WTX基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的作用*

曹夢(mèng)園，白 洋，許 穎

(1.吉林省醫(yī)學(xué)期刊社，長(zhǎng)春 130021；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院超聲科，長(zhǎng)春 130021；3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院腎內(nèi)科，長(zhǎng)春 130021)

WTX基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的作用*

曹夢(mèng)園1，白 洋2，許 穎3△

(1.吉林省醫(yī)學(xué)期刊社，長(zhǎng)春 130021；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院超聲科，長(zhǎng)春 130021；3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院腎內(nèi)科，長(zhǎng)春 130021)

目的 WTX基因轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞株，分析WTX基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法 將結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞株分為WTX基因轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組，WTX基因轉(zhuǎn)染組給予WTX質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，對(duì)照組給予空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。觀察WTX基因轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組WTX基因的表達(dá)情況，兩組Lovo細(xì)胞株結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖情況、凋亡情況及細(xì)胞周期變化。結(jié)果 WTX基因轉(zhuǎn)染組結(jié)腸癌細(xì)胞WTX蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；WTX基因轉(zhuǎn)染組結(jié)腸癌轉(zhuǎn)染后4、7 d光密度值均明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；WTX基因轉(zhuǎn)染組G1期細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，WTX基因轉(zhuǎn)染組G2期和S期細(xì)胞比例明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論 WTX基因抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，影響結(jié)腸癌細(xì)胞周期，對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡沒有影響。

結(jié)腸腫瘤；基因；流式細(xì)胞術(shù)；細(xì)胞凋亡；WTX基因；結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞株；細(xì)胞增殖

結(jié)腸癌的發(fā)生是一個(gè)多階段、多步驟的比較復(fù)雜的過程，近年來其發(fā)病率和病死率有上升趨勢(shì)[1]，目前結(jié)腸癌的治療效果欠佳，預(yù)后比較差，主要的治療方法是手術(shù)切除、放化療和生物治療等的綜合治療[2]。結(jié)腸癌發(fā)生的分子機(jī)制主要有DNA損傷修復(fù)基因的功能異常，抑癌基因的缺失突變，癌基因激活，凋亡機(jī)制異常等，多種癌基因的激活和過度表達(dá)及多種抑癌基因的缺失和突變?cè)诮Y(jié)腸癌的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[3]。WTX基因和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，以及腫瘤的增殖凋亡有一定關(guān)系，對(duì)腫瘤有抑制作用[4]。Wnt通路和結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，WTX是Wnt通路的負(fù)向調(diào)節(jié)因子[5-6]。因此，WTX基因可能和結(jié)腸癌的發(fā)病有一定關(guān)系。本研究通過WTX基因轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞株，探討WTX基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 結(jié)腸癌細(xì)胞株 Lovo結(jié)腸癌細(xì)胞株購(gòu)自昆明動(dòng)物所細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 主要試劑和儀器 質(zhì)粒(美國(guó)Fermentas公司)，質(zhì)粒小提試劑盒(美國(guó)Fermentas公司)，DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Fermentas公司)，胎牛血清(四季青生物工程材料有限公司)，胰酶(美國(guó)Fermentas公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS，美國(guó)Fermentas公司)等；電泳儀(美國(guó)BD公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，培養(yǎng)箱(美國(guó)BD公司)等。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)方法 (1)分組：分為WTX基因轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組，WTX基因轉(zhuǎn)染組給予WTX質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，對(duì)照組給予空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。(2)質(zhì)粒提取：將PLV.E3d.null-EF1A>IRES/eGFP空載質(zhì)粒和PLV.E3d.null-EF1A>WTX>IRES/eGFP WTX質(zhì)粒在培養(yǎng)皿中劃線，過夜培養(yǎng)，挑選單克隆菌落移入離心管中，搖床搖菌，用EndoFree Plasmid Maxi Kit試劑盒提取質(zhì)粒。(3)細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將轉(zhuǎn)染前傳代培養(yǎng)生長(zhǎng)良好的結(jié)腸癌細(xì)胞株Lovo加入培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，然后加入12孔板孔中(每孔含細(xì)胞3×105)，細(xì)胞培養(yǎng)6 h，質(zhì)粒DNA加入Attractene Transfction Reagent形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入細(xì)胞中轉(zhuǎn)染細(xì)胞2～3 d。(4)觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果：空載質(zhì)粒濃度2 100 μg/mL，WTX質(zhì)粒濃度1 250 μg/mL，符合轉(zhuǎn)染要求，空載質(zhì)粒72 h后轉(zhuǎn)染率68%，WTX質(zhì)粒72 h后轉(zhuǎn)染率37%。

