兩種培養(yǎng)基的培養(yǎng)體系對CIK細胞增殖和功能的影響

宋文玲，韓 蓉，張 曼，張 權(quán)，姚惟琦,3，武棟成,4

(1.湖北省武漢市黃陂區(qū)人民醫(yī)院暨江漢大學附屬第三醫(yī)院腫瘤三科 430060；2.武漢漢密頓生物科技股份有限公司研發(fā)部，武漢 430075；3.武漢大學第一臨床學院腫瘤中心，武漢 430060；4.武漢大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，武漢 430072)

兩種培養(yǎng)基的培養(yǎng)體系對CIK細胞增殖和功能的影響

宋文玲1，韓 蓉1，張 曼1，張 權(quán)2，姚惟琦2,3，武棟成2,4

(1.湖北省武漢市黃陂區(qū)人民醫(yī)院暨江漢大學附屬第三醫(yī)院腫瘤三科 430060；2.武漢漢密頓生物科技股份有限公司研發(fā)部，武漢 430075；3.武漢大學第一臨床學院腫瘤中心，武漢 430060；4.武漢大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，武漢 430072)

目的 觀察細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK細胞)增殖情況，檢測CIK細胞的表面分子表型和體外對白血病細胞K562的殺傷作用。方法 通過用H3培養(yǎng)基培養(yǎng)的分別來源于臍帶血和患者自體外周血分離的單個核細胞(PBMC)，添加重組人γ干擾素(IFN-γ)與CD3單抗，體外誘導CIK細胞，在培養(yǎng)的第7天分別加入H3培養(yǎng)基和T551培養(yǎng)基繼續(xù)誘導培養(yǎng)至14 d。計數(shù)觀察CIK細胞增殖能力，流式檢測細胞表面CD3、CD56的表達情況，CCK8法檢測兩組培養(yǎng)基條件下對白血病細胞K562的殺傷效果。結(jié)果 動態(tài)計數(shù)及表型分析結(jié)果表明，H3及H3+T551培養(yǎng)的CIK細胞擴增倍數(shù)(包括臍帶血CIK總細胞數(shù)和自體CIK總細胞數(shù))在第14天均分別達到76.9倍、62.3倍；兩種培養(yǎng)條件下臍帶血CIK細胞中 CD3+CD56+雙陽性細胞含量分別是(16.70±2.72)%和(10.80±2.59)%，自體CIK細胞中 CD3+CD56+雙陽性細胞含量分別是(11.23±6.64)%和(10.70±6.42)%；體外殺瘤實驗表明，當效靶比為5∶1時，H3培養(yǎng)的臍帶血CIK細胞殺傷率達到(33.50±9.99)%，顯著高于H3+T551培養(yǎng)臍帶血CIK細胞的(20.3±6.76)%，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.011),而H3和H3+T551培養(yǎng)的自體CIK細胞殺傷率分別是(59.67±27.59)%和(42.13±19.47)%，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.080)。結(jié)論 H3培養(yǎng)的臍帶血和自體CIK細胞具有較強的體外抗白血病癌細胞活性，可應用于臨床上白血病的過繼性免疫治療。

白血病，幼紅細胞，急性；CIK細胞；白血病細胞K562；H3培養(yǎng)基；T551培養(yǎng)基；殺傷率

體內(nèi)回輸免疫活性細胞的過繼免疫療法，具有一定的抗腫瘤效果，與其他抗腫瘤藥物相比，它能在沒有損傷機體免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)上，直接殺傷腫瘤細胞，并且調(diào)節(jié)和增強機體的免疫功能，故而成為放化療、腫瘤手術(shù)的重要輔助治療方法，為預防腫瘤復發(fā)、改善晚期患者的生存質(zhì)量提供了新的途徑[1-2]。為了得到更好的抗腫瘤效果，用于過繼免疫療法的免疫活性細胞必須具有較強的細胞毒活性和增殖力，研究結(jié)果顯示細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine induced killer cells，CIK 細胞)可以滿足過繼免疫治療中對效應細胞的要求[3-4]。CIK細胞是將人外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，在體外用多種細胞因子如白細胞介素(IL)-2、IL-1α、γ-干擾素(IFN-γ)、CD3單克隆抗體(anti-CD3 monoclonal antibody，MabCD3)等共同培養(yǎng)一段時間后獲得的一群異質(zhì)細胞，兼有T淋巴細胞強大的抗瘤活性和自然殺傷(NK)細胞的非主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)限制性殺瘤優(yōu)點[5-7]，被認為是新一代抗腫瘤過繼細胞免疫治療的首選方案[8]。

