啟動子比Mvnhx1啟動子響應(yīng)更強(qiáng)烈。

表1 Mvnhx1啟動子序列順式作用元件分析Table 1 Cis-acting regulatory elements analysis of Mvnhx1 promoter sequences

注：“+1”位置處為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，起點(diǎn)后面的3′端下游序列依次為+2，+3，……，起點(diǎn)前面的5′端上游序列依次為-1，-2，……；下同。

Note: Position“+1”is the transcription start site, and the downstream sequence of the 3′ end is followed by +2， +3，……, from the beginning of the 5′ end of the upstream sequence as followed by -1, -2，……； The same below.

通過啟動子順式作用元件預(yù)測網(wǎng)站PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果如表1、表2所示。Mvnhx1與Mvp5cs啟動子都屬于RNA聚合酶Ⅱ型啟動子，2種啟動子都具有TATA box核心啟動子元件CAAT box、GATA box等植物啟動子中存在的通用啟動子元件。Mvnhx1啟動子含有逆境響應(yīng)元件TC-rich-repeats(ATTTTCTTCA)2個(gè)、干旱和鹽響應(yīng)元件MYB2CONSENSUSAT(YAACKG)3個(gè)、鹽響應(yīng)元件GT1CONSENSUS(GAAAAA)12個(gè)、干旱、脫落酸響應(yīng)元件MYCCONSENSUSAT(CANNTG)9個(gè)、脫水響應(yīng)元件CBFHV(RYCGAC)2個(gè)；ABA響應(yīng)元件RY-repeats(YACT)1個(gè)、DPBFCOREDCDC3(ACACNNG)2個(gè)、ABRE(ACGTG)1個(gè)；赤霉素響應(yīng)元件PYR(TTTTTTCC)1個(gè)、GAREAT(TAACAAR)1個(gè)；植物防御響應(yīng)元件WBOXNTERF3(TGACY)2個(gè)及其他響應(yīng)水楊酸、生長素等響應(yīng)元件。Mvp5cs啟動子具有干旱響應(yīng)元件MBS 1個(gè)、干旱和脫落酸響應(yīng)元件MYB(WAACCA)3個(gè)、干旱逆境響應(yīng)元件MYB2AT(TAACTG)1個(gè)、MYBCORE(CNGTTR)3個(gè)、 MYCCONSENSUSAT(CANNTG)5個(gè)、低溫干旱響應(yīng)元件LTRE(CCGAC)2個(gè)；鹽響應(yīng)元件GT1CONSENSUS(GAAAAA)5個(gè)；赤霉素響應(yīng)元件PYR(TTTTTTCC)2個(gè)、GARE-motif(GATAGGG)1個(gè)、DPBFCOREDCDC3(ACACNNG)2個(gè)；脫落酸響應(yīng)元件ABRE(ACGTG)1個(gè)；植物防御響應(yīng)元件WBOXATNPR1(TTGAC)3個(gè)。

表2 Mvp5cs啟動子序列順式作用元件分析Table 2 Cis-acting regulatory elements analysis of Mvp5cs promoter sequences

通過比較分析得知，Mvnhx1啟動子比Mvp5cs啟動子鹽脅迫相關(guān)的響應(yīng)元件GT1CONSENSUS上多出7個(gè)，MYB2CONSENSUSAT元件多出2個(gè)；脫落酸響應(yīng)元件上MYCCONSENSUSAT多出4個(gè)、RY-repeats 1個(gè)。Mvp5cs啟動子比Mvnhx1啟動子在干旱響應(yīng)元件MYB上多出3個(gè)、LTRE多出2個(gè)；赤霉素響應(yīng)元件上PYR多出1個(gè)。

3 討論

本課題組前期已通過花粉管通道法分別獲得高代穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)MvNHX1基因和轉(zhuǎn)MvP5CS基因棉花(Gossypium)，經(jīng)過一系列農(nóng)藝生理指標(biāo)和生理生化指標(biāo)檢測，證明轉(zhuǎn)MvNHX1基因棉花在耐鹽性上優(yōu)于轉(zhuǎn)MvP5CS基因棉花，轉(zhuǎn)MvP5CS基因棉花在抗旱性方面優(yōu)于轉(zhuǎn)MvNHX1基因棉花[24]。說明了MvNHX1基因與MvP5CS基因是抗旱耐鹽相關(guān)的基因，但在抗旱和耐鹽性上仍有差異。通過本試驗(yàn)不同種類、不同時(shí)間、濃度梯度的脅迫可知， 組成型啟動子CaMV35S活性在正常情況下與Mvnhx1啟動子、Mvp5cs啟動子差異不顯著，4種脅迫處理后整體的GUS活性要低于Mvnhx1啟動子與Mvp5cs啟動子。Mvnhx1啟動子在鹽脅迫、脫落酸脅迫下所起誘導(dǎo)作用要優(yōu)于Mvp5cs啟動子。Mvp5cs啟動子在干旱脅迫、赤霉素脅迫所起誘導(dǎo)作用優(yōu)于Mvnhx1啟動子。此結(jié)果和2個(gè)啟動子間順式作用元件的差別有著直接的聯(lián)系。

