長(zhǎng)鏈非編碼RNA-UBC1 對(duì)膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響

朱晨曦，李文洲，郭永連，余家俊，舒 博，陳 琳，李國(guó)灝，衛(wèi) 丹

(湖北省武漢市中心醫(yī)院泌尿外科 430014)

長(zhǎng)鏈非編碼RNA-UBC1 對(duì)膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響

朱晨曦，李文洲，郭永連，余家俊，舒 博，陳 琳，李國(guó)灝，衛(wèi) 丹

(湖北省武漢市中心醫(yī)院泌尿外科 430014)

目的 探討長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)-尿路上皮癌相關(guān)基因1(UBC1)對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移的作用及其可能的機(jī)制。方法 采用siRNA干擾技術(shù)沉默膀胱癌細(xì)胞系T24細(xì)胞的lncRNA-UBC1，設(shè)置陰性對(duì)照組，CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力，Westernblot印跡法檢測(cè)與轉(zhuǎn)移相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白2(MMP-2)與zeste基因增強(qiáng)子同源2(EZH2)。結(jié)果lncRNA-UBC1在T24細(xì)胞株中表達(dá)明顯高于人胚胎膀胱組織來源細(xì)胞；與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，沉默UBC1后，UBC1沉默組膀胱癌細(xì)胞增殖速率慢于對(duì)照組，UBC1沉默組膀胱癌細(xì)胞凋亡細(xì)胞比例高于陰性對(duì)照組[(18.72±7.79)% vs. (13.09±5.66)%，P<0.05]，UBC1沉默組細(xì)胞侵襲能力受到抑制，T24細(xì)胞MMP-2與EZH2表達(dá)降低。結(jié)論 沉默lncRNA-UBC1可抑制T24細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲能力，其機(jī)制可能是通過MMP-2與EZH2途徑。

RNA;膀胱腫瘤；長(zhǎng)鏈非編碼RNA-UBC1；腫瘤浸潤(rùn)；細(xì)胞增殖；基質(zhì)金屬蛋白酶2；zeste基因增強(qiáng)子同源物2

膀胱癌是最為常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其特點(diǎn)是復(fù)發(fā)率高和惡性程度高，尤其是浸潤(rùn)性膀胱癌，惡性程度極高，預(yù)后不佳，5年生存率不超過50%[1]。近年來，眾多研究正深入探索膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，尋找可信度高的生物標(biāo)志物和有效的治療靶點(diǎn)成為膀胱癌診治的突破點(diǎn)之一。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)已成為當(dāng)前全球基因領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)內(nèi)容之一[2]，lncRNA可通過表觀遺傳學(xué)相關(guān)的修飾在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，部分lncRNA具有重要的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值，有望成為人類癌癥新的診斷標(biāo)志物及分子治療靶點(diǎn)[3]。 有研究從臨床組織學(xué)水平檢測(cè)并篩查發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)-尿路上皮癌相關(guān)基因1(UBC1)表達(dá)與膀胱癌患者淋巴轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，而且，術(shù)前檢測(cè)UBC1表達(dá)水平可為膀胱癌淋巴結(jié)清掃范圍提供有力參考依據(jù)[4-5]。UBC1可能通過調(diào)控下游基因表達(dá)來發(fā)揮作用，但其具體機(jī)制尚在研究當(dāng)中。本研究擬從細(xì)胞水平探討UBC1與膀胱癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系及其可能的機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 膀胱癌細(xì)胞系T24細(xì)胞株和人胚胎膀胱組織來源細(xì)胞(CCC-HB-2)購自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)；DMEM和RPMI-1640均購自Hyclone公司；胎牛血清(FBS)購自Gibco公司；UBC1 siRNA和negative siRNA由廣州市銳博生物科技有限公司合成；磷酸鹽緩沖液(PBS)、0.25%胰蛋白酶和RIPA組織細(xì)胞快速裂解液等購自武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；SYBR Green染料購自天根生化科技有限公司；CCK-8試劑盒購自株式會(huì)社日本同仁； AnnexinV-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測(cè)試劑盒、Matrigel基質(zhì)膠均購自BD公司；各種孔板、Transell小室及其他細(xì)胞培養(yǎng)所需耗材為Corning公司產(chǎn)品。LipofectamineTM2000、TRIzol試劑和DNase Ⅰ酶等購自Invertogen公司；引物合成委托廣州市銳博生物科技有限公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo)、酶標(biāo)儀(芬蘭雷勃)、移液槍(吉爾森)、流式細(xì)胞儀(BD公司)均由本院科研中心提供使用。蛋白質(zhì)標(biāo)記物(Promega)、脫脂奶粉(BD公司)、十二烷基硫酸鈉(SDS)(Sigma)和硝酸纖維素膜(millipore)均購自武漢谷歌生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人胚胎膀胱組織來源細(xì)胞CCC-HB-2用DMEM+10%胎牛血清+雙抗培養(yǎng)。T24人膀胱癌細(xì)胞用DMEM+10%胎牛血清培養(yǎng)，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)細(xì)胞，操作過程嚴(yán)格遵循無菌操作原則，細(xì)胞培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)狀態(tài)最佳的細(xì)胞，接種于6孔板中，每孔2 mL細(xì)胞懸液，待細(xì)胞長(zhǎng)滿70%～80%時(shí)，參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑操作說明書進(jìn)行siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染操作，轉(zhuǎn)染終濃度為100 nmol/L，在轉(zhuǎn)染進(jìn)行48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組，陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染negative siRNA)和UBC1沉默組(轉(zhuǎn)染UBC1-siRNA)。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCT)檢測(cè)RNA表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染48 h后，采用Trizol法提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到總cDNA，然后按選定引物采用TaqPCR MasterMix(Toyobo)進(jìn)行下一步熒光定量PCR操作。隨后進(jìn)行目的基因片段的擴(kuò)增，以U6基因?yàn)閮?nèi)參。lncRNA UBC1基因引物序列：上游引物 5′-CCU GUC UAC AGA CUG AAU ATT-3′,下游引物 5′-CCG GAA CAA AUG GCU UCA UTT-3′)，陰性對(duì)照siRNA序列 5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′,各組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。采用RT-PCR法檢測(cè)CCC-HB-2-人胚胎膀胱組織來源細(xì)胞株(CH2組)和T24膀胱癌細(xì)胞株(T24組)中的UBC1表達(dá)水平，方法同前。

