辛伐他汀對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子及NF-κB通路表達(dá)的影響

羅 丹，郝 剛，林思思，夏宇軒，陳彤丹

(1.浙江省人民醫(yī)院藥學(xué)部，杭州 310014；2.江蘇省蘇州市食品藥品檢驗(yàn)所 215104)

辛伐他汀對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子及NF-κB通路表達(dá)的影響

羅 丹1，郝 剛2，林思思1，夏宇軒1，陳彤丹1

(1.浙江省人民醫(yī)院藥學(xué)部，杭州 310014；2.江蘇省蘇州市食品藥品檢驗(yàn)所 215104)

目的 探討辛伐他汀對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮(HUVEC)損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)原代HUVEC，將細(xì)胞分為3組：空白組、LPS組及辛伐他汀組?？瞻捉M無(wú)任何處理，LPS組用LPS刺激，辛伐他汀組先用辛伐他汀(處理濃度也分別為5、25、50 μmol/L)處理24 h，然后再用LPS處理。用熒光定量PCR的方法測(cè)定血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)、細(xì)胞間黏附分子(ICAM-1)和E選擇素(E-Selectin)的mRNA表達(dá)，用免疫印跡的方法測(cè)定VCAM-1及磷酸化p-105(p-p105)的蛋白表達(dá)。結(jié)果 LPS對(duì)HUVEC有明顯的損傷作用，導(dǎo)致VCAM-1、ICAM-1及E-Selectin表達(dá)顯著上升。辛伐他汀可以明顯減弱LPS對(duì)HUVEC的損傷作用，且效果呈劑量相關(guān)性。結(jié)論 辛伐他汀通過(guò)NF-κB途徑減弱LPS對(duì)HUVEC的損傷，起到保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用。

動(dòng)脈硬化；內(nèi)皮，血管；血管黏附分子；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；辛伐他?。籒F-κB通路

動(dòng)脈粥樣硬化(arteriosclerosis，AS)是冠心病、中風(fēng)等嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康疾病的共同病理基礎(chǔ)，已經(jīng)成為我國(guó)主要死亡原因之一。目前普遍認(rèn)為，AS是多種因素導(dǎo)致的復(fù)雜慢性炎癥過(guò)程，起始環(huán)節(jié)為動(dòng)脈內(nèi)皮的損傷、黏附分子的高表達(dá)，然后是白細(xì)胞與內(nèi)皮黏附、脂質(zhì)沉積、板塊形成等過(guò)程[1]。他汀類(lèi)藥物在降低血脂、預(yù)防AS等方面的作用已被大量循證醫(yī)學(xué)證據(jù)證實(shí)。近年有研究發(fā)現(xiàn)，他汀類(lèi)藥物還可以保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、降低黏附分子的表達(dá)，這些研究發(fā)現(xiàn)闡明了他汀類(lèi)藥物預(yù)防AS的其他途徑。本實(shí)驗(yàn)研究旨在探討辛伐他汀對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的保護(hù)作用，以及核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(NF-κB)通路是否參與了該保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 原代HUVEC購(gòu)自Allcell公司；培養(yǎng)基(ECM，包含牛血清、雙抗、原代HUVEC生長(zhǎng)所需的細(xì)胞因子)購(gòu)自Sciencell公司。實(shí)驗(yàn)用脂多糖(LPS)購(gòu)自Sigma公司；辛伐他汀購(gòu)自Merck公司。總RNA提取試劑盒UNIQ-10購(gòu)自生工公司；mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(FSQ101)購(gòu)自TOYOBO公司；qPCR檢測(cè)試劑盒SYBR購(gòu)自TAKARA公司；qPCR引物由生工合成。蛋白提取RIPA+PIC及蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA)試劑盒購(gòu)自Thermo公司；血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)抗體購(gòu)自Abcam公司；磷酸化p-105(p-p105)抗體購(gòu)自CST公司。

1.2 方法

1.2.1 HUVEC培養(yǎng)、分組及干預(yù) 采用Thermo培養(yǎng)箱，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)HUVEC，實(shí)驗(yàn)時(shí)采用第2～5代細(xì)胞。細(xì)胞處理時(shí)分為3組：空白組、LPS組及辛伐他汀組?？瞻捉M無(wú)任何處理，LPS組用0.2 μg/mL的LPS刺激6 h(用于mRNA檢測(cè))或24 h(用于蛋白檢測(cè))；辛伐他汀組先用辛伐他汀處理24 h(處理濃度分別為5、25、50 μmol/L)，然后再用LPS處理6 h或24 h。HUVEC的損傷反應(yīng)采用黏附分子的表達(dá)進(jìn)行判斷，在mRNA層面檢測(cè)VCAM-1、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)和E選擇素(E-Selectin)，在蛋白層面檢測(cè)VCAM-1，進(jìn)一步確認(rèn)該分子的表達(dá)。NF-κB通路的活化采用p105磷酸化水平進(jìn)行判斷，LPS刺激HUVEC 30 min后即提取細(xì)胞蛋白，用以檢測(cè)p-p105水平。

1.2.2 熒光定量PCR 采用生工公司的試劑盒提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后用SYBR進(jìn)行熒光定量檢測(cè)。檢測(cè)指標(biāo)為內(nèi)皮細(xì)胞損傷后表達(dá)的黏附分子，包括VCAM-1、ICAM-1和E-Selectin，內(nèi)參為GAPDH。檢測(cè)儀器為ABI 7500 Real-Time儀，反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s，(95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s)×40個(gè)循環(huán)。引物由生工合成，序列為:VCAM-1 F 5′-GCT GCT CAG ATT GGA GAC TCA-3′，R 5′-CGC TCA GAG GGC TGT CTA TC-3′；ICAM-1 F 5′-TCT GTG TCC CCC TCA AAA GTC-3′，R 5′-GGG GTC TCT ATG CCC AAC AA-3′；E-selectin F 5′-AAT CCA GCC AAT GGG TTC G-3′，R 5′-GCT CCC ATT AGT TCA AAT CCT TCT-3′；GAPDH F 5′-ATG GGG AAG GTG AAG GTC G-3′，R 5′-GGG GTC ATT GAT GGC AAC AAT A-3′。