急性白血病是一種源于造血干細胞某一單株細胞的惡性克隆性疾病，以兒童及青年居多，臨床診斷一般可分為急性淋巴性白血病和急性髓性白血病。目前化療是急性白血病的常規(guī)治療方法，但是其較大的不良反應限制了化療療效的進一步提高。細胞免疫治療有可能為急性白血病的治療提供有益幫助[9-10]。由于CIK細胞的增殖能力和殺瘤活性是影響細胞治療效果的重要因素，因此本研究擬通過觀察不同成分培養(yǎng)基制備的CIK細胞的增殖能力和對白血病K562細胞株的殺傷力，為提高CIK細胞療效提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 白血病細胞K562由武漢漢密頓生物科技股份有限公司實驗室提供。將K562用含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)，置于37 ℃含5%CO2細胞培養(yǎng)箱中。試劑：IL-2(美國PEPR0 TECH公司)，IFN-γ(美國PEPR0 TECH公司)，MabCD3(日本TaKaRa公司)。RPMI 1640 和胎牛血清(FBS，Gibco公司)，CCK-8(5 mg/mL，碧云天)，F(xiàn)ITC-抗CD3流式抗體和PECy5-抗CD56流失抗體(美國Biolegend公司)。

1.2 方法

1.2.1 效應細胞CIK細胞的制備 使用密度離心方法常規(guī)分離臍帶血和白血病患者外周血制備單核細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為(1～2)×106/mL進行培養(yǎng)，于培養(yǎng)第1天在H3培養(yǎng)體系中加入IFN-γ 2 000 U/mL，培養(yǎng)24 h后加入IL-2 1 000 U/mL，MabCD3 100 ng/mL，刺激CIK 細胞的生長和增殖。在培養(yǎng)的第7天,組1加入H3(含1 000 U/mL 的重組人IL-2)培養(yǎng)基，組2加入T551(含1 000 U/mL 的重組人IL-2)培養(yǎng)基繼續(xù)誘導培養(yǎng)至14 d，保證細胞生長密度在(1～2)×106/mL。計數(shù)培養(yǎng)第0、4、7、10及14天的CIK細胞的數(shù)量。

1.2.2 效應細胞的表型分析 取培養(yǎng)第14天的CIK細胞以流式抗體染色，流式細胞儀分析，測定CIK細胞CD3+CD56+雙陽性細胞的百分比。

1.2.3 CCK8法殺傷活性鑒定CIK對K562的殺傷作用 以不同效靶比(1∶1、2∶1、5∶1)將CIK效應細胞與K562細胞各50 μL，一起放入96孔培養(yǎng)板中，另設(shè)單獨靶細胞和單獨效應細胞對照孔,以及空白培養(yǎng)基對照孔，每組設(shè)3孔，37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)4 h，用CCK-8顯色法測定，確定各組吸光度值(A值)按下列公式計算殺瘤率[11-12]：殺傷活性(%)=[1-(實驗孔A值-效應細胞A值)/(靶細胞A值-空白孔A值)]×100%

2 結(jié) 果

2.1 兩種培養(yǎng)基體外誘導CIK細胞的增殖水平 實驗結(jié)果顯示，H3培養(yǎng)基培養(yǎng)的CIK細胞直至第4天后開始大量增殖，細胞數(shù)量呈非線形增長。從臍帶血分離的細胞繼續(xù)經(jīng)H3培養(yǎng)基培養(yǎng)至第7、10、14天時，至培養(yǎng)第7天約增加23.3倍，其后進入快速增長期，至第14天約增加76.9倍；繼續(xù)經(jīng)T551培養(yǎng)基培養(yǎng)至第7天約增加23.3倍，其后進入快速增長期，至第14天約增加62.3倍。同時，從外周血分離單個核細胞繼續(xù)經(jīng)H3培養(yǎng)基培養(yǎng)至第7、10、14天時，培養(yǎng)至第7天約增加20.2倍，其后進入快速增長期，至第14天約增加76.9倍；繼續(xù)經(jīng)T551培養(yǎng)基培養(yǎng)至第7天約增加17.5倍，其后進入快速增長期，至第14天約增加62.3倍(圖1)。兩種培養(yǎng)基體外誘導的CIK細胞第14天的形態(tài)學照片如圖2所示。

圖1 兩種培養(yǎng)基誘導不同來源CIK細胞的增殖水平

A：來源臍帶血，H3培養(yǎng)基；B:來源臍帶血，H3+T551培養(yǎng)基；C:來源自體，H3培養(yǎng)基；D:來源自體，H3+T551培養(yǎng)基。

圖2 兩種培養(yǎng)基誘導不同來源的CIK細胞形態(tài)(×100)