1.2.3 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖試驗(yàn) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為(1～5)×104/mL，取96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，每孔加入100 μL細(xì)胞懸浮液，種植細(xì)胞濃度為(1～5)×103/孔，并設(shè)置空白對(duì)照。37 ℃培養(yǎng)過夜，按照每孔100 μL CCK-8，37 ℃，5% CO2孵育1～4 h； 用分光光度計(jì)測(cè)定450 nm波長(zhǎng)光密度值(OD值)。記錄每塊板的數(shù)值，以培養(yǎng)處理的時(shí)間為橫軸，以平均OD值為縱軸，制作處理后T24人膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染48 h后，移去各組細(xì)胞上液，采用PBS洗滌1次，用胰酶消化液消化后重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度1×105/mL。用預(yù)冷的PBS洗滌2次，每次加入1 mL預(yù)冷的PBS，輕輕震蕩操作，使細(xì)胞充分懸浮，1 000 g、4 ℃條件離心5 min，棄上清液。將細(xì)胞重懸于200 μL，注意調(diào)整細(xì)胞濃度；加入10 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，輕輕混勻，注意不要用力震蕩，在4 ℃避光孵育30 min后加入300 μL結(jié)合緩沖液(Binging Buffer)，隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.2.5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 用無血清DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞血清饑餓處理24 h，將24孔板和Transwell小室用1×PBS浸泡5 min；用不含血清的DMEM培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞，然后用含有1%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸處理后的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105/mL，注意細(xì)胞濃度不可太高，接種到Transwell小室上層內(nèi)，每個(gè)小室上層加0.50 mL細(xì)胞懸液，下層加入500 μL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，每組3復(fù)孔。培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后每孔加入1 mL 4%甲醛溶液，室溫下固定10 min后吸去固定液，用1×PBS洗滌1次，用0.5%結(jié)晶紫溶液進(jìn)行染色，處理至少30 min后用1×PBS洗3次，晾干后觀察。觀察前用棉簽小心擦去Transwell小室內(nèi)沒有遷移的細(xì)胞，注意不要擦掉小室牽引過去的細(xì)胞，不要?dú)埩裘藁ㄋ樾迹缓髮⑿∈抑糜?00倍的顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中的細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 Western blot 細(xì)胞傳代培養(yǎng)至70%～80%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h后，胰酶消化并重懸細(xì)胞，采用RIPA試劑裂解法提取總蛋白，并用二喹啉甲酸(BCA)蛋白試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，達(dá)標(biāo)蛋白濃度方可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。水浴法變性蛋白后，加入5×SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)蛋白上樣緩沖液，取含相同量蛋白的蛋白裂解液，采用10%的SDS-PAGE 膠進(jìn)行電泳分離，注意調(diào)整電泳電壓和時(shí)間，用電轉(zhuǎn)印到尼龍膜上，用脫脂牛奶室溫封閉1 h，免疫印跡的一抗用按1∶1 000稀釋的抗人基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、zeste基因增強(qiáng)子同源物2(EZH2)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體過夜孵育，在室溫下用PBS-Tween洗膜3次，每次10 min；印跡膜用按1∶3 000的抗鼠或抗兔IgG耦聯(lián)的辣根過氧化物酶作為二抗，室溫孵育 1 h，用PBS-Tween 洗膜3次，室溫下每次10 min。用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液檢測(cè)試劑盒化學(xué)發(fā)光顯色。

