外源酶對湖羊瘤胃微生物區(qū)系的影響

陳 宇

(1．寧德出入境檢驗檢疫局，福建 寧德 352100)

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外源酶對湖羊瘤胃微生物區(qū)系的影響

陳 宇

(1．寧德出入境檢驗檢疫局，福建 寧德 352100)

研究添加不同水平的外源酶(木聚糖酶和纖維素酶)對湖羊瘤胃液體外培養(yǎng)及瘤胃微生物體外培養(yǎng)區(qū)系的影響，旨在為外源酶作為湖羊飼料添加劑開發(fā)提供理論依據(jù)。結(jié)果表明：添加不同水平外源酶均能改善瘤胃微生物體外培養(yǎng)特性，其中以添加量為10 mg/kg處理組效果最佳，外源酶(10 mg/kg)可以有效提高培養(yǎng)液中細菌濃度(P<0.01)，產(chǎn)甲烷菌濃度極顯著降低(P<0.01)，促進纖維素降解菌生長繁殖。

湖羊；外源酶；瘤胃微生物；體外培養(yǎng)；RT-PCR

由于20世紀80年代生物技術(shù)得到快速研究和實際應(yīng)用，使酶制劑可以實現(xiàn)批量生產(chǎn)，降低成本，并得到廣泛應(yīng)用。在畜禽配合飼料中添加適量酶制劑，可以提高畜禽的采食量和飼料利用率，減少氮、磷排放量，降低畜禽養(yǎng)殖對環(huán)境污染程度。飼料中添加外源酶制劑在動物腸道內(nèi)可以降解多糖，被包被的淀粉和多糖暴露在消化酶中，使不能被內(nèi)源酶消化的養(yǎng)分可以被消化和利用[1]，還會通過降低內(nèi)源物質(zhì)的損失而提高日糧營養(yǎng)價值[2]。有學者研究表明：在玉米-豆粕日糧中添加外源復(fù)合酶，可以有效提高生長豬生產(chǎn)性能[3]；在生長育肥豬飼料中添加木聚糖酶可以有效提高飼料利用率和豬生長性能[4-6]。在綿羊高纖維日糧中添加外源復(fù)合酶，能夠提高其纖維物質(zhì)消化率及綿羊日增重[7]。

外源酶制劑在腸道內(nèi)還可以降解飼料中植酸、酶抑制劑等抗營養(yǎng)物質(zhì)，減少對內(nèi)源酶的阻礙作用，提高酶活力，提高飼料消化率和營養(yǎng)物質(zhì)利用率[8]。

本實驗的目的是研究添加外源酶對湖羊瘤胃液微生物體外培養(yǎng)特性的影響，探討添加不同水平外源酶、在不同培養(yǎng)時間點，體外培養(yǎng)液中微生物發(fā)酵水平，為進一步研究瘤胃液微生物的體外培養(yǎng)區(qū)系，為外源酶作為湖羊或其他反芻動物飼料添加劑開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

外源酶為纖維素酶和木聚糖酶，按照4∶1比例混合，均購自上海生物工程有限公司，纖維素酶和木聚糖酶酶活按照該公司的企業(yè)標準方法測定，纖維素酶酶活為22 525 IU，木聚糖酶酶活為24 200 IU；質(zhì)量分數(shù)0.1%刃天青溶液。

1 mol/L KCl、2 mol/L MgCl2、1 mol/L葡萄糖、50 mg/ml X-Gal、24 g/L IPTG、100 g/L氨芐青霉素(Amp)、高純質(zhì)粒制備試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、UItraPower Pum-T快速克隆試劑盒、DNA DL2000 Marker、SYBR Green I試劑盒、96孔PCR板。

1.2 儀器設(shè)備

紫外分光光度計、恒溫振蕩水浴鍋、電子天平、離心機、pHS-3D型酸度計、熒光定量PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、無菌操作臺、箱式恒溫搖床、平板電泳儀、渦旋混合器。

