顯齒蛇葡萄提取物的體內(nèi)和體外降血糖效果

張 斌

(漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南 漯河 462002)

顯齒蛇葡萄提取物的體內(nèi)和體外降血糖效果

張 斌

(漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 漯河 462002)

目的 探討不同顯齒蛇葡萄提取物體外降血糖及抗氧化和體內(nèi)降血糖效果研究。方法 利用正己烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇和70%的乙醇提取顯齒蛇葡萄中的活性成分，得到不同提取物，測(cè)定其中總酚和總黃酮的含量，考察對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果和對(duì)DPPH及ABTS的清除效果，體內(nèi)降血糖效果是利用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)小鼠糖尿病模型，正己烷提取物(HE)、氯仿提取物(CE)、乙酸乙酯提取物(EAE)、甲醇提取物(ME)和70%的乙醇提取物(EE)按劑量200 mg/kg體重治療4 w，每周末尾部動(dòng)脈取血測(cè)定血糖，4 w后眼眶取血測(cè)定血清胰島素。結(jié)果 不同提取物中，EE中總酚類物質(zhì)和總黃酮來(lái)物質(zhì)的含量最高，其次是ME，HE中該兩種成分含量最低，體外降血糖效果發(fā)現(xiàn)EE對(duì)α-葡萄糖苷酶具有較強(qiáng)的抑制活性并且體現(xiàn)劑量依賴性，體外抗氧化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EE對(duì)DPPH和ABTS具有較強(qiáng)的清楚效果，而體內(nèi)降血糖效果發(fā)現(xiàn)不同提取物對(duì)糖尿病小鼠具有一定的降血糖效果，特別是EE組降血糖效果非常明顯，血清胰島素的含量得到明顯提高。結(jié)論 顯齒蛇葡萄70%EE具有明顯的抗氧化和降血糖效果，是一種具有很大潛力的降血糖和抗氧化的天然藥物。

顯齒蛇葡萄；降血糖；α-葡萄糖苷酶；抗氧化

糖尿病及其并發(fā)癥嚴(yán)重威脅人類健康，在各類疾病中死亡率居第3位〔1〕。植物提取物的降血糖作用已得到證實(shí)〔2～5〕。顯齒蛇葡萄屬于葡萄科蛇葡萄屬藤本植物，主要分布于華中和西南等省少數(shù)民族地區(qū)，民間作為茶飲用植物已有上千年的應(yīng)用歷史〔6〕。研究表明，顯齒蛇葡萄葉中主要次生代謝物以黃酮類化合物為主，含量達(dá)到45.52%〔7〕，其中以二氫楊梅素含量最高，是天然的抗氧化劑?，F(xiàn)代藥理研究表明，顯齒蛇葡萄具有抗氧化，抑菌消炎，降血脂降血壓和護(hù)肝效果〔8～11〕。民間常作為降血糖藥物來(lái)治療糖尿病，但是至今還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道，本研究觀察顯齒蛇葡萄的不同提取物體外和體內(nèi)降血糖效果。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑 顯齒蛇葡萄采集于信陽(yáng)，經(jīng)漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校李成宏老師鑒定為葡萄科蛇葡萄屬藤本植物，憑證標(biāo)本保存在漯河醫(yī)專植物標(biāo)本館內(nèi)。嫩葉在50℃～60℃烘干后用中藥粉碎機(jī)粉碎過(guò)60目篩，備用。清潔級(jí)健康KM小白鼠，雄性體質(zhì)量(20±2)g，由河南斯萊克竟達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCKK(豫)2009-0010，分籠飼養(yǎng)，飼料充足飲水不限，室溫20℃～25℃，適應(yīng)環(huán)境5 d后用于實(shí)驗(yàn)。阿卡波糖，α-葡萄糖苷酶，鏈脲佐菌素(STZ)均購(gòu)自Sigma公司，鹽酸二甲雙胍購(gòu)自重慶科瑞制藥有限責(zé)任公司，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備 AL104電子天平(Mettler-Toledo儀器公司)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；CTXNW-10B超聲波循環(huán)提取機(jī)(北京弘祥生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司)；Free Style 利舒坦雅培血糖儀(美國(guó)Abbott Diabetes Care公司)；DU-800紫外掃描分光光度計(jì)(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的提取 準(zhǔn)確稱取顯齒蛇葡萄葉粉末2 000 g 5份，分別用20倍體積的正己烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇和70%的乙醇浸泡24 h后，利用循環(huán)超聲波提取儀提取45 min，減壓濃縮回收得提取物，再經(jīng)過(guò)冷凍干燥得到5個(gè)提取物，分別是正己烷提取物(HE)、氯仿提取物(CE)、乙酸乙酯提取物(EAE)、甲醇提取物(ME)以及70%乙醇提取物(EE)。