2 結(jié) 果

2.1RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞系UBC1基因表達(dá)T24組細(xì)胞UBC1表達(dá)水平高于CH2組近3倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；T24膀胱癌細(xì)胞UBC1沉默組與陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組相比，UBC1相對(duì)表達(dá)明顯較低(P<0.05)，見圖1。

A：T24膀胱癌細(xì)胞UBC1基因表達(dá)水平；B：T24細(xì)胞UBC1表達(dá)水平。

圖1RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞系UBC1基因表達(dá)水平

2.2 沉默UBC1對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖影響結(jié)果 與陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組相比，24、48和72h時(shí)UBC1沉默組細(xì)胞OD值均降低，T24膀胱癌細(xì)胞增殖受到抑制，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 CCK-8檢測(cè)T24膀胱癌細(xì)胞增殖情況

2.3 沉默UBC1對(duì)膀胱癌細(xì)胞凋亡影響 人T24膀胱癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染UBC1-siRNA24h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，UBC1沉默組膀胱癌細(xì)胞凋亡細(xì)胞比例高于陰性對(duì)照組[(18.72±7.79)%vs.(13.09±5.66)%，P<0.05]，見圖3。

圖3 流式細(xì)胞儀術(shù)檢測(cè)T24膀胱癌細(xì)胞增殖情況

2.4 沉默UBC1對(duì)膀胱癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移影響Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移情況，結(jié)果顯示，穿膜細(xì)胞數(shù)目分別為：空白對(duì)照組(333.0±22.3)、陰性對(duì)照組(310.0±30.5)和UBC1沉默組(172.0±20.9)，與陰性對(duì)照組比較，UBC1沉默組細(xì)胞侵襲能力受到抑制(P<0.05)，見圖4。

圖4 Transwell檢測(cè)T24膀胱癌細(xì)胞侵襲情況(×100)

2.5Westernblot檢測(cè)MMP-2和EZH2蛋白的表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染24h后，Westernblot結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，UBC1沉默組細(xì)胞MMP-2和EZH2蛋白水平降低，見圖5。

圖5 Western blot檢測(cè)T24腫瘤細(xì)胞MMP-2和EZH2蛋白的表達(dá)水平

3 討 論

lncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度大于200nt單位的RNA,普遍存在于細(xì)胞中，它們起初被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的“轉(zhuǎn)錄垃圾”，不具有生物學(xué)功能[6-7]。然而，近年來研究表明，lncRNA參與了基因組印記、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄干擾及轉(zhuǎn)錄激活等多種重要的調(diào)控過程[7]。lncRNA在膀胱癌中的研究既可以豐富非編碼RNA的研究?jī)?nèi)容，到目前為止，已發(fā)現(xiàn)的與膀胱癌疾病密切相關(guān)的lncRNA有H19[8]、UCA1[9]、ncRAN[10]、MALAT-1[11]和MEG3[12]等。它們與膀胱癌疾病的發(fā)病機(jī)制、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、診斷治療及預(yù)后都有著一定的相關(guān)性[13]。