1.3 方法

1.3.1 瘤胃微生物培養(yǎng)液配制[9]

培養(yǎng)液A的配制：16.0 g FeCl3·6H2O、2.0 g CoCl2·6H2O、20 g MnCl2·4H2O 和26.4 g CaCl2·2H2O充分溶解于120 ml蒸餾水中，再定容至200 ml容量瓶中。

培養(yǎng)液B的配制：4.0 g NH4HCO3和35.0 g NaHCO3充分溶于600 ml蒸餾水，再定容至1 000 ml容量瓶中。

培養(yǎng)液C的配制：5.7 g Na2HPO4、6.2 g K2HPO4和 0.6 g MgSO4·7H2O充分溶解于600 ml蒸餾水中，再定容至1 000 ml容量瓶中。

還原劑培養(yǎng)液的配制：320 ml NaOH 和625 ml Na2S·9H2O加100 ml蒸餾水。使用時臨時配制。

培養(yǎng)液配制：取800 ml蒸餾水+0.2 ml培養(yǎng)液A+400 ml培養(yǎng)液B+400 ml培養(yǎng)液C+2 ml刃天青溶液+80 ml還原劑培養(yǎng)液，用玻璃棒充分攪勻，將混合液在39℃水浴鍋中預(yù)熱，直到混合液溫度穩(wěn)定，并向混合液中緩慢沖CO2氣體直到飽和(培養(yǎng)液由紫色變成無色，并保持無色狀態(tài))，備用。

1.3.2 實驗動物與飼養(yǎng)管理

購買4只體重30～32 kg公母各半且健康度高的湖羊，每只湖羊都安裝永久性瘤胃瘺管，護理15 d后使用。實驗動物日糧包括粗飼料1 kg和精飼料0.5 kg兩部分，粗飼料為新鮮雜交狼尾草，精飼料包括玉米、豆粕、次粉、氯化鈉等(表1)。自由飲水，分早上6:30和下午5:30兩次飼喂。

表1 湖羊精飼料組成及營養(yǎng)水平

1.3.3 實驗設(shè)計

分5個處理組，每個處理組3個重復(fù)，對照組記為A0，處理組分別記為A1、A2、A3、A4。對照組A0全混合日糧中不添加外源酶，處理組A1、A2、A3、A4每1 kg全混合日糧中添加外源酶量分別為10、20、30、40 mg。

1.3.4 體外培養(yǎng)操作步驟

湖羊瘤胃微生物體外培養(yǎng)采用自制體外培養(yǎng)設(shè)備，如圖1所示。

圖1 湖羊瘤胃微生物體外培養(yǎng)裝置示意圖

體外培養(yǎng)設(shè)備由注射器(50 ml，最小刻度為1 ml)、三角錐瓶(50 ml)、三通閥、恒溫振蕩水浴鍋(39℃)組成。注射器用于測量微生物產(chǎn)生氣體體積，用少量潤滑劑均勻涂抹注射器活塞，減小活塞阻力，減少由于阻力帶來的實驗誤差，使氣體產(chǎn)量測定結(jié)果更準確。三角錐瓶作為瘤胃微生物體外培養(yǎng)主體，瘤胃微生物和發(fā)酵底物在三角錐瓶中發(fā)酵。三角錐瓶放在水浴鍋中，使三角錐瓶中培養(yǎng)液恒溫，有規(guī)律振蕩，模擬湖羊瘤胃的無氧、恒溫和胃蠕動環(huán)境。

(1)在15個三角錐形瓶中分別加入600 mg全混合日糧底物(稻草∶精料=1∶1)。

(2)在三角錐形瓶中緩慢加入體外培養(yǎng)液30 ml，往培養(yǎng)液中緩慢通入二氧化碳氣體(以緩慢冒氣泡為準)，待完全排出瓶中空氣，蓋上塞子，在39℃恒溫水浴鍋中預(yù)熱備用。

