當(dāng)歸川葛顆粒對硝酸甘油致大鼠偏頭痛的影響及機(jī)制

宋丹寧 尚 坤 李 娜 董雪蓮 邱智東 韓 冬 隋殿軍

(長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117)

當(dāng)歸川葛顆粒對硝酸甘油致大鼠偏頭痛的影響及機(jī)制

宋丹寧 尚 坤 李 娜 董雪蓮 邱智東 韓 冬 隋殿軍

(長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117)

目的 觀察當(dāng)歸川葛顆粒對硝酸甘油致大鼠偏頭痛的影響及其作用機(jī)制。方法 60只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為空白對照組、模型對照組、當(dāng)歸川葛顆粒低、中、高劑量組(0.9、1.8、3.6 g/kg)及琥珀酸舒馬普坦組(0.05 g/kg)，每組10只，各組均連續(xù)給藥7 d。末次給藥30 min后除空白對照組外其余各組大鼠給予10 mg/kg臀部皮下注射硝酸甘油，空白對照組大鼠臀部皮下注射等體積生理鹽水。通過數(shù)碼攝像機(jī)記錄大鼠造模后的行為表現(xiàn)，觀察大鼠耳紅時間，撓頭及爬籠等行為。行為學(xué)記錄結(jié)束后，各組大鼠取腦后測定大腦組織勻漿中降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)及β-內(nèi)啡肽(β-EP)含量。結(jié)果 當(dāng)歸川葛顆粒能縮短大鼠耳紅持續(xù)時間，減少大鼠撓頭次數(shù)及爬籠次數(shù)，能減少大鼠腦組織中CGRP含量并增加β-EP含量。結(jié)論 當(dāng)歸川葛顆粒具有縮短大鼠偏頭痛發(fā)作時間及改善偏頭痛狀態(tài)作用，可能與調(diào)節(jié)腦組織中CGRP含量及β-EP含量有關(guān)。

當(dāng)歸川葛顆粒；硝酸甘油；偏頭痛；降鈣素基因相關(guān)肽；β-內(nèi)啡肽

偏頭痛是一種反復(fù)發(fā)作的神經(jīng)內(nèi)科疾病〔1〕。當(dāng)歸川葛顆粒組方是長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腦病科治療偏頭痛的經(jīng)典方劑，由當(dāng)歸、川芎、葛根三味中藥組成，具有多年臨床應(yīng)用史及顯著的療效。本實驗旨在探討當(dāng)歸川葛顆粒對硝酸甘油致偏頭痛的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物 成年健康雄性Wistar大鼠，實驗室條件下飼養(yǎng)，體重220～260 g，吉林大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號SCXK-(吉)2011-0003。

1.2 藥品與試劑 琥珀酸舒馬普坦片(海南先聲藥業(yè)有限公司)；當(dāng)歸川葛顆粒(長春中醫(yī)藥大學(xué)研發(fā)中心)；硝酸甘油注射液(北京益民藥業(yè)有限公司)；大鼠降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)放射免疫試劑盒、β-內(nèi)啡肽(β-EP)放射免疫試劑盒(武漢博歐特生物科技有限公司)。

