PKC介導(dǎo)的自噬在肝纖維化中的作用

尹瑞梨,時(shí)佳宏,潘奇正,周德山*

(1.首都醫(yī)科大學(xué) 人體解剖與組織胚胎學(xué)系,北京100069;2.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院;3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院)

PKC介導(dǎo)的自噬在肝纖維化中的作用

尹瑞梨1,時(shí)佳宏2,潘奇正3,周德山1*

(1.首都醫(yī)科大學(xué) 人體解剖與組織胚胎學(xué)系,北京100069;2.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院;3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院)

目的 探討在PKC信號(hào)通路介導(dǎo)的自噬在肝纖維化小鼠肝組織中的變化及意義。方法 本研究將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為兩組：模型組和假手術(shù)對(duì)照組，其中模型組采用膽管結(jié)扎方法誘導(dǎo)小鼠肝纖維化，手術(shù)4周后取材。HE染色、Masson染色顯示小鼠肝組織纖維化程度；免疫組化檢測(cè)肝組織內(nèi)LC3蛋白的表達(dá)；Western Blot法檢測(cè)肝組織中α-SMA、PKCα、p-PKCα和LC3蛋白的表達(dá),最后將人正常肝細(xì)胞L02細(xì)胞轉(zhuǎn)染PKCα siRNA后檢測(cè)LC3蛋白的表達(dá)變化并分析二者之間的關(guān)系。結(jié)果 HE和Masson染色結(jié)果顯示膽管結(jié)扎誘導(dǎo)的肝纖維化模型組有明顯的纖維增生。Western Blot結(jié)果顯示模型組肝組織中α-SMA、PKCα和p-PKCα蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，而Western Blot和免疫組化結(jié)果均顯示LC3蛋白的表達(dá)則明顯降低(P<0.05)。最后，L02細(xì)胞在轉(zhuǎn)染PKCα siRNA后顯示LC3蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.01)。結(jié)論 PKCα信號(hào)通路的激活可以抑制自噬的發(fā)生，二者的相互作用可能與肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。

膽管結(jié)扎誘導(dǎo)的肝纖維化；PKCα蛋白；LC3蛋白；自噬

(ChinJLabDiagn,2017,21:0135)

肝纖維化是各種急慢性致病因素持續(xù)或反復(fù)刺激肝臟，使其纖維組織增生、細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積的病理過(guò)程[1]。若致病因素持續(xù)存在，肝纖維化程度逐漸加重，正常的肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，在匯管區(qū)出現(xiàn)纖維間隔以及假小葉的形成，進(jìn)展成為肝硬化，還可繼續(xù)發(fā)展成為肝癌[2]。已有文獻(xiàn)報(bào)道，肝硬化5年后約有5%發(fā)展成肝癌，而10年后約有40%發(fā)展成肝癌[3]。因此，早期干預(yù)治療肝纖維化對(duì)預(yù)防肝硬化及肝癌的發(fā)生十分重要。自噬(Autophagy)是細(xì)胞在缺氧、饑餓、高溫等應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，通過(guò)上調(diào)自噬水平，降解細(xì)胞中多余的成分從而維持細(xì)胞的能量代謝。這是真核細(xì)胞特有的一種相對(duì)保守的分解代謝過(guò)程，還能降解細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤折疊的蛋白，保護(hù)細(xì)胞不受病原微生物的破壞，因此自噬在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮很重要的作用[4]。而自噬分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬三種類型，通常所研究的主要是巨自噬，負(fù)責(zé)降解細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在并永久存在的蛋白質(zhì)并產(chǎn)生氨基酸用以維持細(xì)胞在缺乏營(yíng)養(yǎng)時(shí)的生存[5]。因此，為了治療肝纖維化，應(yīng)首先闡明其發(fā)生發(fā)展機(jī)制，而近些年的研究表明自噬在肝臟疾病中發(fā)揮重要的作用，如非酒精性脂肪性肝病[6]、病毒性肝炎[7,8]、肝癌[9]以及肝纖維化等。為了進(jìn)一步闡明自噬在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究檢測(cè)了膽管結(jié)扎誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型中蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)和細(xì)胞自噬標(biāo)志性蛋白-微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein Ιlight chain,LC3)的表達(dá)水平變化，探討其之間的關(guān)系和意義，從而為深入研究肝纖維化的發(fā)病機(jī)制及干預(yù)治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1)動(dòng)物：C57BL/6小鼠(動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK20120001)，雄性，體重18-22g，SPF級(jí)，6-8周齡，標(biāo)準(zhǔn)化動(dòng)物房飼養(yǎng)，于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部購(gòu)置。