(3)湖羊瘤胃液采集：在湖羊晨飼前，利用真空負壓裝置從湖羊永久性瘤胃瘺管采取瘤胃液各250 ml，裝于事先通滿二氧化碳氣體的保溫瓶中，迅速帶回實驗室。

(4)瘤胃液預(yù)處理：把1 L玻璃燒杯放入39℃恒溫水浴鍋中加熱到恒溫。將采回來的新鮮瘤胃液用4層紗布過慮，往濾液中不停緩慢通入二氧化碳氣體，39℃恒溫水浴備用。

(5)用50 ml注射器緩慢吸取30 ml瘤胃液注入三角錐形瓶中(防止生成氣泡)，蓋上塞子。

(6)在三通閥上插上50 ml注射器，打開三通閥開關(guān)，使氣體進入注射器。

(7)打開水浴鍋振蕩開關(guān)，開始緩慢振蕩。

(8)分別在培養(yǎng)0、6、12、18、24、36、48 h時讀取注射器讀數(shù)并及時對三角錐形瓶中培養(yǎng)液采樣。

1.3.5 標準品制備

(1)采用反復(fù)凍融CTAB法[10-12]提取湖羊瘤胃微生物DNA。

(2)用QIAamp DNA純化試劑對培養(yǎng)液微生物總DNA進行純化。

(3)培養(yǎng)液微生物目標PCR產(chǎn)物制備：根據(jù)表2合成通用引物，對提取總DNA擴增細菌16SrDNA。

(4)擴增產(chǎn)物純化：擴增產(chǎn)物進行電泳，并用膠回收試劑盒回收目標條帶。

(5)質(zhì)粒DNA提取：使用大連寶生物科技公司質(zhì)粒制備試劑盒提取。

(6)陽性克隆PCR產(chǎn)物檢測：質(zhì)粒DNA進行普通PCR反應(yīng)，并對PCR產(chǎn)物進行電泳檢測。

(7)培養(yǎng)液微生物陽性克隆測序和比對：培養(yǎng)液微生物陽性克隆測序由大連寶生生物技術(shù)公司完成。測序結(jié)果最后在GENE BANK中BLAST檢測。

(8)質(zhì)粒濃度換算：用紫外分光光度計測定質(zhì)粒DNAOD260值，并通過公式換算成質(zhì)粒拷貝數(shù)(copies/μl)。

表2 瘤胃細菌、真菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、黃色瘤胃球菌、溶纖維丁酸弧菌、產(chǎn)甲烷菌16SrDNA全序列引物[13]

1.3.6 RT-PCR反應(yīng)體系和擴增條件

先用1.5 ml無菌管按表3配制n+1倍反應(yīng)液(n為孔數(shù))，使用八連管分裝反應(yīng)液，每個孔20 μl，3個重復(fù)。然后按照表4的條件進行擴增。

表3 RT-PCR反應(yīng)液配制

表4 RT-PCR擴增熱循環(huán)程序

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

實驗所得數(shù)據(jù)用Microsoft EXCEL(2013)初步整理，再利用SPSS(17.0)中One-way ANOVA進行方差分析，并進行多重比較。實驗數(shù)據(jù)處理結(jié)果用“平均值±標準差”形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 陽性克隆PCR產(chǎn)物檢測

電泳檢測結(jié)果見圖2所示。

圖2 質(zhì)粒PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

圖2中1～6分別代表：培養(yǎng)液微生物細菌、真菌、甲烷菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、黃色球菌和溶纖維丁酸弧菌，M代表Mark500。從圖中各亮帶可知，各菌所提取質(zhì)粒亮帶唯一，分別在200、200、200、200、286、136 bp，與各菌通用引物設(shè)計的目的片段大小相符。

2.2 外源酶對體外培養(yǎng)液總細菌影響

外源酶不同添加量處理組培養(yǎng)液總細菌濃度見表5。

表5 不同外源酶添加量處理組培養(yǎng)液總細菌濃度動態(tài)變化 1011 CFU/ml

注：表中數(shù)據(jù)為“平均值±標準差”，同列不同小寫字母表示存在顯著差異(P<0.05)(n=3)；同列不同大寫字母表示存在極顯著差異(P<0.01)(n=3)。下同。

