原發(fā)性免疫性血小板減少癥患者脾切除術(shù)前T淋巴細胞亞群檢測的臨床意義

黎建云， 涂傳清， 賀 德， 王典文， 黃 燦， 張旭艷， 馮 春

(深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院 a.血液內(nèi)科； b.普通外科一區(qū)， 廣東 深圳 518101)

原發(fā)性免疫性血小板減少癥患者脾切除術(shù)前T淋巴細胞亞群檢測的臨床意義

黎建云a， 涂傳清a， 賀 德b， 王典文a， 黃 燦a， 張旭艷a， 馮 春a

(深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院 a.血液內(nèi)科； b.普通外科一區(qū)， 廣東 深圳 518101)

目的 分析激素治療無效或停藥后復(fù)發(fā)的原發(fā)性免疫性血小板減少癥(ITP)患者脾切除術(shù)前T淋巴細胞亞群、自然殺傷細胞的變化，探討其與脾切除后ITP早期復(fù)發(fā)的關(guān)系。方法 收集2009年1月-2015年12月于深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院治療的ITP脾切除患者32例，隨訪時間3～60個月，按脾切除療效分為早期復(fù)發(fā)組(脾切除后6個月內(nèi)復(fù)發(fā)，PLT<30×109/L)及有效組(脾切除后PLT>30×109/L且較切除前PLT增加2倍以上)。應(yīng)用流式細胞技術(shù)檢測患者脾切除術(shù)前外周血T淋巴細胞亞群(CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD4+/CD3+CD8+、CD3-CD19+)及 CD56+CD16+自然殺傷細胞的百分比(CD3-/CD16+CD56+)。計量資料組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗或Fisher檢驗。結(jié)果 早期復(fù)發(fā)組患者11例(占34.4%)，有效組21例(占65.6%)。早期復(fù)發(fā)組脾切除術(shù)前CD3+CD4+、CD3+CD4+/CD3+CD8+明顯低于有效組[(21.7±5.4)% vs (32.6±4.1)%，t=6.39，P=0.015；0.65±0.21 vs 1.29±0.36，t=3.92，P=0.003]；早期復(fù)發(fā)組脾切除術(shù)前CD3+CD8+明顯高于有效組[(34.5±5.9)% vs (26.8±6.6)%，t=-3.20，P=0.030]；兩組患者CD3-/CD16+CD56+、CD3-CD19+差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)。結(jié)論 行脾切除術(shù)治療前CD3+CD4+、CD3+CD4+/CD3+CD8+低的ITP患者，術(shù)后易出現(xiàn)復(fù)發(fā)，提示T淋巴細胞亞群異常可作為ITP脾切除療效預(yù)測的參考指標之一。

血小板減少； 脾切除術(shù)； T淋巴細胞亞群; 殺傷細胞， 天然

原發(fā)性免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia，ITP)，又稱特發(fā)性血小板減少性紫癜，是一種獲得性自身免疫性出血性疾病，其發(fā)病機制是由于患者對自身抗原的免疫失耐受，導(dǎo)致免疫介導(dǎo)的血小板破壞增多、巨核細胞產(chǎn)生血小板不足，目前認為與細胞免疫及體液免疫有關(guān)。ITP患者臨床表現(xiàn)以皮膚黏膜出血為主，嚴重時可發(fā)生內(nèi)臟出血。治療方法主要包括阻止血小板過度破壞、促進血小板生成、減少內(nèi)臟出血風(fēng)險，其中一線治療方案包括使用糖皮質(zhì)激素(大劑量地塞米松或潑尼松)或免疫球蛋白；二線治療方案包括使用促血小板生成藥物、抗CD20單克隆抗體(利妥昔單抗)、脾切除[1]。若上述治療無效，可用其他二線藥物如硫唑嘌呤、環(huán)孢素A、達那唑、長春堿類治療[2]。目前糖皮質(zhì)激素治療ITP的有效率約為80%，仍有約20%的患者對激素、二線免疫抑制治療無效，需采取脾切除治療，其有效率約為70%～80%[3-4]。為進一步探討ITP患者脾切除術(shù)后早期復(fù)發(fā)的影響因素，本研究對ITP患者行脾切除術(shù)治療前的T淋巴細胞亞群、自然殺傷細胞百分比與脾切除早期療效的關(guān)系進行了分析，以期為ITP患者選擇脾切除個體化治療提供臨床研究依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 回顧性分析2009年1月-2015年12月于本院行脾切除治療的32例ITP患者手術(shù)前的臨床資料，其中男7例，女25例，年齡22～62歲，平均33.8歲。將患者分為兩組：脾切除術(shù)后6個月內(nèi)PLT<30×109/L定義為早期復(fù)發(fā)組[5]，脾切除術(shù)后PLT≥30×109/L且較脾切除前PLT升高2倍以上者定義為有效組。所有患者均排除了其他原因引起的血小板減少癥，且經(jīng)骨髓穿刺檢查骨髓象符合ITP表現(xiàn)，骨髓涂片及骨髓活組織均未見病態(tài)造血。因血小板極低狀態(tài)下其相關(guān)抗體難以檢測，本研究多數(shù)患者未測血小板相關(guān)抗體。由于基層醫(yī)院檢驗條件所限，患者未行血小板生成素檢查，但所有患者初期予以糖皮質(zhì)激素治療均有效。后因反復(fù)復(fù)發(fā)，內(nèi)科治療無效或不能耐受激素副作用才行切脾治療，故不考慮骨髓增生異常綜合征及不典型再生障礙性貧血。

