循環(huán)microRNA對非小細(xì)胞肺癌診斷和化療效果評價(jià)的研究

王丹丹，劉牟林,李士軍*

(1.遼寧省人民醫(yī)院，遼寧 沈陽110016;2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科)

循環(huán)microRNA對非小細(xì)胞肺癌診斷和化療效果評價(jià)的研究

王丹丹1，劉牟林2,李士軍2*

(1.遼寧省人民醫(yī)院，遼寧 沈陽110016;2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科)

目的 探討血清中miR-19b，miR-125b，miR-34a，miR-200b的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，以及這4種microRNAs在化療過程中表達(dá)水平的變化和對患者化療的監(jiān)測效果。方法 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)技術(shù)檢測43例健康體檢者和非小細(xì)胞肺癌患者血清中miR-19，miR-125b，miR-34a，miR-200b的表達(dá)水平，以及化療過程中的表達(dá)變化，比較第二次、第六次化療后microRNAs的表達(dá)差異。結(jié)果 與健康對照組相比，非小細(xì)胞肺癌患者血清中miR-19b，miR-125b和miR-200b表達(dá)上調(diào)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)；miR-34a表達(dá)下調(diào)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。在化療期間，miR-19b、miR-125b的表達(dá)隨著化療的進(jìn)行而降低，第六次化療后與第二次化療后相比表達(dá)下降(P<0.05)。結(jié)論 血清miR-19b，miR-125b，miR-34a和miR-200b可作為NSCLC的輔助診斷指標(biāo)；miR-19b，miR-125b可作為NSCLC患者化療效果評價(jià)的潛在標(biāo)志物。

非小細(xì)胞肺癌；miR-19b；miR-125b；化療

(ChinJLabDiagn,2017,21:0036)

肺癌是目前世界上最常見的惡性腫瘤之一，也是腫瘤致死原因中的第一位，治療效果欠佳，預(yù)后較差[1]，尋找與肺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的標(biāo)志物，對于提高肺癌的診斷和治療效果極其重要。

循環(huán)microRNA是一類以游離形式存在于血清、血漿等機(jī)體體液中的microRNA[2]，當(dāng)機(jī)體發(fā)生病變時(shí)，可通過某些機(jī)制直接或間接地破壞機(jī)體內(nèi)循環(huán)microRNAs的穩(wěn)定狀態(tài)，出現(xiàn)差異性表達(dá)。

當(dāng)機(jī)體發(fā)生腫瘤時(shí)，很多循環(huán)microRNA會發(fā)生表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，表現(xiàn)出相應(yīng)的促癌或抑癌作用[3]。本研究通過Real-time PCR的方法檢測健康體檢者和非小細(xì)胞肺癌患者血清中miR-19b，miR-125b，miR-34a和miR-200b的表達(dá)變化，以及化療過程中這4種microRNA的特征性表達(dá)，探討血清miR-19b，miR-125b，miR-34a和miR-200b與非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系以及對非小細(xì)胞肺癌患者化療的監(jiān)測效果。

1 材料與方法

1.1 樣本獲取 選取2014年3月到2015年1月期間在大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院入院并確診的43例原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌。平均年齡64.28歲，男性29例，女性14例；腺癌19例，鱗癌16例，大細(xì)胞癌8例；TNM分期：IIIA期11例，IIIB期7例，IV期25例。在非小細(xì)胞肺癌患者第一次化療前1-3日，以及第二、四、六次化療用藥結(jié)束后1-3日采集靜脈血，取血清備用。同時(shí)選取健康體檢者43例作為對照組。本研究涉及的被測試者都已告知了研究目的，并簽署了知情同意書。

1.2 試劑 血清RNA的提取試劑miRNeasy Serum/Plasma Kit(Qiagen)，組織RNA提取試劑RNAiso Plus(Takara)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)，SYBR green qRT-PCR assay(Takara)。

