二仙湯對順鉑所致大鼠卵巢早衰模型中卵巢顆粒細胞增殖及周期的影響

趙笛 趙丕文 武虹波 蔡欣悅 孫麗萍 陶仕英 牛建昭 盧迪 齊明月

·論著·

二仙湯對順鉑所致大鼠卵巢早衰模型中卵巢顆粒細胞增殖及周期的影響

趙笛 趙丕文 武虹波 蔡欣悅 孫麗萍 陶仕英 牛建昭 盧迪 齊明月

目的 觀察二仙湯對順鉑損傷大鼠卵巢顆粒細胞增殖及細胞周期的影響。方法以不同劑量的二仙湯藥理血清作用于體外培養(yǎng)的順鉑損傷卵巢顆粒細胞，并以正常藥理血清為空白對照，戊酸雌二醇藥理血清為陽性對照，同時對比加入PI3K/AKT通路的抑制劑LY294002后各組的變化。MTT法檢測各組藥理血清作用于卵巢顆粒細胞24小時、48小時和72小時的增殖情況。流式細胞術(shù)檢測各組中細胞周期各時相的變化。結(jié)果(1)二仙湯對順鉑損傷后的卵巢顆粒細胞具有增殖促進作用(P<0.05)；且對于順鉑損傷后并給予LY294002抑制劑的顆粒細胞也具有增殖改善作用(P<0.05)。(2)二仙湯各劑量組及戊酸雌二醇組均能使處于S期的順鉑損傷顆粒細胞比例顯著增多，G0/G1期細胞相對比例減少(P<0.01)，且增殖指數(shù)升高(P<0.01)。結(jié)論二仙湯對卵巢顆粒細胞增殖有顯著促進作用，其作用機制可能是激活或增強AKT信號通路，抑制細胞凋亡，從而促進細胞增殖；另一方面，也可能是通過促進顆粒細胞從G0期向S期轉(zhuǎn)化，增加S期細胞比率來實現(xiàn)的。

二仙湯； 卵巢早衰； 卵巢顆粒細胞； 細胞增殖； 細胞周期

卵巢功能早衰(premature ovarian failure，POF)又稱原發(fā)性卵巢功能不全，是指婦女40歲以前由于卵巢功能衰退而發(fā)生的排卵和分泌激素功能的紊亂或停止，引起月經(jīng)失調(diào)、性欲減退、性功能下降、不孕、圍絕經(jīng)期綜合征等一系列癥狀的婦科內(nèi)分泌疾病。呈現(xiàn)低雌激素和高促性腺激素狀態(tài)[1]，POF嚴重危害婦女健康，導致患者喪失生殖能力，生殖器萎縮，長期低雌激素狀態(tài)還會增加患骨質(zhì)丟失、脂質(zhì)代謝紊亂、心血管疾病等的風險[2]。近年來隨著腫瘤發(fā)病率的日漸增長，因化療導致卵巢功能低下和不孕的患者明顯增多，化療也因此成為POF發(fā)病的一個重要原因[3]。顆粒細胞是卵泡的重要結(jié)構(gòu)組分，其形態(tài)和功能伴隨著原始卵泡的生長、增殖、分化、閉鎖、排卵以及黃體形成等生理過程，為研究細胞增殖、分化和細胞間相互作用、信號轉(zhuǎn)導通路的理想細胞模型[4]。

二仙湯由張伯訥教授創(chuàng)制，全方由仙茅、淫羊藿、黃柏、巴戟天、當歸和知母組成，對圍絕經(jīng)期綜合征的治療效果顯著，已被載入多部中醫(yī)方劑學著作，并得到國內(nèi)外中醫(yī)界的廣泛認可[5]。張麗娟等[6]研究發(fā)現(xiàn)，二仙湯通過調(diào)節(jié)血清中各激素水平，改變細胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達量來降低順鉑對卵巢的損害，并且具有促進卵泡發(fā)育，改善并增強卵巢功能的作用。本實驗以離體卵巢顆粒細胞為研究對象，通過觀察二仙湯對順鉑損傷的卵巢顆粒細胞增殖及細胞周期的作用，為二仙湯應用于臨床治療卵巢早衰提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物：健康雌性SD大鼠，體質(zhì)量50～70 g，清潔級，斯貝福實驗技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0002。動物飼養(yǎng)在室溫、自然光照的清潔級實驗室內(nèi)，食水充足。