1.2 治療方法 行腹腔鏡脾切除前ITP病程為6～240個月。所有患者脾切除前既往均經(jīng)短療程大劑量地塞米松靜脈滴注(20 mg，4 d)及后續(xù)足量強的松維持(1 mg·kg-1·d-1)和(或)環(huán)孢素5 mg·kg-1·d-1治療3個月后PLT仍小于30×109/L。手術(shù)適應(yīng)證包括：大劑量人免疫球蛋白+激素治療無效的反復(fù)消化道出血(1例)、嚴重庫欣綜合征(1例)、股骨頭壞死(1例)、反復(fù)腦出血(1例)、反復(fù)黃體破裂出血(1例)、拒絕糖皮質(zhì)激素維持(1例)、激素+環(huán)孢素A+抗CD20單克隆抗體治療無效(1例)、糖皮質(zhì)激素及環(huán)孢素A治療無效(25例)。其中2例患者行B超檢查時發(fā)現(xiàn)輕度脾腫大，脾厚分別為42、48 mm(脾正常厚度≤40 mm)。脾切除術(shù)前1周內(nèi)均給予糖皮質(zhì)激素維持±環(huán)孢素A維持±大劑量人免疫球蛋白沖擊治療。所有術(shù)后復(fù)發(fā)患者均行彩超或上腹部CT排除副脾。

1.3 實驗方法 患者脾切除術(shù)前空腹抽取2 ml靜脈血于EDTA抗凝管中，搖勻后每管加入熒光異硫氰酸熒光素或藻紅素標記的鼠抗人單克隆抗體CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD56+、抗體20 μl，在18～25 ℃室溫的暗室里孵育15 min后，加入3 ml PBS(0.01 mmol/L，pH 7.4)，搖勻，2000 r/min離心5 min，去上清，加入0.9 ml PBS(同上)搖勻后上流式細胞儀計數(shù)陽性細胞數(shù)的百分比。采用流式細胞儀檢查所有患者T淋巴細胞亞群(CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD4+/CD3+CD8+、CD3-CD19+)及 CD56+CD16+自然殺傷細胞的百分比(CD3-/CD16+CD56+)。

1.4 療效判定標準 符合《成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療中國專家共識(2016年版)》[2]判定標準：(1)完全反應(yīng)，治療后PLT≥100×109/L，無出血癥狀；(2)有效，治療后PLT≥30×109/L，并且至少比基礎(chǔ)PLT升高2倍且沒有出血；(3)無效，治療后PLT<30×109/L，或者PLT增加不足基礎(chǔ)2倍，或者有出血；(4)復(fù)發(fā)，治療有效后PLT降至30×109/L以下，或者不到基礎(chǔ)PLT 2倍或者有出血癥狀。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 脾切除治療后早期復(fù)發(fā)患者11例，復(fù)發(fā)率為34.4%；有效組患者21例。兩組術(shù)前年齡、性別比、病程、PLT、巨核細胞數(shù)、脾腫大等一般資料差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)(表1)，具有可比性。

表1 患者一般資料

2.2 T淋巴細胞亞群及自然殺傷細胞的比較 術(shù)后隨訪3～60個月(中位時間20.3個月)。早期復(fù)發(fā)組CD3+CD4+、CD3+CD4+/ CD3+CD8+明顯低于脾切除有效組，CD3+CD8+明顯高于脾切除有效組(P值均<0.05)(表2，圖1)。

