胃癌合并Hp-L感染患者M(jìn)IF和MMP-9表達(dá)變化及其與血清炎癥因子的關(guān)系

陳曉露，羅 昊△，吳蓉宜

(1.樂(lè)山職業(yè)技術(shù)學(xué)院病理教研室，四川樂(lè)山 614000；2.四川省成都市第六人民醫(yī)院病理科 610051)

胃癌合并Hp-L感染患者M(jìn)IF和MMP-9表達(dá)變化及其與血清炎癥因子的關(guān)系

陳曉露1，羅 昊1△，吳蓉宜2

(1.樂(lè)山職業(yè)技術(shù)學(xué)院病理教研室，四川樂(lè)山 614000；2.四川省成都市第六人民醫(yī)院病理科 610051)

目的 研究胃癌合并幽門(mén)螺桿菌L型(Hp-L)感染患者促黑激素釋放抑制因子(MIF)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)表達(dá)變化及其與血清炎癥因子的關(guān)系。方法 用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)50例胃癌患者(觀察組)和50例健康志愿者(對(duì)照組)胃組織中MIF與MMP-9的表達(dá)，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6在兩組受試者血清中的水平，并用革蘭染色鏡檢兩組受試者胃組織中的Hp感染情況。結(jié)果 觀察組中Hp-L感染陽(yáng)性者有38例，感染率為76.00%，明顯高于對(duì)照組12例(24.00%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。觀察組胃組織中MIF、MMP-9的表達(dá)強(qiáng)于對(duì)照組，同時(shí)合并Hp-L感染陽(yáng)性者組織中MIF、MMP-9的表達(dá)強(qiáng)于Hp-L感染陰性者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。觀察組患者血清IL-1β、IL-6的濃度高于對(duì)照組，合并Hp-L感染陽(yáng)性者IL-1β、IL-6的濃度高于Hp-L感染陰性者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 MIF、MMP-9、IL-1β、IL-6與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，其機(jī)制也與Hp-L感染有關(guān)。

螺桿菌，幽門(mén)；螺桿菌感染；胃腫瘤；白細(xì)胞介素1β；白細(xì)胞介素6

胃癌已經(jīng)成為我國(guó)嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康和生命的惡性腫瘤之一，可導(dǎo)致嘔吐、上腹不適、進(jìn)食后飽脹等癥狀，且有逐年增高趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著人們的身體健康[1]。胃癌在任何年齡階段均可發(fā)生，其中以40～60歲的中老年常見(jiàn)，男女發(fā)病比率約為2∶1，但其發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，可能與生活習(xí)慣、環(huán)境因素、精神因素、遺傳素質(zhì)、Hp-L感染等多種因素有關(guān)，也與慢性胃炎,胃息肉,胃黏膜異形增生和腸上皮化生,手術(shù)后殘胃有關(guān)[2]。有研究表明，60%以上的胃癌患者均感染幽門(mén)螺桿菌(Hp)，而Hp-L是HP的異變類(lèi)型，具有更強(qiáng)的致癌作用，其感染是影響胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移的重要原因之一，感染后可致使胃黏膜慢性炎癥反應(yīng)的發(fā)生，進(jìn)而損傷周?chē)＝M織，使黏膜上皮細(xì)胞急劇增殖，進(jìn)一步導(dǎo)致患者的病情惡化[3]。因此，如何有效診治和監(jiān)測(cè)胃癌及其病情變化對(duì)提高患者臨床療效具有重要的意義。對(duì)此，本研究通過(guò)檢測(cè)胃癌患者和正常人員促黑激素釋放抑制因子(MIF)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的表達(dá)變化及其血清炎癥因子的濃度變化，探討上述因子與Hp-L型感染的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年5月至2015年5月在成都市第六人民醫(yī)院經(jīng)胃鏡病理活檢證實(shí)為胃癌的患者50例作為觀察組，其中男32例，女18例，年齡33～65歲，平均(45.23±7.12)歲。同時(shí)，選取50例健康志愿者作為對(duì)照組，其中男28例，女22例，年齡35～68歲，平均(47.05±7.99)歲。兩組資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)法 按照Elivision兩步法操作，各抗體最佳稀釋濃度為MIF(1∶120)，MMP-9(1∶150)，各因子陽(yáng)性對(duì)照為MIF(乳腺癌)，MMP-9(肝癌)，陰性對(duì)照均以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替。所有切片均由3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，抗原加熱修復(fù)，4 ℃孵育過(guò)夜，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè) 用抗人白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6抗體包被酶標(biāo)板，血清中的人IL-1β、IL-6會(huì)與包被抗體結(jié)合，洗去游離部分，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人IL-1β、IL-6抗體，使其與結(jié)合在包被抗體上的人IL-1β、IL-6結(jié)合，再次洗去游離部分，加入TMB顯色，在辣根過(guò)氧化物酶催化下，TMB呈藍(lán)色，加入終止液后呈黃色，用酶標(biāo)儀分別測(cè)吸光度，計(jì)算血清中IL-1β、IL-6的濃度。