2.2 兩種培養(yǎng)基誘導的CIK細胞表型 隨著培養(yǎng)時間延長，H3和T551培養(yǎng)基培養(yǎng)的CIK細胞表達CD3+CD56+雙陽性細胞的比例逐漸增加，細胞培養(yǎng)至第14天時，流式細胞術(shù)進行檢測，結(jié)果如圖3所示。H3培養(yǎng)基誘導的臍帶血和自體CIK細胞中CD3+CD56+細胞百分比分別為(16.70±2.72)%和(11.23±6.64)%，T551培養(yǎng)基誘導的臍帶血和自體CIK細胞中CD3+CD56+細胞百分比分別為(10.80±2.59)%和(10.70±6.42)%，兩種培養(yǎng)基誘導第14天獲得的自體、臍帶血CIK細胞表型見表1、2。

2.3CIK細胞對K562的殺傷作用 當效靶比為1∶1時，H3培養(yǎng)基培養(yǎng)14d的臍帶血和自體CIK細胞殺瘤率分別是(12.33±12.49)%和(19.43±12.65)%，T551培養(yǎng)基培養(yǎng)14d的臍帶血和自體CIK細胞殺瘤率分別是(6.20±8.59)%和(16.23±8.63)%；當效靶比為2∶1時，H3培養(yǎng)基培養(yǎng)的臍帶血和自體CIK細胞殺瘤率分別是(19.97±16.68)%和(33.37±15.62)%，T551培養(yǎng)基培養(yǎng)14d的臍帶血和自體CIK細胞殺瘤率分別是(10.93±8.24)%和(25.38±10.99)%；當效靶比為5∶1時，H3培養(yǎng)基培養(yǎng)的臍帶血和自體CIK細胞殺瘤率分別是(33.50±9.99)%和(59.67±27.59)%，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.011)，H3+T551培養(yǎng)基培養(yǎng)14d的臍帶血和自體CIK細胞殺瘤率分別是(20.30±6.76)%和(42.13±19.47)%,差異無統(tǒng)計學意義(P=0.080)。CIK細胞對白血病K562細胞的殺傷作用與濃度有關(guān)。相同濃度下作用24h，H3培養(yǎng)基培養(yǎng)的CIK細胞的殺傷效率優(yōu)于T551培養(yǎng)基培養(yǎng)的CIK細胞，見表3。

圖3 兩種培養(yǎng)基誘導第14天T細胞表面CD3+和CD56+的表達

臍血CIK活細胞數(shù)(109)CD3+CD56+CD3-CD56+效應細胞數(shù)(109)N121.4019.80.94.43N218.7413.70.62.68H120.0314.73.43.63H217.3910.03.52.35M120.2515.60.33.22M219.988.70.31.80

N1、H1、M1和N2、H2、M2分別表示H3和T551培養(yǎng)基培養(yǎng)誘導第14天獲得的臍帶血CIK細胞，實驗重復3次。

表2 兩種培養(yǎng)基誘導第14天獲得的自體CIK細胞表型

5a、6a、7a和5b、6b、7b分別表示H3和T551培養(yǎng)基培養(yǎng)誘導第14天獲得的自體CIK細胞，實驗重復3次。

表3 CIK對K562的殺傷效率,%，n=3)

a:P<0.05，與H3+T551培養(yǎng)基培養(yǎng)。

3 討 論

免疫細胞過繼療法已成為放化療后腫瘤患者輔助治療的重要手段之一。CIK細胞是由人體血液中酶單個核細胞在體外條件下經(jīng)過多種細胞因子共同刺激誘導而成的[13-14]，是一類非主要組織相容性復合物和非T細胞受體限制性的免疫活性細胞，其主要效應細胞為CD3+CD56+雙陽性細胞[15]。

本研究顯示隨著培養(yǎng)時間的延長，H3和H3+T551培養(yǎng)基培養(yǎng)的CIK細胞的數(shù)量及CD3+CD56+雙陽性細胞的比例均升高。H3培養(yǎng)基體外培養(yǎng)14 d的臍帶血和自體CIK細胞其細胞數(shù)量增加76.9倍，同時表達CD3+CD56+雙陽性細胞的比例也達到較高水平，分別約為(16.70±2.72)%和(11.23±6.64)%；同時，H3+T551培養(yǎng)基體外培養(yǎng)14 d的CIK細胞其細胞數(shù)量增加62.3倍，同時表達CD3+CD56+雙陽性細胞的比例也達到較高水平。