由表5可得，各處理組培養(yǎng)液總細菌濃度都處于1010～1011，屬于正常瘤胃微生物體外培養(yǎng)總細菌濃度。在培養(yǎng)6 h時，處理組A1總細菌濃度比對照組A0極顯著提高(P<0.01)，由1.13×1011CFU/ml提高到2.63×1011CFU/ml；在培養(yǎng)12 h時，處理組A1、A2總細菌濃度極顯著高于對照組A0(P<0.01)；在培養(yǎng)18 h時，處理組A1總細菌濃度比對照組A0極顯著提高(P<0.01)，處理組A2、A3總細菌濃度顯著高于對照組A0(P<0.05)；在培養(yǎng)24 h時，處理組A1總細菌濃度比對照組A0極顯著提高(P<0.01)，由1.52×1011CFU/ml提高到3.86×1011CFU/ml。

2.3 外源酶對體外培養(yǎng)液真菌影響

外源酶不同添加量處理組真菌濃度見表6。

表6 不同外源酶添加量處理組培養(yǎng)液真菌濃度動態(tài)變化 105 CFU/ml

由表6可知，48 h內(nèi)瘤胃液體外培養(yǎng)液真菌濃度都在105～107，屬于正常瘤胃液體外培養(yǎng)真菌濃度。在培養(yǎng)6 h時，處理組A1真菌濃度比對照組A0極顯著提高(P<0.01)，由12.43×105CFU/ml提高到17.45×105CFU/ml；在培養(yǎng)12、18 h時，處理組A2顯著高于對照組A0(P<0.05)；在培養(yǎng)24 h時，處理組A1、A4極顯著高于對照組A0(P<0.01)，處理組A2、A3顯著高于對照組A0(P<0.05)；在培養(yǎng)48 h時，處理組A1比對照組A0極顯著提高(P<0.01)，由1.79×105CFU/ml提高到3.41×105CFU/ml。

2.4 外源酶對體外培養(yǎng)液產(chǎn)甲烷菌影響

外源酶不同添加量處理組產(chǎn)甲烷菌濃度見表7。

表7 不同外源酶添加量處理組培養(yǎng)液產(chǎn)甲烷菌濃度動態(tài)變化 107 CFU/ml

由表7可知，48 h內(nèi)瘤胃液體外培養(yǎng)產(chǎn)甲烷菌濃度都在107～109，屬于正常瘤胃液體外培養(yǎng)產(chǎn)甲烷菌濃度。在培養(yǎng)12 h時，處理組A1比對照組A0顯著減少(P<0.05)，由15.48×107CFU/ml減少到13.52×107CFU/ml；在培養(yǎng)18 h時，處理組A1、A2極顯著低于對照組A0(P<0.01)；在培養(yǎng)24 h時，處理組A1比對照組A0極顯著降低(P<0.01)，由10.46×107CFU/ml降低到7.82×107CFU/ml；在培養(yǎng)36 h時，處理組A1顯著低于處理組A2；在培養(yǎng)48 h時，處理組A1比A4顯著降低(P<0.05)。

2.5 外源酶對體外培養(yǎng)液產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌影響

外源酶不同添加量處理組產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌濃度見表8。

表8 不同外源酶添加量處理組培養(yǎng)液產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌濃度動態(tài)變化 108 CFU/ml

由表8可知，48 h內(nèi)瘤胃液體外培養(yǎng)產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌濃度在108～109，屬于正常瘤胃液體外培養(yǎng)產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌濃度。在培養(yǎng)6 h和12 h時，處理組A1比對照組A0極顯著提高 (P<0.01)，分別由1.79×108CFU/ml和4.32×108CFU/ml提高到3.35×108CFU/ml和6.39×108CFU/ml；在培養(yǎng)18 h時，處理組A1、A2顯著高于對照組A0；在培養(yǎng)24、36、48 h時，處理組A1都顯著高于對照組A0(P<0.01)。