UBC1是新近發(fā)現(xiàn)的與膀胱癌疾病相關(guān)的又一lncRNA，He等[5]采用qRT-PCR檢測(cè)102名膀胱癌患者的癌組織和癌旁組織UBC1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)UBC1在膀胱癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，而且這種高表達(dá)與預(yù)后密切相關(guān)，其表達(dá)越高，患者預(yù)后越差，是可能的致癌基因或基因干預(yù)治療的靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，在膀胱癌細(xì)胞系中UBC1表達(dá)明顯高于人胚胎膀胱組織源性細(xì)胞中，這與He等[5]研究一致。當(dāng)下調(diào)UBC1后，膀胱癌細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲能力均受到抑制。而在關(guān)于UBC1與胃腸道癌癥關(guān)系的一項(xiàng)研究中，Hu等[4]也證實(shí)，在胃腸道癌組織中UBC1呈現(xiàn)高表達(dá)，下調(diào)UBC1后，胃腸道癌癥細(xì)胞株BGC-823,SGC-7901的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移均受到抑制。因此，結(jié)合以往研究不難得出，UBC1可能在膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展中有致癌作用，若干擾UBC1的表達(dá)，可能對(duì)膀胱癌具有一定的治療意義。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果還表明，下調(diào)UBC1后，膀胱癌細(xì)胞MMP-2和EZH2基因相關(guān)蛋白表達(dá)也隨之下降。lncRNA并不直接參與調(diào)控蛋白的翻譯合成，但其在mRNA前體的剪輯的調(diào)節(jié)和活性絲氨酸/精氨酸剪接因子水平的調(diào)控起著至關(guān)重要的作用，從而進(jìn)一步影響蛋白的表達(dá)。雖然本項(xiàng)目研究的是UBC1，但是有關(guān)lncRNA調(diào)控MMPs基因的研究并不陌生，Dong等[11]下調(diào)肝癌細(xì)胞中的lncRNA-MALAT1后發(fā)現(xiàn)，MMP-9基因相關(guān)蛋白被明顯下調(diào)[10]。Ji等[13]研究發(fā)現(xiàn)，MALAT1調(diào)控c-Myc和MMP-7基因的表達(dá)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。已知MMPs蛋白家族參與多種癌癥細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程[14-15]。因此，UBC1可能通過MMP-2途徑調(diào)控膀胱癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)UBC1干擾組的膀胱癌細(xì)胞EZH2蛋白水平的降低。以往研究發(fā)現(xiàn)lncRNA-MALAT1可以通過調(diào)控EZH2而調(diào)控前列腺癌細(xì)胞的生物學(xué)功能[16]，EZH2在膀胱癌增殖和侵襲轉(zhuǎn)移過程中起到重要作用，EZH2在膀胱癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，其表達(dá)水平的高低與預(yù)后成反比，但可能作為治療的干預(yù)靶點(diǎn)[17-18]。因此，參與UBC1調(diào)控膀胱癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)功能的蛋白途徑除了MMP-2之外，還可能有EZH2途徑。

總之，lncRNA-UBC1是膀胱癌發(fā)生、發(fā)展，增殖浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的重要調(diào)控分子，lncRNA與表觀遺傳學(xué)的調(diào)控是相互關(guān)聯(lián)、相互影響的，并非獨(dú)立存在于人體，隨著研究的深入，lncRNA-UBC1在膀胱癌中的作用機(jī)制將越來越明確，甚至可能作為膀胱癌診斷的特異性標(biāo)志物和藥物作用基因靶點(diǎn)，為膀胱癌診斷和治療提供新策略。

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Effect of long-chain non-coding RNA UBC1 on biological function of bladder cancer cells

ZhuChenxi,LiWenzhou,GuoYonglian,YuJiajun,ShuBo,ChenLin,LiGuohao,WeiDan

(DepartmentofUrology,WuhanMunicipalCentralHospital,Wuhan,Hubei430014,China)

Objective To investigate the effect of long-chain non-coding RNA-UBC1(lncRNA-UBCI) on proliferation,apoptosis,invasion and metastasis of bladder cancer cells and its possible mechanism.Methods The siRNA was used to silence lncRNA-UBC1 in bladder cancer cell line T24 cells.The negative control group was set.CCK-8 was used to detect cell proliferation,flow cytometry was used to detect cell apoptosis,Transwell assay was used to detect the invasion ability and the expression of EZH2 and MMP-2 was detected by Western blot.Results The lncRNA-UBC1 expression in T24 cell lines was significantly higher than that in human embryonic bladder tissue derived cells.Compared with the negative control group and blank control group,T24 bladder cancer cell proliferation rate in the UBC1 silence group was slower than that of the control groups.T24 bladder cancer cell apoptosis cell percentage in the UBC1 silence group was higher than that in the negative control group[(18.72±7.79)%vs. (13.09±5.66)%,P<0.05].The T24 bladder cancer cell invasion ability in the UBC1 silence group was inhibited.Expression of MMP-2 and EZH2 of T24 cell in UBC1 silence group was decreased.Conclusion Silencing lncRNA-UBC1 can inhibit the proliferation,apoptosis and invasion ability of T24 cells and its mechanism may be through MMP-2 and EZH2 pathway.

RNA；urinary bladder neoplasms；long-chain non-coding RNA UBC1；neoplasm invasiveness；cell proliferation；matrix metalloproteinase 2；enhancer of zeste homolog 2

朱晨曦(1979-)，主治醫(yī)師，博士，主要從事泌尿系腫瘤及結(jié)石方面研究。

??·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.02.007

R

A

1671-8348(2017)02-0169-03

2016-07-03

2016-08-26)