1.2.3 革蘭染色法 革蘭染色包括怵然、煤染、脫色、復(fù)染等步驟，具體如下：石蠟切片，結(jié)晶紫初染30 s，沖洗，碘液復(fù)染1 min，95%乙醇脫色30 s，沖洗，稀釋復(fù)紅復(fù)染2 min，沖洗，中性樹(shù)膠封片，油鏡觀察。

1.2.4 結(jié)果判定

1.2.4.1 MIF、MMP-9免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷[4]MIF、MMP-9均定位于細(xì)胞質(zhì)，陽(yáng)性為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，按染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占腫瘤細(xì)胞的百分比綜合計(jì)分。染色強(qiáng)度；無(wú)染色0分；淡黃色1分；棕黃色2分；棕褐色3分。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)：0～5% 0分；>5%～25% 1分；>25%～50% 2分；>50% 3分。把染色強(qiáng)度得分與陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)得分相加：0～3分為陰性，≥3分為陽(yáng)性。

1.2.4.2 Hp-L檢測(cè)結(jié)果判斷[5]油鏡下(10×100)閱片并計(jì)數(shù)，每例觀察10～15個(gè)視野，取其平均數(shù)，均數(shù)大于或等于20為陽(yáng)性，<20或未查見(jiàn)為陰性，革蘭染色陽(yáng)性呈藍(lán)紫色，陰性呈紅色，Hp及其L型多呈革蘭染色陰性。

2 結(jié) 果

2.1 兩組受試者Hp-L感染情況 經(jīng)革蘭染色鏡檢，觀察組中Hp-L感染陽(yáng)性者有38例，感染率為76.00%，明顯高于對(duì)照組12例(24.00%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 兩組受試者組織中MIF、MMP-9的表達(dá) 觀察組胃組織中MIF、MMP-9的表達(dá)強(qiáng)于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1。

2.3Hp-L感染陽(yáng)性與Hp-L感染陰性組織中MIF、MMP-9的表達(dá)情況比較 在觀察組中，合并Hp-L感染陽(yáng)性者組織中MIF、MMP-9的表達(dá)強(qiáng)于Hp-L感染陰性者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而在對(duì)照組中，MIF、MMP-9的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表1 兩組受試者組織中MIF、MMP-9的表達(dá)情況

表2 Hp-L感染陽(yáng)性與Hp-L感染陰性組織中MIF、MMP-9的表達(dá)情況比較

2.4 兩組受試者血清中炎癥因子的濃度比較 觀察組患者血清IL-1β、IL-6的濃度高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表3。

表3 兩組受試者血清中IL-1β、IL-6的濃度比較

2.5Hp-L感染陽(yáng)性與Hp-L感染陰性血清中炎癥因子的濃度比較 在觀察組中，合并Hp-L感染陽(yáng)性者IL-1β、IL-6的濃度高于Hp-L感染陰性者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而在對(duì)照組中，IL-1β、IL-6的濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表4。

表4 Hp-L感染陽(yáng)性與Hp-L感染陰性患者血清中IL-1β、IL-6的濃度比較

3 討 論

隨著社會(huì)的進(jìn)步，醫(yī)學(xué)的發(fā)展，預(yù)防和控制胃癌已成為人類(lèi)關(guān)注的問(wèn)題之一。研究指出，Hp是人體內(nèi)最常見(jiàn)的細(xì)菌病原體之一，寄居于人體胃幽門(mén)部[6]。很多人受到過(guò)Hp的感染，這種細(xì)菌感染人體后，首先引發(fā)慢性胃炎，導(dǎo)致胃萎縮和胃潰瘍，嚴(yán)重者則發(fā)展成胃癌。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在較早年齡初次感染Hp的人群發(fā)生萎縮性胃炎及胃癌的概率較高，且胃癌病死率的高低與Hp感染呈平行關(guān)系。據(jù)此，專家們認(rèn)為，及早發(fā)現(xiàn)Hp感染者，及時(shí)而有效地殺滅Hp，可以有效預(yù)防和控制胃癌的發(fā)生[7-8]。

有研究發(fā)現(xiàn)，MIF在參與胃部炎癥發(fā)生的過(guò)程與Hp-L感染有有一定的聯(lián)系[9]。主要體現(xiàn)在胃黏膜炎癥組織中，Hp-L型可刺激巨噬細(xì)胞與T細(xì)胞分泌MIF，增加MIF的表達(dá)。