2.6 外源酶對體外培養(yǎng)液產(chǎn)黃色瘤胃球菌影響

外源酶不同添加量處理組黃色瘤胃球菌濃度見表9。

表9 不同外源酶添加量處理組培養(yǎng)液黃色瘤胃球菌濃度動態(tài)變化 106 CFU/ml

由表9可知，各處理組在培養(yǎng)48h內(nèi)黃色瘤胃球菌濃度變化趨勢一致，在培養(yǎng)6～12 h時呈現(xiàn)快速上升。在培養(yǎng)12 h時，處理組A1顯著高于對照組A0(P<0.05)；在培養(yǎng)18 h時，各處理組濃度都顯著高于對照組A0；在培養(yǎng)24 h時，處理組A1、A2顯著高于對照組A0(P<0.05)。

2.7 外源酶對體外培養(yǎng)液產(chǎn)溶纖維丁酸弧菌影響

外源酶不同添加量處理組溶纖維丁酸弧菌濃度見表10。

表10 不同外源酶添加量處理組培養(yǎng)液溶纖維丁酸弧菌濃度動態(tài)變化 108 CFU/ml

由表10可知，各組在0～48 h內(nèi)溶纖維丁酸弧菌濃度變化一致。在培養(yǎng)6 h時，處理組A1極顯著高于對照組A0(P<0.05)；在培養(yǎng)12 h時，處理組A2顯著高于對照組A0(P<0.05)；在培養(yǎng)18 h時，處理組A1極顯著高于對照組A0(P<0.01)；在培養(yǎng)24 h時，處理組A1、A2顯著高于對照組A0(P<0.05)。

3 討論

3.1 外源酶對瘤胃液體外培養(yǎng)總細菌濃度影響

湖羊瘤胃內(nèi)細菌利用營養(yǎng)物質(zhì)生成菌體蛋白(MCP)、揮發(fā)性脂肪酸(VFA)等被自身吸收利用，細菌是湖羊瘤胃消化飼料和機體吸收營養(yǎng)的重要樞紐，湖羊生長需要的蛋白質(zhì)有60%～65%由瘤胃細菌提供[16]。瘤胃細菌濃度取決于湖羊攝入飼料總能量。反芻動物在攝入飼料能量水平相同情況下，瘤胃內(nèi)細菌濃度不會呈現(xiàn)顯著差異[17]。瘤胃液體外培養(yǎng)實驗中，細菌濃度都處于0.49×1011～5.11×1011CFU/ml，屬于瘤胃培養(yǎng)液細菌正常范圍1010～1011CFU/ml。

添加外源酶后瘤胃微生物通過對粗纖維依附后分解各類酶，形成降解作用顯著的酶系統(tǒng)，提高細菌對植物細胞壁降解能力，提高粗纖維降解率，進而提高飼料營養(yǎng)利用率，促進細菌生長繁殖?？梢?，外源酶可以提高瘤胃液體外培養(yǎng)總細菌濃度，其中以10 mg/kg添加量為最佳。