1.3 血清RNA的提取 將血清樣品用QIAzol Lysis Reagent裂解，加入miRNeasy Serum Spike-In Control，氯仿等混勻，離心取上清層，加入無水乙醇洗滌，過RNeasy MinElute spin column濃集RNA，將RNA純化后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 Real-time PCR 測定RNA的濃度和純度后，利用microRNA reverse transcription kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒和microRNA的特異性引物將RNA反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。反應(yīng)條件為：25℃，30 min；42℃，30 min；85℃，5 min；4℃保存。然后在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上，按照程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃，3 min；95℃，12 s；62℃，40 s；40個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)以U6作為內(nèi)參，采用ΔΔct相對定量法測定血清中microRNA的表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)都采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。組間microRNA的表達(dá)差異采用Wilcoxon tests方法檢驗(yàn)；χ2test用來比較microRNAs與NSCLC患者臨床病理因素的相關(guān)性；ANOVA test用于檢驗(yàn)microRNAs與TNM分期的關(guān)系，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RNA的提取 本實(shí)驗(yàn)采用miRNeasy Serum/Plasma Kit提取血清RNA，提取的RNA經(jīng)微量核酸測定儀NanoDrop 2000測定濃度及純度，其OD260/280在1.8-2.0范圍內(nèi)。

2.2 循環(huán)microRNAs在非小細(xì)胞肺癌患者血清中的表達(dá) 與健康對照組相比，血清中4種microRNAs的表達(dá)存在差異，miR-125b的表達(dá)明顯高于健康對照組，P<0.01；miR-19b與miR-200b也高于健康對照組，P<0.05；miR-34a表達(dá)下降，P<0.05(圖1)。

圖1 血清中4種microRNAs的表達(dá)

2.3 循環(huán)microRNAs對非小細(xì)胞肺癌診斷的評價(jià) miR-19b、miR-125b、miR-34a和miR-200b的ROC曲線下面積分別是0.873，0.826，0.730和0.870。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)AUC=0.5時(shí)，表示完全無診斷價(jià)值；當(dāng)0.5

2.4 循環(huán)microRNAs與非小細(xì)胞肺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性 miR-19b、miR-125b、miR-34a和miR-200b在非小細(xì)胞肺癌患者血清中的表達(dá)與其年齡、性別、吸煙、病理類型等無相關(guān)性。但miR-19b，miR-125b，miR-200b的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)；miR-34a的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移沒有相關(guān)性(P>0.05)(表1)。

2.5 循環(huán)microRNAs對非小細(xì)胞肺癌患者化療效果的監(jiān)測 根據(jù)RECIST標(biāo)準(zhǔn)、CT結(jié)果和腫瘤標(biāo)志物對化療效果的評價(jià)，將患者分為完全緩解(CR)，部分緩解(PR)，病變穩(wěn)定期(SD)及病變進(jìn)展期(PD)，其中化療有效組(CR+PR)25例，化療無效組(SD+PD)18例。在化療有效組(CR+PR)，患者血清中miR-19b，miR-125b的表達(dá)逐漸下降，第六次化療后與第二次化療相比表達(dá)降低(P<0.05)。在化療無效組(SD+PD)中結(jié)果正好相反，患者血清中miR-19b和miR-125b表達(dá)持續(xù)升高，在末次化療和第二次化療相比存在差異(P<0.05)。miR-34a無論是在化療有效組還是化療無效組，各化療階段的表達(dá)均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。在化療有效組和化療無效組中，患者在各化療階段血清中miR-200b的表達(dá)都下降，且第二次化療與第六次化療相比，miR-200b的表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(表2)。

圖2 A.miR-19b ROC曲線 B.miR-125b ROC曲線 C.miR-34a ROC曲線 D.miR-200b ROC曲線

miR-19b高(n=23)低(n=20)PmiR-125b高(n=25)低(n=18)P年齡(%)0.77990.655 <609(56.3)7(43.8)10(62.5)6(37.5) ≥6014(51.9)13(48.1)15(55.6)12(44.4)性別(%)0.10450.927 男18(62.1)11(37.9)17(58.6)12(41.4) 女5(35.7)9(64.3)8(57.1)6(42.9)吸煙(%)0.19060.014 吸煙16(61.5)10(38.5)19(73.1)7(26.9) 不吸煙7(41.2)10(58.8)6(35.3)11(64.7)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(%)0.0041*0.001** 無5(27.8)13(72.2)5(27.8)13(72.2) 有18(72.0)7(28.0)20(80.0)5(20.0)病理(%)0.2700.343 腺癌12(63.2)7(63.8)11(57.9)8(42.1) 鱗癌6(37.5)10(62.5)11(68.8)5(31.3) 大細(xì)胞癌5(62.5)3(37.5)3(37.5)5(62.5)