2)主要試劑：Masson試劑盒(南京建成生物工程研究所)；即用型免疫組化試劑盒(邁新試劑)；轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000(Invitrogen)；BCA 試劑盒(Thermo)；ECL 超敏發(fā)光液(Bio-Rad)兔抗PKCα、p-PKCα多克隆抗體(Cell Signaling)；鼠抗α-SMA單克隆抗體和兔抗 LC3 多克隆抗體(Sigma)；羊抗兔IgG-HRP,羊抗鼠IgG-HRP(Cell Signaling)；PKCα siRNA和Negative Control由北京歐林格生物科技有限公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1) 細(xì)胞培養(yǎng)及PKCα siRNA轉(zhuǎn)染：在37℃,5% CO2的條件下用低糖培養(yǎng)基中加入20% FBS培養(yǎng)人肝細(xì)胞系L02細(xì)胞(ATCC)。將L02細(xì)胞經(jīng)胰酶消化接種于六孔板中，然后采用Lipo2000介導(dǎo)的方法將PKCα siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，最后收集細(xì)胞，提取蛋白用于Western Blot檢測(cè)。

2) 動(dòng)物模型制作：20只C57BL/6小鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)，雄性，20只小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和膽管結(jié)扎模型組，每組各10只。模型組采用腹腔注射4%水合氯醛200ul將其麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)，沿腹中線打開腹腔，沿十二指腸起始端找到膽總管并將其分離結(jié)扎，縫合關(guān)腹；假手術(shù)組：麻醉后打開腹腔，游離膽總管，縫合關(guān)腹[10]。術(shù)后正常飲食喂養(yǎng)。手術(shù)4周后處死小鼠，取肝組織用于免疫組織化學(xué)染色和Western Blot檢測(cè)。

3) 肝臟病理學(xué)檢測(cè)：肝組織用10%福爾馬林固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟包埋制作石蠟切片后進(jìn)行HE染色和Masson染色，并于光鏡下觀察其病理變化。

4) 肝臟LC3免疫組織化學(xué)染色：石蠟切片常規(guī)脫蠟、入水，微波修復(fù)3 min后，晾至室溫后用試劑盒中的3%H2O2甲醇封閉其過(guò)氧化物酶，正常羊血清封閉30 min后，滴加稀釋后的一抗LC3(1∶200)，其中對(duì)照用PBS代替一抗，4℃過(guò)夜后，滴加二抗以及ABC復(fù)合物后用DAB顯色，蘇木精復(fù)染核，脫水透明后樹膠封片。顯微鏡下觀察并照相。

5) Western Blot檢測(cè)PKCα、p-PKCα以及LC3的表達(dá)：提取肝組織總蛋白，并用BCA試劑盒測(cè)定其濃度。取5μg總蛋白進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉1h后分別加入α-SMA、PKCα、p-PKCα以及LC3抗體(均為1:2000稀釋)，4℃孵育過(guò)夜，次日用TBST洗3次，然后分別加入二抗(1:3000稀釋)，室溫下孵育1h,TBST洗3次，采用Fusion Fx7曝光機(jī)器(法國(guó)Vilber Lourmat公司)掃膜并采集圖像，并用Image-J軟件分析其灰度值。

6) 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠肝臟病理學(xué)比較

HE染色顯示假手術(shù)組的小鼠肝臟表面光滑，邊緣整齊，未見纖維增生、肝細(xì)胞變性、炎性反應(yīng)，肝小葉和匯管區(qū)的形態(tài)結(jié)構(gòu)完整(圖1A)，而模型組可見肝細(xì)胞排列紊亂，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞散在變性、壞死，小葉周邊出現(xiàn)小膽管樣上皮細(xì)胞并增生(圖1B)。Masson染色顯示假手術(shù)組沒有或僅有少量纖維組織(圖1C)，而模型組中則纖維增生明顯(圖1D)。

2.2 小鼠肝組織中α-SMA、PKCα、p-PKCα以LC3的表達(dá)情況

Western blot 結(jié)果顯示：模型組α-SMA的表達(dá)增加(P<0.05)，表明膽管結(jié)扎誘導(dǎo)的肝纖維化模型制作成功。在纖維化模型組中發(fā)現(xiàn)PKCα、p-PKCα的表達(dá)量均較假手術(shù)組高(P<0.01)，而LC3的表達(dá)則顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

2.3 兩組小鼠LC3免疫組織化學(xué)染色結(jié)果比較

膽管結(jié)扎手術(shù)4周后，分別取兩組的肝組織進(jìn)行染色。免疫組織化學(xué)染色顯示模型組中LC3蛋白的陽(yáng)性面積明顯少于假手術(shù)組，見圖3。

A,HE staining of sham-operated group;B,HE staining of model group;C,Masson staining of sham-operated group;D,Masson staining of mode group (HE，×100；MASSON，×100)

圖1 肝組織病理學(xué)檢查

圖2 免疫印跡檢測(cè)兩組小鼠肝組織中α-SMA、PKCα、p-PKCα以LC3蛋白的表達(dá)

A：sham-operated group；B:model group(×100)