3.2 外源酶對瘤胃液體外培養(yǎng)真菌濃度影響

湖羊瘤胃真菌通過合成分泌纖維素酶降解利用粗飼料中纖維素、半纖維素，并生成乙酸、CO2、H2等。纖維素酶的添加促進了纖維素降解，提高了真菌活力和繁殖速度。瘤胃內(nèi)真菌與產(chǎn)甲烷菌存在協(xié)同作用，產(chǎn)甲烷菌利用真菌代謝生成的H2合成甲烷，兩者體外混合培養(yǎng)比真菌單獨培養(yǎng)降解纖維素能力強，生成乙酸和CO2更多，減少乳酸和乙醇產(chǎn)生，不產(chǎn)生氫氣，減少瘤胃酸中毒發(fā)生。瘤胃液中真菌合成蛋白質(zhì)主要氮源是氨態(tài)氮，本次體外培養(yǎng)實驗中，培養(yǎng)液真菌濃度變化規(guī)律與氨態(tài)氮濃度變化相近。Denman等[18]通過Real time PCR研究表明瘤胃微生物體外培養(yǎng)過程 ，培養(yǎng)4～8 h為真菌快速繁殖階段，在培養(yǎng)12 h左右真菌出現(xiàn)最高濃度值。這個研究發(fā)現(xiàn)與本實驗結(jié)果相似。在體外培養(yǎng)初期，培養(yǎng)液細菌充分利用底物，迅速繁殖，在一定程度上抑制真菌繁殖，在培養(yǎng)后期細菌生長繁殖速度降低，對真菌抑制減弱。

3.3 外源酶對瘤胃液體外培養(yǎng)產(chǎn)甲烷菌濃度影響

反芻動物瘤胃內(nèi)產(chǎn)甲烷菌屬于厭氧菌，在體外單獨培養(yǎng)定量產(chǎn)甲烷菌條件要求很高，可以通過用現(xiàn)代分子技術(shù)手段免培養(yǎng)定量[19]。研究表明定量產(chǎn)甲烷菌可用rRNA片段和熒光探針標記法[20-21]。瘤胃中產(chǎn)甲烷菌利用其它微生物代謝產(chǎn)物氫和乙酸合成甲烷氣體，產(chǎn)甲烷菌與原蟲存在協(xié)同作用，原蟲為產(chǎn)甲烷菌提供合成甲烷所需的氫，產(chǎn)甲烷菌使原蟲提高營養(yǎng)物質(zhì)速率；乙酸可通過瘤胃壁進入動物體內(nèi)進行供能與異生作用等，但是產(chǎn)甲烷菌也能利用乙酸，使動物體降低乙酸利用率，從而使飼料營養(yǎng)利用率降低。體外培養(yǎng)實驗中，培養(yǎng)液中產(chǎn)甲烷菌濃度都在107～108，屬于正常瘤胃液體外培養(yǎng)產(chǎn)甲烷菌濃度。

3.4 外源酶對瘤胃液體外培養(yǎng)琥珀酸絲狀桿菌濃度影響

反芻動物瘤胃內(nèi)產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌定植在植物細胞壁合成并分泌纖維素酶，纖維素和半纖維素被纖維素酶降解為乙酸和琥珀酸等。在瘤胃液體外培養(yǎng)初期，培養(yǎng)液底物營養(yǎng)物質(zhì)充足，細菌快速生長繁殖，抑制纖維素降解菌活性，待非結(jié)構(gòu)性碳水化合物被細菌消耗殆盡，纖維素降解菌抑制作用解除，生長繁殖加快。添加10 mg/kg外源酶可以提高瘤胃液體外培養(yǎng)產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌濃度，提高纖維素利用率。

3.5 外源酶對瘤胃液體外培養(yǎng)黃色瘤胃球菌濃度影響

黃色瘤胃球菌是最重要纖維素降解菌之一，主要通過附著在植物細胞表皮和細胞壁合成分泌木聚糖酶和葡聚糖酶降解晶狀纖維素[22]。在瘤胃液體外培養(yǎng)中，黃色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌生長繁殖趨勢具有相似性。添加外源酶處理組黃色瘤胃球菌濃度高于對照組，這原因可能跟外源酶作用于產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌相同。但是10 mg/kg添加量處理組細菌濃度高于其它各組，可能是由于高濃度外源酶使與黃色瘤胃球菌存在競爭作用的微生物也加快繁殖。這說明添加10 mg/kg外源酶可以提高瘤胃液體外培養(yǎng)黃色瘤胃球菌活性，提高纖維素利用率。