而包泱等[10]研究顯示，MMP-9是一種基質(zhì)金屬蛋白酶，在血管形成過(guò)程中具有強(qiáng)力的酶催化作用，其表達(dá)水平與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，其在胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用。對(duì)此，本研究通過(guò)觀察胃癌患者和正常人員的MIF、MMP-9表達(dá)變化及其血清炎癥因子的濃度變化，發(fā)現(xiàn)觀察組胃組織中MIF、MMP-9的表達(dá)強(qiáng)于對(duì)照組，且胃癌合并Hp-L感染陽(yáng)性者組織中MIF、MMP-9的表達(dá)強(qiáng)于Hp-L感染陰性者，此結(jié)果與已有研究基本相符，表明二者的表達(dá)與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，且Hp-L感染可上調(diào)胃癌組織中MIF、MMP-9的表達(dá)[11]。本研究結(jié)果提示，胃癌在癌變過(guò)程中，患者在感染Hp-L后，Hp-L可合成分泌大量的毒性細(xì)胞因子，引起胃部的炎癥反應(yīng)及損傷胃黏膜組織，進(jìn)而使胃部微環(huán)境平衡進(jìn)一步受到破壞，使正常細(xì)胞更易發(fā)生癌變。而MIF是體內(nèi)一種重要的多功能細(xì)胞因子，主要由T細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分泌，可以抑制單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的移動(dòng)，使巨噬細(xì)胞活化從而提高巨噬細(xì)胞的黏附、吞噬和破壞能力，故在癌變過(guò)程中，可能由于癌細(xì)胞引起巨噬細(xì)胞的吞噬反應(yīng)，使MIF的分泌增多，隨著MIF表達(dá)水平上升，它又可以激活巨噬細(xì)胞，使其釋放氧自由基和NO，損害正常細(xì)胞，使細(xì)胞發(fā)生惡性病變，從而形成惡性循環(huán)，進(jìn)一步促進(jìn)胃癌的發(fā)生、發(fā)展。而MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中相對(duì)分子質(zhì)量最大的酶，被激活后可以產(chǎn)生Ⅳ型膠原酶，破壞靠近正常細(xì)胞表面的細(xì)胞外基質(zhì)中Ⅳ型、Ⅴ膠原蛋白，可以降解血管基底膜，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的移動(dòng)遷徙，使血管形成加快，故在癌變過(guò)程中，可能由于需要生成腫瘤血管，癌細(xì)胞促使大量MMP-9的合成與分泌以促進(jìn)血管的生成，從而進(jìn)一步促進(jìn)癌細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展[12]。因此，胃癌病變可引起組織中MIF、MMP-9表達(dá)上升，而Hp-L感染可進(jìn)一步促使胃癌的發(fā)生、發(fā)展，引起更劇烈的惡性病變，使MIF、MMP-9表達(dá)水平更高。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)觀察組患者血清中IL-1β、IL-6的濃度高于對(duì)照組，胃癌合并Hp-L感染陽(yáng)性者血清中IL-1β、IL-6的濃度高于Hp-L感染陰性者，說(shuō)明Hp感染后炎性反應(yīng)釋放各種細(xì)胞因子，如IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10等，從而促進(jìn)了胃癌的發(fā)展。此結(jié)果提示，在胃癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，由于損害了周?chē)恼＜?xì)胞，可引起機(jī)體的炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)等一系列病理反應(yīng)變化。而IL-1是一種重要的炎性介質(zhì)，具有介導(dǎo)炎癥發(fā)生的作用，主要在細(xì)胞免疫激活過(guò)程中起作用，其活性主要由IL-1β介導(dǎo)，IL-1β則是一種多效性、促炎性細(xì)胞因子，是體內(nèi)調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)的核心介質(zhì)，主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌，在炎癥信號(hào)刺激下，其合成和分泌水平會(huì)迅速升高[13-14]。IL-6是白細(xì)胞介素家族中的一員，由活化T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，可通過(guò)促進(jìn)原始骨髓源細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，刺激參與至炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)的細(xì)胞增殖和分化，進(jìn)而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)[15-16]。因此，胃癌病變由于引起機(jī)體的炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)，故可引起患者血清中IL-1β、IL-6的上升，而Hp-L感染可通過(guò)損傷胃黏膜組織引起炎癥反應(yīng)，故患者合并Hp-L感染可使IL-1β、IL-6表達(dá)水平進(jìn)一步上升，因此檢測(cè)患者體液中IL-的6水平可反映患者的病情變化。

綜上所述，MIF、MMP-9、血清炎癥因子(主要是IL-1β、IL-6)與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，也與Hp-L感染有關(guān)。檢測(cè)患者體內(nèi)MIF、MMP-9、血清炎癥因子表達(dá)水平的變化，有利于醫(yī)師進(jìn)一步診治胃癌及掌握患者病情。

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陳曉露(1977-)，副教授，本科，主要從事病理學(xué)、免疫學(xué)方面研究?！?/p>

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10.3969/j.issn.1671-8348.2017.02.035

R735.2

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1671-8348(2017)02-0250-04

2016-07-16

2016-09-06)