1.3 實驗動物分組及偏頭痛模型建立 隨機(jī)分為空白對照組、模型對照組、當(dāng)歸川葛顆粒低劑量組、中劑量組、高劑量組及琥珀酸舒馬普坦組各10只。當(dāng)歸川葛顆粒低、中、高劑量組分別按劑量體重比0.9 g/kg，1.8 g/kg，3.6 g/kg灌胃為當(dāng)歸川葛顆粒溶液，琥珀酸舒馬普坦組按劑量體重比0.05 g/kg灌胃琥珀酸舒馬普坦片溶液，上述藥物都用羧甲基纖維素鈉溶液稀釋，空白對照組及模型對照組灌胃等體積羧甲基纖維素鈉溶液，各組均連續(xù)給藥7 d。末次給藥30 min后，除空白對照組外其余各組大鼠給予按劑量體重比10 mg/kg臀部皮下注射硝酸甘油，空白對照組大鼠臀部皮下注射等體積生理鹽水。潛伏期后觀察5 min內(nèi)大鼠行為學(xué)變化，以出現(xiàn)雙耳發(fā)紅，前肢頻繁撓頭，爬籠次數(shù)增多，咬尾，往返運動為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 實驗方法與觀察指標(biāo) 通過數(shù)碼攝像機(jī)記錄大鼠造模后行為表現(xiàn)，觀察大鼠耳紅、撓頭及爬籠的行為。(1)耳紅：記錄大鼠造模后耳紅出現(xiàn)及消失時間；(2)記錄大鼠造模后撓頭出現(xiàn)及消失時間，撓頭的出現(xiàn)時間以大鼠連續(xù)撓頭超過5次以上為記錄標(biāo)志，消失時間以大鼠在某一時間段中撓頭次數(shù)小于5次為記錄標(biāo)志且伴隨疲乏及倦怠表現(xiàn)；(3)撓頭及爬籠次數(shù)以30 min作為一個時間段，分段記錄大鼠造模后各時間段撓頭及爬籠次數(shù)。大鼠的撓頭行為以前肢撓頭作為記錄標(biāo)志，爬籠行為以大鼠前肢抓籠蓋作為記錄標(biāo)志。行為學(xué)記錄結(jié)束后各組大鼠取腦組織并分離腦干后稱重。置于生理鹽水中，煮沸10 min滅活酶，冷卻后加入1N HAC 1 ml，放入玻璃勻漿器中勻漿，勻漿液放置 4℃環(huán)境中1 h后，加入 1N NaOH 1 ml，4℃下3 000 r/min離心15 min，取上清-20℃保存待測。按照CGRP放射免疫試劑盒壽命數(shù)及β-EP放射免疫試劑盒說明書測定各組大鼠大腦組織勻漿中CGRP及β-EP含量〔2〕。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 當(dāng)歸川葛顆粒對大鼠耳紅出現(xiàn)與消失時間的影響 與模型對照組比較，當(dāng)歸川葛顆粒高劑量組大鼠耳紅出現(xiàn)時間延后，中劑量組及高劑量組大鼠耳紅消失時間延長(P<0.05或P<0.01)，舒馬普坦組大鼠耳紅出現(xiàn)時間延后，消失時間延長(P<0.05或P<0.01)。見表1。

表1 當(dāng)歸川葛顆粒對大鼠耳紅出現(xiàn)及消失時間的影響

與模型對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；下表同

2.2 當(dāng)歸川葛顆粒對大鼠撓頭次數(shù)的影響 與模型對照組比較，當(dāng)歸川葛顆粒中劑量組、高劑量組及舒馬普坦組大鼠在31～60 min，61～90 min，91～120 min 3個時間段內(nèi)撓頭次數(shù)減少(P<0.05或P<0.01)。見表2。

2.3 當(dāng)歸川葛顆粒對大鼠不同時間爬籠次數(shù)的影響 與模型對照組比較，當(dāng)歸川葛顆粒中劑量組大鼠在31～60 min，61～90 min兩個時間段內(nèi)爬籠次數(shù)減少,高劑量組和舒馬普坦組在31～60 min，61～90 min，91～120 min 3個時間段內(nèi)爬籠次數(shù)減少(P<0.05或P<0.01)。見表3。

2.4 當(dāng)歸川葛顆粒對大鼠腦組織CGRP含量的影響 與模型對照組〔(689.45±91.24)pg/g〕比較，當(dāng)歸川葛顆粒中劑量組〔(573.49±96.47)pg/g〕、高劑量組〔(548.63±80.54)pg/g〕和舒馬普坦組〔(508.26±67.91)pg/g〕大鼠腦組織CGRP含量減少(P<0.05或P<0.01)，低劑量組為(605.84±84.71)pg/g。

表2 當(dāng)歸川葛顆粒對大鼠撓頭次數(shù)的影響±s，n=10，次)

表3 當(dāng)歸川葛顆粒對大鼠不同時間爬籠次數(shù)的影響±s，n=10，次)

2.5 當(dāng)歸川葛顆粒對大鼠腦組織β-EP含量的影響 與模型對照組〔(93.41±16.27)pg/g〕比較，當(dāng)歸川葛顆粒中劑量組〔(127.35±19.73)pg/g〕、高劑量組〔(143.81±18.62)pg/g〕和舒馬普坦組〔(150.39±16.53)pg/g〕大鼠腦組織β-EP含量增加(P<0.05或P<0.01)。低劑量組為(105.94±15.84)pg/g。