表2 兩組患者T淋巴細胞亞群比較±s)

3 討論

ITP發(fā)病機制主要包括：(1)自身抗體介導(dǎo)的脾臟巨噬細胞破壞血小板；(2)自身抗體或細胞毒性T淋巴細胞介導(dǎo)的巨核細胞損傷致血小板生成減少。B淋巴細胞免疫異常包括產(chǎn)生抗血小板自身抗體[約43%～57%為抗血小板膜糖蛋白(glyrotein,GP)b/Ⅲa抗體，18%～50%為抗GPⅠb/Ⅸ抗體][6-7]；ITP患者T淋巴細胞免疫異常包括體內(nèi)存在抗GPⅡb/Ⅲa的T淋巴細胞克隆、輔助性T淋巴細胞1/輔助性T淋巴細胞2比例失衡、細胞毒性T淋巴細胞抗自身血小板及CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞(Treg)數(shù)量減少或功能受損[8]。CD4+CD25+Foxp3+Treg約占CD4+T淋巴細胞的5%～10%[9]，在ITP發(fā)病中起重要作用，其可抑制CD8+T淋巴細胞活性、減少自身抗體形成，研究[10]顯示發(fā)病期ITP患者CD4+CD25+Foxp3+Treg數(shù)量和(或)功能受損，而緩解期ITP患者Treg恢復(fù)正常。

圖1 脾切除術(shù)前患者CD4+、CD8+T淋巴細胞亞群a～c:脾切除有效組; d～f:脾切除后早期復(fù)發(fā)組

血小板破壞增多與血小板自身抗體介導(dǎo)的脾臟巨噬細胞吞噬有關(guān)，其中部分血小板自身抗體陰性的ITP患者其血小板破壞可能與CD8+T淋巴細胞介導(dǎo)的細胞毒性作用有關(guān)[11]。國外多中心回顧性研究[12]顯示脾切除完全緩解率達80%，年齡≤60歲患者5年無疾病復(fù)發(fā)生存率高于>60歲患者(76% vs 51%)，脾切除前對任何治療有反應(yīng)(包括糖皮質(zhì)激素、人免疫球蛋白、長春新堿、利妥昔單抗)、脾切除后2周PLT>200×109/L提示脾切除療效佳，清除了破壞血小板的主要場所，減少了血小板抗體產(chǎn)生，從理論上來說脾切除能迅速緩解病情，但由于ITP發(fā)病機制復(fù)雜，臨床上觀察到部分難治性ITP患者脾切除后仍出現(xiàn)復(fù)發(fā)。以往國內(nèi)研究多集中于年齡、激素或大劑量丙種球蛋白療效、術(shù)前PLT等方面，而就免疫指標預(yù)測脾切除早期及遠期療效的研究相對較少。鄭朝旭等[13]研究34例ITP患者脾切除術(shù)前后7 d T淋巴細胞亞群與療效的關(guān)系，隨訪6～32個月，結(jié)果顯示有效率為64.7%(22/34)，同時ITP脾切除有效患者術(shù)前外周血CD3+CD4+細胞百分數(shù)和CD4+/CD8+高于手術(shù)無效者，有助于預(yù)測手術(shù)療效。手術(shù)無效者術(shù)后外周血CD3+、CD3+CD8+T淋巴細胞百分數(shù)下降。馬利鋒等[14]研究ITP脾切除術(shù)后患者14 d內(nèi)PLT與T淋巴細胞亞群的關(guān)系，結(jié)果提示CD3+、CD4+、CD3+/CD4+、CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴細胞與PLT的增長呈正相關(guān)，CD4+/CD8+與PLT呈負相關(guān)。本研究較長時間隨訪(3～60個月)發(fā)現(xiàn)，32例ITP脾切除患者有效率為65.6%，與國內(nèi)鄭朝旭等[13]研究結(jié)果相近，其中11例患者CD3+CD4+/CD3+CD8+低，均于脾切除術(shù)后1～6個月復(fù)發(fā)，提示此類患者不僅脾臟破壞血小板，可能其他器官或外周血中CD8+T淋巴細胞也參與破壞血小板，或者免疫異常導(dǎo)致巨核細胞生成血小板減少。建議基層醫(yī)院ITP患者內(nèi)科治療無效需脾切除時，術(shù)前有必要測定T淋巴細胞亞群，若CD3+CD4+/CD3+CD8+減少，提示脾切除術(shù)后易早期復(fù)發(fā)，建議采取其他治療策略，如其他免疫抑制和(或)促血小板生成素受體激動劑治療(艾曲波帕、羅米司亭)。促血小板生成素受體激動劑羅米司亭、艾曲波帕治療ITP的作用機制為通過絲氨酸/蘇氨酸激酶磷酸化促進人巨核細胞增殖[15]、促血小板生成、上調(diào)ITP患者單核細胞表面FcγRⅡb及下調(diào)FcγRⅠ和FcγRⅡa的表達[16]而發(fā)揮作用。就其長期療效及安全性而言，國外Kuter等[17]研究發(fā)現(xiàn)，用羅米司亭維持5年治療，ITP患者應(yīng)答率達92%，且副作用小，血栓發(fā)生率為6.5%。因目前國內(nèi)艾曲波帕、羅米司亭均未上市，將來在國內(nèi)上市后其有望成為國人治療復(fù)發(fā)ITP的新選擇。