圖3 LC3 蛋白在小鼠肝組織中的免疫組織化學(xué)染色

2.4 肝細(xì)胞中轉(zhuǎn)染PKCα siRNA后，LC3蛋白的表達(dá)情況

以上結(jié)果顯示(圖2和圖3)，PKCα和P-PKCα在纖維化模型組表達(dá)增加，而LC3則表達(dá)減少，提示PKC信號(hào)通路的激活可能抑制自噬。因此，在體外培養(yǎng)的L02細(xì)胞內(nèi)，利用siRNA將PKCα敲降之后(P<0.01)，發(fā)現(xiàn)LC3的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)。見圖4。

圖4 免疫印跡檢測(cè)L02細(xì)胞轉(zhuǎn)染PKCα siRNA后，PKCα和LC3蛋白的表達(dá)情況(A)及其灰度值分析統(tǒng)計(jì)圖(B)。*P<0.01

3 討論

肝纖維化是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程，其中包含多個(gè)細(xì)胞因子和信號(hào)通路共同參與其發(fā)生發(fā)展過(guò)程[11]。研究的較為清楚的主要有TGFβ-Smad[12]、MAPK、PI3K[13]及PKC信號(hào)通路。其中PKC是一種磷脂依賴性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，是細(xì)胞內(nèi)傳遞信號(hào)的重要介質(zhì)。根據(jù)其激活方式的不同，主要分為三大類：經(jīng)典型PKC、新型PKC、非典型PKC[14]。而已有研究證明經(jīng)典型PKC中的PKCα在促進(jìn)肝纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[15]。

在生理情況下自噬主要維持細(xì)胞功能的穩(wěn)定，細(xì)胞自噬是個(gè)程序化的動(dòng)態(tài)過(guò)程，首先形成雙層膜的囊泡結(jié)構(gòu)，將要消化的物質(zhì)包裹起來(lái)后，溶酶體與其外層膜融合成為自噬溶酶體。在自噬體形成過(guò)程中，構(gòu)成囊泡膜結(jié)構(gòu)的蛋白-微管相關(guān)蛋白1輕鏈3會(huì)不斷地由Ι型轉(zhuǎn)化為Ⅱ型，因此LC3Ⅱ與LC3Ⅰ的比例是反映自噬流量的重要指標(biāo)[16]。

肝纖維化過(guò)程中，肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cell,HSC)的激活居于主要地位，同時(shí)膠原蛋白合成增加降解減少造成ECM的積累增加，使得部分肝細(xì)胞缺氧、供給不足。因此可以通過(guò)提高HSC細(xì)胞的自噬水平，減少纖維蛋白原的產(chǎn)生，從而保護(hù)肝細(xì)胞減少其損傷[17]。有研究證明自噬自噬增強(qiáng)劑Carbamazepine(CBZ)通過(guò)促進(jìn)α1-抗胰蛋白酶Z(α1 Antitrypsin Z,ATZ)的降解，從而緩解肝纖維化[18]。并且造血因子IL-3、TGFβ激酶1(TAK1)能抑制自噬，而在我們的研究中發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)PKCα信號(hào)通路的激活可能抑制自噬的發(fā)生。既往研究表明PKC的激活使LC3 Thr6和Thr29位點(diǎn)的磷酸化，同時(shí)LC3Ⅰ向LC3Ⅱ蛋白的轉(zhuǎn)化減少，使得自噬小體形成減少，從而抑制自噬[19]。而PKCα信號(hào)通路如何調(diào)控自噬的機(jī)制尚不明確，仍需進(jìn)一步研究，以便為肝纖維化的進(jìn)一步治療提供理論依據(jù)。

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The role of PKC-mediated autophagy in liver fibrosis

YINRui-li,SHIJia-hong,ZHOUDe-shan*.

(DepartmentofHistologyandEmbryology,CapitalMedicalUniversity，Beijing100069,China)

Objective To explore the change and importance of PKC-mediated autophagy in mice liver fibrosis tissue.Methods The C57BL/6 mice were randomly divided into two groups:the bile duct ligation model and sham-operated groups.Mice in the model group were treated with bile duct ligation for induced liver fibrosis.After 4 weeks of operation,the degree of hepatic fibrosis was evaluated by HE and Masson staining,firstly.Subsequently,the expression of LC3 in liver tissues was detected by immunohistochemistry assay,and expressions of α-SMA,PKCα,p-PKCα and LC3 in liver tissues were also determined by Western Blot.Finally,the expression of LC3 was detected in L02 cells transfected with PKCα siRNA and the relationship between PKCα and LC3 was assessed.Results More fibrotic liver tissues were found in model group according to HE and Masson staining.As a result,the expression of α-SMA,PKCα and p-PKCα were significantly increased (P<0.01),while that of LC3 was decreased (P<0.01) in liver tissues from model group as compared with those from the sham-operated group by Western Blot and Immunohistochemistry assay.After transfection of PKCα siRNA in L02 cells,the level of LC3 was upregulated (P<0.01).Conclusion The inhibition of autophage by PKCα pathway may contribute to the occurrence and development of liver fibrosis.

Bile duct ligation-induced liver fibrosis;PKCα;LC3;autophagy

1007-4287(2017)01-0135-05

R575.2

A

2016-03-16)

*通訊作者