1.2.3 蛋白印跡分析 采用RIPA+PIC提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。檢測(cè)指標(biāo)為VCAM-1蛋白和NF-κB通路的p-p105蛋白。上樣時(shí)，每孔加30 μg蛋白，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上，BSA封閉，按照1∶1 000比例稀釋后加入VCAM-1抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，次日TBST洗滌3次，每次10 min，然后按照1∶5 000稀釋加入二抗，室溫孵育1.5 h，再以TBST洗滌3次，每次10 min。曝光后用ImageJ分析條帶強(qiáng)度。

2 結(jié) 果

2.1LPS對(duì)HUVEC的損傷作用 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LPS組中VCAM-1、ICAM-1及E-Selectin的mRNA和VCAM-1蛋白的表達(dá)水平均顯著上升，與空白組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖1、2。

2.2 辛伐他汀對(duì)HUVEC的保護(hù)作用 辛伐他丁組中的3個(gè)亞組的黏附分子的mRNA和VCAM-1蛋白的表達(dá)水平均較LPS組降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1、2)。同時(shí)3個(gè)不同辛伐他丁濃度的亞組間比較也差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。辛伐他汀可抑制VCAM-1、ICAM-1及E-Selectin的mRNA和VCAM-1蛋白的表達(dá)，且抑制效果呈劑量相關(guān)性。

2.3 辛伐他汀對(duì)HUVEC保護(hù)作用的可能機(jī)制p-p105水平的蛋白印跡分析發(fā)現(xiàn)LPS組表達(dá)水平較空白組上升，而辛伐他丁組的3個(gè)亞組均較LPS組降低，且3個(gè)亞組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。LPS損傷HUVEC的信號(hào)通路可能為NF-κB途徑，辛伐他汀可抑制NF-κB通路保護(hù)HUVEC，且抑制效果呈劑量相關(guān)性。

圖1 各組黏附分子的mRNA水平表達(dá)

圖2 各組VCAM-1蛋白水平表達(dá)

圖3 各組HUVEC的p-p105表達(dá)

3 討 論

AS是一種慢性進(jìn)行性疾病，其形成涉及遺傳、血脂紊亂、高血壓、糖尿病、抽煙、細(xì)菌內(nèi)毒素、免疫紊亂等多種危險(xiǎn)因素。這些因素共同作用導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷，單核細(xì)胞黏附結(jié)合于內(nèi)皮細(xì)胞、進(jìn)入內(nèi)膜下，轉(zhuǎn)化形成巨噬細(xì)胞，進(jìn)而吞噬脂質(zhì)，形成泡沫細(xì)胞，最終推動(dòng)AS斑塊的進(jìn)展。因此內(nèi)皮細(xì)胞損傷作為AS的始動(dòng)環(huán)節(jié)，長(zhǎng)期以來(lái)受到研究者的重視。

他汀類(lèi)藥物是3-羥基3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，具有顯著降低膽固醇的作用，其對(duì)冠心病的治療已得到國(guó)際指南的廣泛認(rèn)可與推薦[2]。近些年研究發(fā)現(xiàn)他汀類(lèi)藥物還可以保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，但這些研究大多以觀察現(xiàn)象為主[3-6]，證實(shí)阿托伐他汀、瑞舒伐他汀等藥物可以減少黏附分子、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、低密度脂蛋白受體1(LOX-1)等表達(dá)，而并未對(duì)作用機(jī)制做深入探討。內(nèi)皮細(xì)胞損傷有多種信號(hào)途徑介導(dǎo)，包括受體酪氨酸激酶途徑、NF-κB途徑、絲裂原活化蛋白激酶途徑、活性氧途徑等[1]，其中NF-κB途徑最常見(jiàn)、也最被廣泛研究[7]。LPS、oxLDL、TNF-α等均可以激活內(nèi)皮細(xì)胞的NF-κB通路[8-9]。因此，阻斷NF-κB通路成為治療AS的新途徑[10]。本研究首先證實(shí)LPS能夠通過(guò)NF-κB途徑損傷HUVEC，導(dǎo)致后者高表達(dá)黏附分子，然后發(fā)現(xiàn)辛伐他汀能減弱LPS對(duì)HUVEC的損傷，并且證實(shí)該機(jī)制是通過(guò)NF-κB途徑完成的。

他汀類(lèi)藥物對(duì)NF-κB通路的作用，在其他細(xì)胞中已有研究者進(jìn)行了報(bào)道[11]，也有學(xué)者在小鼠缺血/復(fù)灌模型中證實(shí)他汀類(lèi)藥物可以通過(guò)NF-κB途徑改善心臟功能[12]。本研究提示，他汀類(lèi)藥物也可以在內(nèi)皮細(xì)胞中影響NF-κB通路，該發(fā)現(xiàn)有利于重新認(rèn)識(shí)他汀在冠心病治療中的作用。

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羅丹(1986-)，藥劑師，碩士，主要從事臨床藥學(xué)方面研究。

?驗(yàn)交流·

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.02.032

R541.4

B

1671-8348(2017)02-0243-03

2016-07-08

2016-10-18)