綜上所述，脾切除療效不同，ITP患者T淋巴細胞亞群分布不同，術(shù)前CD3+CD4+、CD3+CD4+/CD3+CD8+低者脾切除治療后出現(xiàn)易出現(xiàn)早期復(fù)發(fā)。建議T淋巴細胞亞群異?？勺鳛镮TP脾切除療效預(yù)測的參考指標。建議此類患者予一線激素療效欠佳時改其他免疫抑制治療或聯(lián)合促血小板生成素受體激動劑治療。

志謝 鳴謝康圣達環(huán)球予淋巴細胞亞群及骨髓活組織檢查的技術(shù)支持。

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(本文編輯：葛 俊)

·國外期刊精品文章簡介·

Clinical significance of measurement of T lymphocyte subsets before splenectomy in patients with primary immune thrombocytopenia

LIJianyun,TUChuanqing,HEDe,etal.

(DepartmentofHematology,ThePeople′sHospitalofBao′anDistrict,Shenzhen,Guangdong518101,China)

Objective To investigate the changes in lymphocyte subsets and natural killer (NK) cells before splenectomy in patients with primary immune thrombocytopenia (ITP) who have no response to corticosteroid therapy or experience recurrence after drug withdrawal, as well as their association with early ITP recurrence after splenectomy. Methods A total of 32 patients with ITP who were treated with splenectomy in The People′s Hospital of Bao′an District from January 2009 to December 2015 and followed up for 3-60 months were enrolled and divided into early recurrence group (with recurrence within 6 months after splenectomy and platelet count <30×109/L) and response group (platelet count >30×109/L after splenectomy, two-fold increase compared with before splenectomy) according to the outcome of splenectomy. Flow cytometry was used to measure the percentages of peripheral blood lymphocyte subsets (CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3+CD4+/CD3+CD8+, and CD3-CD19+) and CD56+CD16+NK cells before splenectomy. Thet-test was used for comparison of continuous data between groups and the chi-square test or Fisher′s exact test was used for comparison of categorical data between groups. Results There were 11 patients (11/32, 34.4%) in the early recurrence group and 21 (21/32, 65.6%) in the response group. Compared with the response group, the early recurrence group had a significantly lower percentage of CD3+CD4+(21.7%±5.4% vs 32.6%±4.1%,t=6.39,P=0.015) and a significantly lower CD3+CD4+/CD3+CD8+ratio (0.65±0.21 vs 1.29±0.36,t=3.92,P=0.003), as well as a significantly higher percentage of 〗CD3+CD8+T cells (34.5%±5.9% vs 26.8%±6.6%,t=-3.20,P=0.030) before splenectomy. There were no significant differences in CD3-/CD16+CD56+ratio and the percentage of CD3-CD19+T cells between the two groups (bothP>0.05). Conclusion ITP patients with a low percentage of CD3+CD4+T cells and a low CD3+CD4+/CD3+CD8+ratio before splenectomy tend to experience recurrence after surgery, which suggests that abnormal T lymphocyte subsets can be used as one of the reference indices for predicting the clinical outcome of splenectomy in ITP patients.

thrombocytopenia； splenectomy； T-lymphocyte subsets； killer cells, natural

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.01.033

2016-07-12；

2016-10-19。

黎建云(1982-)，女，主治醫(yī)師，主要從事血液病研究。

涂傳清，電子信箱：sztchq@163.com。

R558.2； R657.6

A

1001-5256(2017)01-0150-05