1.3.2 總酚和總黃酮的含量以及對(duì)DPPH和ABTS清除率的測(cè)定 顯齒蛇葡萄不同提取物中的總酚和總黃酮的含量測(cè)定參照文獻(xiàn)〔12〕進(jìn)行測(cè)定。另外，DPPH和ABTS自由基清除作用依照文獻(xiàn)〔12〕方法進(jìn)行測(cè)定，對(duì)DPPH清除時(shí)不同提取物的濃度為5～500 μg/ml，對(duì)ABTS清除時(shí)不同提取物的濃度為1～50 μg/ml，用BHT作為對(duì)照。

1.3.3 體外降血糖效果評(píng)價(jià) 參照參考文獻(xiàn)〔9〕的測(cè)定方法，略作修改。分別取60 μl不同提取待測(cè)液(0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/ml樣品液、阿卡波糖溶液以及蘆丁溶液，同量的緩沖液作為空白對(duì)照)于96孔酶標(biāo)板中，加入50 μl α-葡萄糖苷酶溶液(0.2 U/ml)，振勻后于37℃水浴保溫10 min，加入50 μl 5.0 mmol/L PNPG溶液振勻，在37℃水浴中反應(yīng)20 min，加入160 μl Na2CO3溶液(0.2 mol/L)終止酶促反應(yīng)，置于405 nm 波長(zhǎng)處測(cè)吸光度(A)。由于顯齒蛇葡萄提取物本身有顏色，因此每個(gè)樣品需要測(cè)定背景吸收，并最終測(cè)定結(jié)果進(jìn)行校正。每個(gè)樣品重復(fù)3 次取平均值。抑制率(%)=(A0-AS)/A0 ×100%。式中：AS為樣品組吸光度；A0為空白對(duì)照組吸光度。

1.3.4 顯齒蛇葡萄提取物體內(nèi)降血糖效果檢測(cè) 100只KM小鼠禁食12 h后，注射STZ 150 mg/kg(用pH4.5的檸檬酸鈉溶液配制成),72 h后，尾部動(dòng)脈取血測(cè)定血糖含量，血糖含量>11.1 mmol/L為造模成功的小鼠〔12〕。

選取小鼠80只，隨機(jī)分為8組，正常組(蒸餾水)，控制組，二甲雙胍組(30 mg/kg體重)，以及顯齒蛇葡萄不同提取物(200 mg/kg體重)劑量組，小鼠分籠飼養(yǎng)，每天按劑量給藥1次，自由進(jìn)食、飲水。實(shí)驗(yàn)周期4 w，在實(shí)驗(yàn)1、2、3、4 w末尾靜脈采血，測(cè)空腹血糖。實(shí)驗(yàn)第4周末，乙醚麻醉小鼠后摘取眼眶取血，血樣4℃3 500 r/min離心10 min后取血清用來(lái)測(cè)定血清胰島素水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件行方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 顯齒蛇葡萄不同提取物中總酚和總黃酮含量以及對(duì)DPPH和ABTS清除率的測(cè)定 70%EE中的總酚和總黃酮含量均為最高，而其他提取物中的總酚和總黃酮含量是不同的，利用體外抗氧化實(shí)驗(yàn)如對(duì)DPPH和ABTS的清除效果評(píng)價(jià)提取物的活性，從IC50的只可以看出，70%EE對(duì)DPPH和ABTS具有明顯的清除效果。其他提取物對(duì)DPPH和ABTS的清楚效果是根據(jù)總酚和總黃酮的含量呈正相關(guān)?？偡雍涂傸S酮含量越高，清除效果越好，說(shuō)明總酚和總黃酮是顯齒蛇葡萄中的主要起作用的物質(zhì)。見(jiàn)表1。

表1 顯齒蛇葡萄中不同提取物總酚、總黃酮含量以及DPPH和ABTS的IC50值

與BHT比較：1)P<0.05，2)P<0.01

2.2 不同提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制 不同提取物中，EE對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性最好，其次是ME，抑制效果最差的是HE，說(shuō)明高含量的總酚類物質(zhì)和總黃酮類物質(zhì)的提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制具有較強(qiáng)的活性，另外每種提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性隨著劑量的增大，抑制活性隨著增大，說(shuō)明顯齒蛇葡萄提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性是劑量依賴型的。比較不同質(zhì)量濃度顯齒蛇葡萄、阿卡波糖和蘆丁對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性可看出，隨質(zhì)量濃度增加，EE和ME對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性好于蘆丁，但低于阿卡波糖。見(jiàn)圖1。