表2 4種microRNAs在化療期間的相對表達(dá)量

3 討論

肺癌是全世界范圍內(nèi)發(fā)病率、死亡率最高的腫瘤之一，2009年，中國肺癌患者的發(fā)病率和死亡率居惡性腫瘤首位[4]。非小細(xì)胞肺癌患者的發(fā)病率占肺癌發(fā)病率的80%，因NSCLC起病隱匿，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于晚期階段，目前對NSCLC的治療主要是化療。雖然肺癌的診斷、治療技術(shù)不斷提高，患者的5年生存率也有所上升，但肺癌依然是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一[5]，雖然對NSCLC的研究和治療已經(jīng)有了一定的進(jìn)展，仍然缺乏對NSCLC診斷、治療指導(dǎo)、療效評估的有效生物學(xué)指標(biāo)。

大量研究已表明，microRNAs在腫瘤診斷、療效判斷等方面具有一定的優(yōu)勢：①microRNAs可參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，在不同的腫瘤組織中，其表達(dá)呈現(xiàn)出特征性的改變[6]；②microRNAs的表達(dá)具有組織特異性，可作為一種新的標(biāo)志物準(zhǔn)確判斷腫瘤組織的來源[7]；③microRNAs的表達(dá)具有階段特異性，在腫瘤的不同分期，microRNAs呈現(xiàn)出不同的表達(dá)譜[8]；④microRNAs是一種小分子，比mRNA更為穩(wěn)定，檢測更為準(zhǔn)確[9]；⑤人體體液如血漿或血清中的循環(huán)microRNAs與腫瘤密切相關(guān)，并能被穩(wěn)定的檢測出來，使循環(huán)microRNAs作為一種新的反映腫瘤狀態(tài)的標(biāo)志物，擁有良好的臨床應(yīng)用前景[10]。另外，循環(huán)microRNAs在血清中穩(wěn)定性好，與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)，且血清標(biāo)本容易獲得，可對健康人群進(jìn)行早期的腫瘤篩查，還可對腫瘤患者的治療效果和預(yù)后進(jìn)行動態(tài)評估，奠定了循環(huán)microRNAs成為理想腫瘤標(biāo)志物的基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)，與健康體檢者相比，非小細(xì)胞肺癌患者血清中miR-19b，miR-125b，miR-200b表達(dá)升高，miR-34a表達(dá)降低，說明在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中，這4種microRNAs呈現(xiàn)出特征性的表達(dá)，可能參與了NSCLC的發(fā)生發(fā)展過程，通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，miR-19b，miR-125b，miR-200b對NSCLC的診斷準(zhǔn)確性較好，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，可作為NSCLC診斷的輔助診斷指標(biāo)，同時(shí)也可作為判斷患者是否出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的輔助標(biāo)志物。在NSCLC患者接受化療過程中，miR-19b，miR-125b也呈現(xiàn)出特異性表達(dá)。在化療有效組(完全緩解CR+部分緩解PR)中，miR-19b，miR-125b表達(dá)逐漸下降，第六次化療后與第二次化療后相比，表達(dá)明顯降低，在化療無效組(病情穩(wěn)定期SD+病變進(jìn)展期PD)中結(jié)果正好相反，說明血清miR-19b，miR-125b的表達(dá)水平可以反映患者的化療效果，可以作為患者化療效果評價(jià)的輔助標(biāo)志物，當(dāng)化療過程中血清miR-19b，miR-125b表達(dá)降低時(shí)，說明化療有效，當(dāng)其表達(dá)升高時(shí)，說明該化療方案對患者效果欠佳，應(yīng)及時(shí)改變化療方案，以確?；颊叩闹委熜Ч?。因此，我們推測miR-19b，miR-125b與NSCLC的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，在化療過程中可表現(xiàn)出相應(yīng)的變化，可作為NSCLC的輔助診斷標(biāo)志物和化療效果評價(jià)標(biāo)志物。

[1] Meng J,Xie W,Cao L,et al.shRNA targeting HDGF suppressed cell growth and invasion of squamous cell lung cancer[J].Acta Bioc Biop Sin,2010,42(1):52.