3.6 外源酶對瘤胃液體外培養(yǎng)溶纖維丁酸弧菌濃度影響

溶纖維丁酸弧菌在瘤胃內(nèi)降解纖維素生成VFA，也可以降解非結(jié)構(gòu)性碳水化合物生成NH3和VFA。因此本次體外培養(yǎng)實驗中，外源酶添加量為10 mg/kg處理組在培養(yǎng)6～18 h時都是極顯著高于對照組。這主要是由于外源酶提高了溶纖維丁酸弧菌降解纖維素能力，使溶纖維丁酸弧菌可降解底物濃度提高，促進溶纖維丁酸弧菌生長繁殖。因此，添加10 mg/kg外源酶可以顯著提高瘤胃液體外培養(yǎng)溶纖維丁酸弧菌濃度，促進底物中纖維素利用。

4 結(jié)論

外源酶可以提高培養(yǎng)液中細菌總濃度，抑制產(chǎn)甲烷菌生長繁殖，促進纖維降解菌繁殖。從而提高飼料中營養(yǎng)素利用率，提高纖維素降解率。其中以外源酶添加量為全混日糧的10 mg/kg為最佳。

(1)在體外培養(yǎng)24 h時，處理組A1總細菌濃度比對照組A0顯著提高(P<0.05)。

(2)在體外培養(yǎng)48 h時，處理組A1真菌濃度比對照組A0極顯著提高(P<0.01)。

(3)在體外培養(yǎng)24 h時，處理組A1產(chǎn)甲烷菌濃度比對照組A0極顯著降低(P<0.01)。在培養(yǎng)48 h時，處理組A1產(chǎn)甲烷菌濃度比A4顯著降低(P<0.05)。

(4)在體外培養(yǎng)6 h和12 h時，處理組A1產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌濃度比對照組A0極顯著提高 (P<0.01)。

(5)各處理組在體外培養(yǎng)48 h內(nèi)，黃色瘤胃球菌濃度變化趨勢一致，在培養(yǎng)6～12 h時呈現(xiàn)快速上升。在培養(yǎng)12 h時，處理組A1顯著高于對照組A0(P<0.05)。

(6)各組在體外培養(yǎng)0～48 h內(nèi)，溶纖維丁酸弧菌濃度變化一致。在培養(yǎng)6 h時，處理組A1極顯著高于對照組A0(P<0.05)；在培養(yǎng)12 h時，處理組A2顯著高于對照組A0(P<0.05)。

[1] BEDFORD M R. The effect of enzymes on digestion[J].Journal of Applied Poultry Research, 1996, 5(4):370-378.

[2] DANICKE S, BOTTCHER W, JEROCH H, et al. Replacement of soybean oil with tallow in rye-based diets without xylanase Increases protein synthesis in small intestine of broilers[J].Animal Social Nutrition Science, 2000,130:827-834.

[3] LINDEMANN M D, GENTRY J L, MONEGUE H J, et al. Determination of the contribution of an enzyme combination (Vegpro) to performance in grower finisher pigs[M].Australia: Manipulating pig production VI (Ed. PD Cranwell), 1997.

[4] SCHULZE H, PARTRIDGE G G, CRESWELL D. The effect of feed enzyme supplementation to corn/soya based diets on performance of finisher pigs from 46 to 92 kg[J].Journal of Animal Science,1996, 74(1):197.

[5] SCHULZE H, CAMPBELL R G. Effect of exogenous xylanase on performance of pig fed corn/soya based diets[J]. Journal of Animal Science, 1998, 76(1):179.

[6] PARTRIDGE G G, ALCANTARA P F, CRESWELL D. Effect of xylanase addition to corn/soybean meal/Wheat pollard diets for grower/finisher pigs[J]. Korea： Proceedings of the 8 th World Conference on Animal Production. Seoul, 1998.

[7] 楊永明. 外源纖維復(fù)合酶在綿羊飼養(yǎng)中的作用效果及其作用機制的研究[D]. 呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文, 2002.

[8] 馮宗慈, 高 民. 通過比色測定瘤胃液氨氮含量方法的改進[J]. 畜牧與飼料科學, 2010 (6): 37-37.