3 討 論

行為癥狀學(xué)評價為實驗性偏頭痛動物模型非常重要的觀察指標(biāo)，通過硝酸甘油誘導(dǎo)的偏頭痛大鼠模型是諸多誘發(fā)偏頭痛模型中較為常見的一種〔3〕。觀察偏頭痛模型大鼠在單位時間段內(nèi)耳紅出現(xiàn)、消失時間、撓頭和爬籠次數(shù)也是客觀、量化的合理指標(biāo)。本研究表明當(dāng)歸川葛顆粒具有縮短大鼠偏頭痛發(fā)作時間及改善偏頭痛狀態(tài)作用。CGRP 是目前為止發(fā)現(xiàn)的體內(nèi)最強(qiáng)舒血管活性物質(zhì)，在疼痛感覺調(diào)控中發(fā)揮著極其重要的作用〔4〕。當(dāng)偏頭痛發(fā)作時，血管周圍三叉神經(jīng)末神經(jīng)末梢釋放血管活性肽，其中最重要的就是 CGRP，它們作用于血管壁誘發(fā)神經(jīng)性炎癥、腦膜血管過度擴(kuò)張、血漿蛋白外滲、血小板活化及肥大細(xì)胞脫顆粒并且進(jìn)一步刺激三叉神經(jīng)頸復(fù)合體，進(jìn)而將上述信息傳至丘腦及皮質(zhì)產(chǎn)生痛覺〔5，6〕。偏頭痛與內(nèi)源性阿片肽系統(tǒng)的障礙密切相關(guān)，特別是 β-EP 紊亂可導(dǎo)致痛覺傳入調(diào)節(jié)障礙。已有實驗證明，β-EP 系統(tǒng)功能低下可能為偏頭痛發(fā)作的誘導(dǎo)因素之一〔7〕。內(nèi)啡肽在感受疼痛、應(yīng)激及高級腦功能方面發(fā)揮重要作用，而偏頭痛患者因原發(fā)性或獲得性內(nèi)啡肽系統(tǒng)障礙可導(dǎo)致垂體前葉對機(jī)體反應(yīng)性下降，進(jìn)而使β-EP 釋放減少，神經(jīng)系統(tǒng)適應(yīng)能力降低，對外界刺激過于敏感，致使頭痛發(fā)作〔8〕。本實驗表明當(dāng)歸川葛顆粒改善偏頭痛作用可能與其調(diào)節(jié)腦組織中CGRP含量及β-EP含量有關(guān)。

1 陳生弟.神經(jīng)病學(xué)〔M〕.北京：科學(xué)出版社，2005：219.

2 趙永烈.芍芷地龍湯對偏頭痛模型動物鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜作用及機(jī)制研究〔D〕.北京:北京中醫(yī)藥大學(xué)，2006.

3 章正祥,曹克剛,范吉平.天麻素對多巴胺、硝酸甘油誘發(fā)的血管舒縮異常模型大鼠血流調(diào)節(jié)作用〔J〕.中華中醫(yī)藥雜志,2012;27(11):2959-62.

4 Wimalawansa SJ.Calcitonin gene-related peptide and its receptors：molecular genetics，physiology，pathophysiology，and therapeutic potentials〔J〕.Endocr Rev，1996;17(5)：533.

5 姚 剛.5-HT1B/1D受體激動劑對偏頭痛的治療機(jī)制研究〔D〕.長春：東北師范大學(xué)，2013.

6 Ashina M，Bendtsen L，Jensen R，etal.Evidence for increased plasma levels of CGRP in migraine outside of attacks〔J〕.Pain，2000;86(1-2)：133.

7 Li R，Sun L，Wang J，etal.Pemetrexed versus docetaxel in second line non-small-cell lung cancer:results and subsets analyses of a multi-center，randomized，exploratory trial in Chinese patients〔J〕.Pulm Pharmacol Ther，2012;25(5):364-70.

8 Zhao P，Dai M，Chen W，etal.Cancer trends in China〔J〕.Jpn J Clin Oncol，2010;40(4):281-8.

〔2016-09-14修回〕

(編輯 滕欣航)

國家科技重大專項子課題(2012ZX09103201-023)

韓 冬(1977-)，男，副教授，主要從事心腦血管藥理研究。 隋殿軍(1955-)，男，教授，主要從事中醫(yī)心腦血管疾病研究。

宋丹寧(1981-)，男，講師，在讀博士，主要從事中醫(yī)心腦血管疾病研究。

R749

A

1005-9202(2017)02-0269-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.004