1.2.2 觀察指標(biāo) 兩組WTX基因的表達(dá)情況，兩組Lovo細(xì)胞株結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖情況、凋亡情況及細(xì)胞周期變化。(1)WTX蛋白表達(dá)的測(cè)定：采用Western blot法檢測(cè)兩組WTX蛋白的表達(dá)情況。(2)增殖情況：將轉(zhuǎn)染細(xì)胞加入CCK-8溶液，孵育4 h染色，在酶標(biāo)儀上測(cè)定第1、4、7天450 nm波長(zhǎng)的光密度(optical density，OD)值。(3)凋亡情況測(cè)定：采用流式細(xì)胞儀測(cè)定轉(zhuǎn)染后1、4、7 d 兩組細(xì)胞的早期凋亡、晚期凋亡和總凋亡情況。(4)生長(zhǎng)周期測(cè)定：采用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)周期情況，檢測(cè)結(jié)果用細(xì)胞周期擬合軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 兩組WTX基因的表達(dá)情況Westernblot結(jié)果顯示：WTX基因轉(zhuǎn)染組結(jié)腸癌細(xì)胞WTX蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，過表達(dá)WTX基因結(jié)腸癌細(xì)胞株成功建立，見圖1、表1。

2.2 兩組結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖情況CCK8染色檢測(cè)結(jié)果：WTX基因轉(zhuǎn)染組結(jié)腸癌轉(zhuǎn)染后4、7dOD值均明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，WTX基因轉(zhuǎn)染組結(jié)腸癌轉(zhuǎn)染后1dOD值和對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.3 兩組結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡情況 流式細(xì)胞儀法檢測(cè)結(jié)果：WTX基因轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染后1、4、7d結(jié)腸癌細(xì)胞的早期凋亡率、晚期凋亡率與總凋亡率和對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

圖1 兩組WTX蛋白電泳圖

組別β-actin灰度值WTX灰度值WTX基因轉(zhuǎn)染組54.32±11.0270.02±12.42對(duì)照組55.17±10.3840.21±6.34t0.3747.342P0.9670.000

表2 兩組結(jié)腸癌細(xì)胞的OD值

表3 轉(zhuǎn)染后1、4、7 d 兩組結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡情況

2.4 兩組結(jié)腸癌細(xì)胞周期比較 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：WTX基因轉(zhuǎn)染組G1期細(xì)胞比例明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，WTX基因轉(zhuǎn)染組G2期和S期細(xì)胞比例明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，見表4、圖2。

表4 兩組結(jié)腸癌細(xì)胞周期比較

A：WTX基因轉(zhuǎn)染組；B:對(duì)照組。

圖2 兩組細(xì)胞周期圖

3 討 論

WTX位于X染色體上，是一種對(duì)腫瘤具有抑制作用的基因，WTX基因蛋白存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜內(nèi)。因WTX基因位置比較特殊，使其抑癌作用具有獨(dú)特性。Wnt/β-catenin信號(hào)通路比較保守，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化增殖和凋亡，在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、胚胎發(fā)育和多種疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[7]。β-catenin是Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵因子，是粘連素家族成員，位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜和細(xì)胞核中，參與細(xì)胞之間的黏附，正向調(diào)節(jié)Wnt通路，β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)累積及在細(xì)胞質(zhì)中降解失去平衡等會(huì)激活靶基因轉(zhuǎn)錄，引起腫瘤的發(fā)生[8]。WTX和β-catenin關(guān)系密切，能夠與β-catenin形成復(fù)合物，形成的復(fù)合物對(duì)β-catenin蛋白降解和泛素化，對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路有負(fù)向調(diào)節(jié)作用[9-10]。WTX還可以抑制核因子E2相關(guān)因子2(NRF2)的泛素化，WTX缺失引起NRF2迅速降解和泛素化，降低其對(duì)細(xì)胞的毒性反應(yīng)。WTX還影響P53的活性及其對(duì)癌癥的抑制作用。因此WTX既可以影響P53的抑癌通路，又可以影響Wnt/β-catenin的致癌通路[11]。