[2]Wozniak MB,Scelo G,Brennan P,et al.Circulating MicroRNAs as Non-Invasive Biomarkers for Early Detection of Non-Small-Cell Lung Cancer[J].PLoS One,2015,10(5):e0125026.

[3]Lawrie CH,Gal S,Pulford K,et al.Detection of elevated levels of tumour-associated microRNAs in serum of patients with diffuse large B-cell lymphoma[J].Br J Haematol,2008.141(5):672.

[4]Chen W,Zheng R,Zhang S,et al.The incidences and mortalities of major cancers in China[J].Chin J Cancer,2013,32(3):106.

[5]Rebecca S,Deepa N,Ahmedin J,et al.Cancer Statistics[J].CA Cancer J Clin,2013,34(4):24.

[6]Mar-Aguilar F,Mendoza-Ramírez JA,Reséndez-Pérez D,et al.Serum circulating microRNA profiling for identification of potential breast cancer biomarkers[J].Dis Markers,2013,34(3):163.

[7]Rosenfeld N,Aharonov R,Meiri E,et al.MicroRNAs accurately identify cancer tissue origin[J].Nat Biotechnol,2008,26(4):462.

[8]Malumbres R,Sarosiek KA,Cubedo E,et al.Differentiation stage-specific expression of microRNAs in B lymphocytes and diffuse large B-cell lymphomas[J].Blood,2009,113(16):3754.

[9]Liu A,Tetzlaff MT,Vanbelle P,et al.MicroRNA expression profiling outperforms mRNA expression profiling in formalin-fixed paraffin-embedded tissues[J].Int J Clin Exp Pathol,2009,2(6):519.

[10]Brase JC,Wuttig D,Kuner R,et al.Serum microRNAs as non-invasive biomarkers for cancer[J].Mol Cancer,2010,9:306.

The Study of circulating microRNA on Diagnosis and Evaluation of Chemotherapy for Non-small Cell Lung ancer

WANGDan-dan,LIUMu-lin,LiShi-jun.

(People’sHospitalofLiaoningProvince,Shenyang110016,China)

Objective To explore the correlation between serum expression of miR-19b,miR-125b,miR-34a,miR-200b with the development of non-small cell lung cancer,the expression changes of these four microRNAs during chemotherapy and the function of chemotherapy monitoring.Methods Real-time PCR was used to detect the expression change of serum miR-19b,miR-125b,miR-34a and miR-200b of 43 cases healthy volunteers and non-small cell lung cancer patients.And also detected the expression changes of these four microRNAs during chemotherapy.To observe the differential expression between the second and sixth chemotherapy.Results Compared with the healthy control group,serum miR-19b,miR-125b,miR-34a and miR-200b expressed differentially in patients of non-small cell lung cancer (P<0.05 ).The expression of miR-19b,miR-125b,miR-200b was up-regulated and related with lymph node metastasis.miR-34a was down-regulated but not related with lymph node metastasis.The expression of miR-19b,miR-125b were decreased when the patients received chemotherapy,and the expression were lower after the sixth cycle of chemotherapy than the second (P<0.05).Conclusion The serum expression of miR-19b,miR-125b,miR-34a and miR-200b could be applied diagnostic markers for NSCLC;miR-19b,miR-125b could act as potential biomarkers of chemotherapy evaluation for NSCLC patients.

Non-small cell lung cancer;miR-19b;miR-125b;Chemotherapy

1007-4287(2017)01-0036-05

R734.2

A

2015-09-18)

*通訊作者