[9] MAKKAR H P S,BECKER K. Purine quantification in digesta from ruminants by spectrophoto-metric and HPLC methods[J].British Journal of Nutrition,1999,81:107-112.

[10] 鄧思川.化學處理對真姬菇菌糠營養(yǎng)組分及人工瘤胃發(fā)酵的影響[D].福州：福建農(nóng)林大學,2013

[11] MENKE K H, STEINGASS H. Estimation of energetic feed value obtained from chemical analysis and in vitro g as production using rumen fluid[J]. Anim Feed Science Technol, 1988, 28:91-97.

[12] 淡瑞芳, 用 RealTimePCR 和 DGGE 技術(shù)研究放牧藏系綿羊瘤胃微生物季節(jié)動態(tài) [D]. 蘭州: 甘肅農(nóng)業(yè)大學, 2006.

[13] MURRAY M G, Thompson W F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J]. Nucleic acids research, 1980, 8(19): 4 321-4 326.

[14] 郭嫣秋. 瘤胃產(chǎn)甲烷菌定量檢測與微生物菌群調(diào)控研究[D]. 杭州：浙江大學, 2008.

[15] 王加啟. 反芻動物營養(yǎng)學研究方法 [M].北京: 現(xiàn)代教育出版社，2011.

[16] 楊璐玲, 呂永艷, 張杰杰, 等. 啤酒糟對瘤胃發(fā)酵參數(shù)及纖維素酶活性的影響[J]. 動物營養(yǎng)學報, 2013, 25(10): 2 414-2 421.

[17] LEEDLE J A, BRYANT M P, HESPELL R B. Diurnal variations in bacterial numbers and fluid parameters in ruminal contents of animals fed low-or high-forage diets[J]. Applied and environmental microbiology, 1982, 44(2): 402-412.

[18] DENMAN S E，MESWEENEY C S．Development of a real-time PCR assay for monitoring anarobic fungal and cellulolytic bacterial popolations within the rumen[J]．FEMS Microbiology Ecology，2006．58(3)：572-582．

[19] TOKURA M, CHAGAN L, USHIDA K, KOJIMA Y . Phylogenetic study of methanogens associated with rumen ciliates [J]. Current Microbiol, 1999,39:123-128.

[20] SHARP R, ZIEMER C J, STEM M D, et al. Taxon-specific associations between protozoal and methanogen populations in the rumen and a model rumen system [J]. FEMS Microbiology and Ecology, 1998,26:71-78.

[21] MACHMULLER A, SOLIVA C R，KREUZER M. Effect of coconut oil and defaunation treatment on methanogenesis in sheep [J]. Reproduction Nutrition and Development, 2003,43:41-55.

[22] DOEMER K C, WHITE B A. A assessment of the endo-1,4-glucanase components of ruminococcus flavefaciens FD-1[J].Appl Environ Microbial, 1990,56: 1 844-1 850.

(責任編輯：蘇 幔)

Effects of exogenous enzymes on Hu sheep rumen microbial flora

CHEN Yu

(Ningde Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Ningde 352100,China)

The experiment was carried out to study the effects of different levels of exogenous enzymes on Hu sheep rumen fermentation and rumen microbial flora, designed to provide a theoretical basis for exogenous enzymes as feed additives of Hu sheep. The results showed that: adding different levels of exogenous enzymes can improve the in vitro rumen microbial properties, in which dosage of 10 mg/kg treatment group was the best, exogenous enzymes can increase the concentration of bacteria in the culture medium(P<0.01), methanogens concentration signifantly decreased(P<0.01), which promoted the growth and multiplication of cellulose degradation bacteria.

Hu sheep；exogenous enzymes; rumenmicrobes; in vitro culture; RT-PCR

2016-10-15;

2017-12-05

陳 宇(1981-)，男，碩士，主要從事畜牧與飼料的研究。

10.7633/j.issn.1003-6202.2017.01.014

S816.32；S816.7

A

1003-6202(2017)01-0057-07