在Willms瘤患者中存在有WTX基因突變，在胃癌、肝癌等其他惡性腫瘤中，很少發(fā)現(xiàn)WTX基因突變，考慮WTX和其他惡性腫瘤的關(guān)系可能與其表達(dá)缺失有關(guān)[12-13]。在結(jié)腸癌中，WTX基因突變對(duì)β-catenin降解復(fù)合物的功能有一定影響，同時(shí)與腫瘤的增殖凋亡和生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)，對(duì)腫瘤有抑制作用。WTX縮短突變能夠增加β-catenin的表達(dá)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，Wnt/β-catenin信號(hào)通路異常激活能夠引起結(jié)腸癌的發(fā)生[14-15]，WTX是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的負(fù)向調(diào)節(jié)因子，在結(jié)腸癌的發(fā)生中可能也發(fā)揮重要作用。本研究通過WTX基因轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞株，分析WTX基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，WTX基因轉(zhuǎn)染組結(jié)腸癌細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞比較，WTX蛋白表達(dá)升高，細(xì)胞增殖OD值降低，G1期細(xì)胞比例升高，G2期和S期細(xì)胞比例降低。可見，WTX基因?qū)Y(jié)腸癌Lovo細(xì)胞的凋亡沒有影響，WTX基因明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，WTX基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響可能是通過抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖實(shí)現(xiàn)的，WTX基因影響結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)周期，結(jié)腸癌細(xì)胞主要被WTX基因阻滯在G1期，很少有細(xì)胞進(jìn)入S期 ，表明WTX基因通過將結(jié)腸癌細(xì)胞阻滯于DNA合成期，從而發(fā)揮其抑癌作用的。

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Effect of WTX gene on colon cancer cell proliferation and apoptosis*

CaoMengyuan1,BaiYang2,XuYing3△

(1.MedicalJournalofJilinProvince，Changchun,Jilin130021,China;2.DepartmentofUltrasound,FirstHospital,JilinUniversity,Changchun,Jilin130021,China;3.DepartmentofNephrology,FirstHospital,JilinUniversity,Changchun,Jilin130021,China)

Objective To use WTX gene for transfecting into Lovo colon cancer cell line,and to analyze the impact of WTX gene on colon cancer cell proliferation and apoptosis.Methods Lovo colon cancer cell line was divided into the WTX gene transfection group and control group.The WTX gene transfection group was given WTX plasmid transfection,while the control group received empty vector transfection.The expression of WTX gene in the WTX gene transfection group and control group was observed.The proliferation,apoptosis and cell cycle change of Lovo colon cancer cells in two groups were also observed.Results The WTX protein expression in the WTX gene transfection group was significantly higher than that in the control group(P<0.05);the OD values on 4,7 d after transfection in the WTX gene transfection group were significantly lower than those in the control group (P<0.05);the G1phase cells proportion in the WTX gene transfection group was significantly higher than that in the control group(P<0.05),the G2and S phase cells proportion in the WTX gene transfection group was significantly lower than that in the control group (P<0.05).Conclusion WTX gene inhibits the proliferation of colon cancer cells,affects colon cancer cells cycle,has no effect on apoptosis of colon cancer cells.

colonic neoplasms；genes；flow cytometry；apoptosis；WTX gene；colon cancer Lovo cell line；cell proliferation

? 著·

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.02.001

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013052218JH)。

曹夢(mèng)園(1979-)，副編審，碩士，主要從事老年病學(xué)方面研究?！?/p>

R656.9

A

1671-8348(2017)02-0145-03

2016-07-19

2016-09-18)