2.3 不同提取物體內(nèi)降血糖效果研究 與正常組比較，STZ致糖尿病小鼠的血糖含量明顯升高，經(jīng)過(guò)4 w的治療后，與控制組比較，經(jīng)過(guò)不同提取物的治療發(fā)現(xiàn)，各治療組的糖尿病小鼠的血糖含量顯著降低(P<0.01)，且EE-200 mg/kg劑量組小鼠的血糖含量與二甲雙胍組小鼠的血糖含量在4 w后比較相近，結(jié)果說(shuō)明顯齒蛇葡萄具有較強(qiáng)的降血糖效果，并且體現(xiàn)為70% EE的降血糖效果最佳。見(jiàn)表2。

圖1 不同提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果

組別0w1w2w3w4w正常組65±0576±0875±0668±0865±03控制組225±18248±08256±13176±14285±13二甲雙胍組218±164179±042)168±132)159±141)87±142)HE組215±05206±031)196±182)195±051)175±112)CE組233±21225±15206±151)195±141)175±182)EAE組244±15228±13195±122)178±16149±212)ME組234±08218±11185±122)168±08135±142)EE組225±15205±071)165±112)135±062)89±142)

與控制組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

2.4 不同提取物對(duì)糖尿病小鼠血清胰島素含量的影響 糖尿病小鼠血清中的胰島素含量〔(21.4±2.7)mIU/L〕明顯低于正常小鼠〔(51.2±3.5)mIU/L〕血清中的血清，說(shuō)明經(jīng)過(guò)STZ造模后，胰島細(xì)胞遭到破壞，抑制胰島素的分泌，經(jīng)二甲雙胍和不同提取物的4 w治療，二甲雙胍組〔(36.8±3.1)mIU/L〕小鼠中血清含量明顯提高(P<0.01)，但是HE組〔(23.6±2.5)mIU/L〕和CE組〔(24.1±2.4)mIU/L〕小鼠血清中胰島素的含量提高不大，說(shuō)明這兩個(gè)提取物對(duì)糖尿病小鼠治療效果不明顯，而EAE組〔(31.2±2.8)mIU/L〕、ME組〔(32.4±2.6)mIU/L〕和EE組〔(40.5±2.4)mIU/L〕小鼠血清中的胰島素含量得到明顯提高(P<0.01,P<0.05)，尤其是EE組小鼠血清中的胰島素提高幅度較大，僅次于二甲雙胍組中的含量。

3 討 論

本文結(jié)果說(shuō)明顯齒蛇葡萄中主要活性物質(zhì)是酚類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)，酚類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)，尤其在降血糖、抗氧化等方面取得了顯著的成果〔13,14〕，本研究發(fā)現(xiàn)不同提取物中70%EE中的酚類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)含量最高，并且對(duì)DPPH和ABTS呈現(xiàn)了極高的清除效果。α-葡萄糖苷酶主要是催化淀粉(多糖)分解成單糖尤其是葡萄糖〔15〕。多種抑制劑如阿卡波糖和伏格列波糖都可以抑制α-葡萄糖苷酶，延緩雙糖(淀粉在淀粉酶作用下水解為雙糖)在α-葡萄糖苷酶作用下分解為單糖，延緩葡萄糖與果糖的吸收速度，從而降低餐后血糖，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制效果，但是EE的抑制效果最好，接近阿卡波糖的抑制效果，從而降低餐后的高血糖。糖尿病小鼠經(jīng)過(guò)顯齒蛇葡萄提取物4 w治療后，小鼠中血糖含量明顯減低，可能是顯齒蛇葡萄提取物作為抗氧化劑防止胰腺β-細(xì)胞進(jìn)一步受損的同時(shí)刺激受損胰腺β-細(xì)胞的修復(fù)和刺激胰腺β-細(xì)胞大量分泌胰島素。另外，胰島素的分泌能夠刺激肝糖原的合成和抑制肝糖原磷酸化酶〔16〕，促進(jìn)肝糖原的沉積，有利于血糖的降低。

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〔2015-07-05修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

張 斌(1980-)，女，講師，主要從事中醫(yī)學(xué)教學(xué)和研究。

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A

1005-9202(2017)02-0321-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.026