部分研究表明WRKY71OS元件可能有抑制赤霉素通道響應(yīng)的作用，可分別通過以下3種機(jī)制實(shí)現(xiàn)：與GARE競爭相結(jié)合的元件；與后面序列TGAC core結(jié)合；與上游的W-BOX結(jié)合。Mvnhx1啟動子含有WRKY71OS元件，這個(gè)元件有可能是兩個(gè)啟動子在赤霉素脅迫上有差異的原因之一。但WRKY71OS元件與其他啟動子元件結(jié)合產(chǎn)生了新的調(diào)控應(yīng)答也未可知。一些關(guān)于ABRE元件的報(bào)道發(fā)現(xiàn)此元件需要與多個(gè)重復(fù)或與其他元件相結(jié)合才可以響應(yīng)ABA信號，兩個(gè)啟動子都只含有一個(gè)ABRE元件，Mvnhx1啟動子在脫落酸響應(yīng)上要優(yōu)于Mvp5cs啟動子，推測MYCCONSENSUSAT、RY-repeats兩個(gè)相關(guān)元件起主要作用。以上順式作用元件種類和數(shù)量的差別可能是導(dǎo)致2種啟動子在不同脅迫下產(chǎn)生不同應(yīng)答反應(yīng)的原因之一，元件的差異也可能導(dǎo)致了不同的調(diào)控應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)，但還需要進(jìn)一步試驗(yàn)探索。2個(gè)啟動子上的不同作用元件具體在植物應(yīng)答外界反應(yīng)中所起的作用還需要進(jìn)一步研究探討[17,25-27]。

4 結(jié)論

啟動子調(diào)控了基因的表達(dá)，本試驗(yàn)通過對兩種啟動子的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行脅迫下的GUS活性檢測，初步檢測了兩種啟動子的功能，證明了Mvnhx1啟動子與Mvp5cs啟動子是干旱、鹽誘導(dǎo)型啟動子；但在干旱和鹽誘導(dǎo)后啟動子基因表達(dá)存在差異，兩種啟動子之間功能的差異與其自身的順式作用元件有著密切的聯(lián)系。在本研究的基礎(chǔ)上，下一步可以具體研究這兩種啟動子所含調(diào)控元件的作用，進(jìn)一步揭示啟動子各關(guān)鍵調(diào)控元件的作用，從而有助于更好的闡明植物抗逆分子機(jī)制。

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Functional analysis of two stress-related promoters in Medicago varia cultivar Xinmu No.1

CHAO Zhao-Xia1, REN Yan-Ping1, QIAN Jin2, YAO Zheng-Pei1, XU Lei3, ZHANG Hua1*

1.CollegeofAgriculture,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China; 2.JiangsuGoldenAgriculturalScienceandTechnologyDevelopmentCo.,Ltd,Yancheng224100,China; 3.PratacultureInstitute,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China

MvP5CSandMvNHX1 genes of theMedicagovariacultivar Xinmu No.1 and their promoter sequences have been successfully cloned in previous work. Based on this research, in this study two plant expression vectors, each containingMvp5csandMvnhx1 promoters with aGUSgene as the reporter, were constructed and two tobacco transgenic plants with the promoter obtained by Agrobacterium-mediated method. PCR analysis showed that the two promoters had been stably integrated into the tobacco genome and GUS-staining proved that they have the function of activating gene expression. We explored this function by measuring GUS activity under four different abiotic stresses: drought, salinity, abscisic acid (ABA) and gibberellin (GA). The results showed thatMvnhx1 andMvp5csresponded to the four stresses and had significant differences from theCaMV35Spromoter. TheMvnhx1 promoter was superior toMvp5csunder salt and ABA stress. After 48 h treatments of 100 and 150 mmol/L NaCl stress, the GUS activity ofMvnhx1 was 2.03 times and 3.23 times that ofMvp5cs. Under treatments of 25 and 50 μmol/L ABA stress,Mvnhx1 activity was significantly higher than the other two promoters.Mvp5cswas superior toMvnhx1 under drought and GA stress. The GUS activity of theMvp5cswas 2.22 times that ofMvnhx1 after 36 h treatment of drought stress. TheMvp5cspromoter reached its maximum value, which was 1.79 times that ofMvnhx1, after 36 h treatment with 70 μmol/L GA stress.

promoter；Mvnhx1；Mvp5cs；genetic transformation；abiotic stress；GUS activity

10.11686/cyxb2016071

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-03-02；改回日期：2016-04-07

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金(項(xiàng)目編號：2014211B017)資助。

晁朝霞(1989-)，女，山東菏澤人，在讀碩士。E-mail:xiangyin.cool@163.com*通信作者Corresponding author. E-mail:hazelzhang@163.com

晁朝霞， 任燕萍， 錢進(jìn)， 姚正培， 許磊， 張樺. 新牧1號苜蓿兩種抗逆相關(guān)啟動子的功能分析. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2017, 26(1): 131-141.

CHAO Zhao-Xia, REN Yan-Ping, QIAN Jin, YAO Zheng-Pei, XU Lei, ZHANG Hua. Functional analysis of two stress-related promoters inMedicagovariacultivar Xinmu No.1. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(1): 131-141.