本研究對比了相同效靶比及相同培養(yǎng)方式下同種來源兩的CIK細胞對K562的殺傷效率。相同效靶比的來源于臍帶血或自體CIK細胞，H3培養(yǎng)條件下對K562的殺傷效率高于H3+T551培養(yǎng)條件下對K562的殺傷效率，顯示CIK細胞能有效地殺傷K562細胞。尤其，當效靶比為5∶1時，H3培養(yǎng)基培養(yǎng)的臍帶血和自體CIK細胞殺瘤率分別是(33.50±9.99)%和(59.67±27.59)%，T551培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d的臍帶血和自體CIK細胞殺瘤率分別是(20.30±6.76)%和(42.13±19.47)%，但個體差異較大。來源臍帶血CIK細胞對K562具有較穩(wěn)定的殺傷作用，但來源自體的CIK細胞對K562具有較高的殺瘤率。結(jié)合圖2流式細胞分析可推測，H3和T551培養(yǎng)條件下，自體CIK在殺傷K562時伴隨NK細胞的殺傷作用，推測可能是H3和T551培養(yǎng)條件產(chǎn)生CIK細胞的同時，伴隨NK細胞產(chǎn)生，從而產(chǎn)生較高的殺瘤率。因此，臨床輸入CIK細胞治療腫瘤應達到一定的數(shù)量并維持一定時間，根據(jù)患者個體差異，若瘤體內(nèi)CIK細胞數(shù)量與腫瘤細胞數(shù)量之比能維持在5∶1水平以上，有望達到較好的治療效果。故而H3培養(yǎng)的臍帶血和自體CIK細胞具有較強的體外抗白血病癌細胞活性，可應用于臨床上白血病的過繼性免疫治療，并為臨床治療惡性腫瘤提供理論依據(jù)。

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Effects of two different cell culture medium on proliferative and functional activities of cytokine-induced killer cells

SongWenling1,HanRong1,ZhangMan1,ZhangQuan2,YaoWeiqi2,3,WuDongcheng2,4

(1.ThirdDepartmentofOncology,HuangpiDistrictPeople′sHospital/ThirdAffiliatedHospital,JianghanUniversity,Wuhan,Hubei430060,China;2.DepartmentofResearchandDevelopment,WuhanHamiltonBiotechnologyCo.,Ltd,Wuhan,Hubei430075,China;3.TumoprCenter,FirstClinicalCollegeofWuhanUniversity,WuhanUniversity,Wuhan,Hubei430060,China;4.SchoolofBasicMedicineSciences,WuhanUniversity,Wuhan,Hubei430072,China)

Objective To observe the proliferation ability of cytokine-induced killer(CIK) cells and to detect surface molecule phenotype of CIK cells and in vitro killing effect to leukemia K562 cells.Methods The cord blood lymphocytes and peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) from patients were cultured by the H3 medium and added with human recombinant interferon(IFN)-γ and CD3 monoclonal antibodies(mAb) for inducing CIK cells in vitro.The H3 medium and T551 medium were respectively added on 7 d of culture.The induction and culture were continued until 14 d.The CIK cells proliferation ability was observed by cell count and the expressions of CD3 and CD56 were detected by flow cytometry.The killing effect of CIK cells on leukemia cells was tested by CCK8 assays.Results The dynamic counting and phenotype analysis results revealed that the CIK cells amplification times(including cord blood CIK total cells and autologous CIK total cells) cultured by H3 and H3+T551 reached 76.9 times and 62.3 times on 14 d respectively;the CD3+CD56+double positive cells contents of cord blood CIK cells under the two kinds of culture condition were(16.7±2.7)% and(10.8±2.6)% respectively,while which of autologous CIK cells were(11.2±6.6)% and(10.7±6.4)% respectively;the in vitro killing-tumor test revealed that when the effector to-target ratio was 5:1,the cell cytotoxic activity of cord blood CIK cells cultured by H3 reached(33.50±9.99)%,which was significantly higher than(20.3±6.76)% of cord CIK cells cultured by H3+T551(P=0.011),while which of autologous CIK cells cultured by H3+T551 were(59.67±27.59)% and(42.13±19.47)% respectively,but the difference was not significant(P=0.080).Conclusion Cord blood and autologous CIK cells incubated by H3 have stronger in vitro anti-leukemia cells activity and can be used in the adoptive immunotherapy of leukemia in clinic.

leukemia,erythroblastic,acute;cytokine-induced killer cells;K562;H3 medium;T551 medium;inhibitory rates

宋文玲(1972)-，主治醫(yī)師，本科，主要從事惡性腫瘤的診斷與治療方面研究。

?術(shù)與方法·

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.02.021

R733.7

A

1671-8348(2017)02-0215-03

2016-07-24

2016-09-29)