實驗藥物：二仙湯組成為仙茅10 g、淫羊藿15 g、巴戟天15 g、當歸10 g、知母15 g、黃柏10 g，藥材粉末購自北京東直門醫(yī)院，應用時轉(zhuǎn)化為藥材飲片的質(zhì)量，按本實驗用大鼠質(zhì)量(60 g)與成人標準體質(zhì)量(60 kg)的折算系數(shù)折算出灌胃劑量(總生藥材質(zhì)量)即11.25 g/kg。順鉑，每支10 mg，由齊魯制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準字：H37021358。戊酸雌二醇(商品名：補佳樂)，購自中日友好醫(yī)院，1 mg/片，拜耳醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)，批號：195A5，用法與劑量：成人每日1 mg，折算成大鼠所需劑量即0.15 mg/kg。

實驗試劑和儀器：孕馬血清促性腺激素(Prospec，批號：hor-272)、LY294002(MedChem Express，批號：HY-10108)、胎牛血清(Hyclone，南美洲)、DMEM/F-12培養(yǎng)基(Hyclone)、Hank’s平衡鹽溶液(solaibio)、青霉素(solaibio)、鏈霉素(solaibio)、甲基四氮哇藍(MTT，邁晨科技公司)，DMSO(ACS Grade)、碘化丙啶(Sigma)；HITACHI 20PR-52D 離心機(日本)、超凈臺(北京亞泰科隆實驗科技開發(fā)中心)、倒置顯微鏡(NIKON TE200-S)，CO2培養(yǎng)箱(MCO-18AIC，日本SANYO)、酶聯(lián)免疫檢測儀(Epson LX-800)、流式細胞儀(BD)。

1.2 大鼠卵巢顆粒細胞制備

取25日齡SD雌性大鼠，腹腔注射孕馬血清促性腺激素(50 U/只)，常規(guī)飼養(yǎng)48小時后，10%水合氯醛麻醉后處死，無菌條件下取出雙側(cè)卵巢，去除卵巢周圍的組織及包膜，并用預冷的Hank’s液清洗3次。將卵巢移入無血清DMEM/F-12培養(yǎng)液中，用1 mL一次性注射器針頭刺破卵泡，釋放顆粒細胞。加入0.25%胰酶1 mL，用吸管反復吹打懸液數(shù)次，使顆粒細胞團塊分離，37℃消化10分鐘(其間每隔3分鐘振蕩或吹打1次)。加入3 mL DMEM/F-12培養(yǎng)液(20%胎牛血清、100 μ/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素)終止胰酶消化，并靜置10分鐘，取懸液加入離心管離心(1000 rpm，10分鐘)，棄上清，加入5 mL Hank’s液，吹散細胞后再離心。棄上清，加入1 mL DMEM/F-12培養(yǎng)液(20%胎牛血清、100 μ/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素)后吹打，血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整細胞懸液濃度至適宜濃度。MTT法檢測細胞增殖實驗為：1×105個/mL，200 μL/孔，接種于96孔板中，每組設6個復孔。細胞周期檢測實驗為：5×105個/mL，接種于培養(yǎng)瓶中，設3個重復。在37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)。

1.3 藥理血清制備

取22～24日齡，體質(zhì)量(60±5) g的SD雌性大鼠，隨機分為五組：(1)空白對照組：灌胃生理鹽水2 mL/次每天；(2)戊酸雌二醇組：0.15 mg/kg每天；(3)二仙湯高劑量組：藥物濃度0.41 g/mL，0.4 mL/只每天；(4)二仙湯中劑量組：藥物濃度0.21 g/mL，0.4 mL/只每天；(5)二仙湯低劑量組：藥物濃度0.11 g/mL，0.4 mL/只每天。各組均連續(xù)灌胃4天，最后1次灌胃1小時后心臟取血并分離血清，無菌濾器過濾，-20℃保存。

1.4 顆粒細胞造模及分組

顆粒細胞培養(yǎng)四天后換液，隨機分為六組：正常組、模型組、戊酸雌二醇組、二仙湯高劑量組、二仙湯中劑量組、二仙湯低劑量組,每組六個復孔。第七天制備卵巢早衰模型：除正常組給予無血清DMEM/F-12培養(yǎng)基外，其他各組均給予含2.5 μg/mL順鉑的無血清DMEM/F-12培養(yǎng)基，培養(yǎng)12小時。正常組加入正常藥理血清，模型組加入正常藥理血清，戊酸雌二醇組加入戊酸雌二醇組藥理血清，高劑量組加入高劑量藥理血清，中劑量組加入中劑量藥理血清，低劑量組加入低劑量藥理血清。抑制劑在各組在加入藥理血清前1小時加入，IC50為0.5 μM。

1.5 MTT法觀察二仙湯對順鉑損傷后大鼠顆粒細胞增殖的影響

顆粒細胞造模分組及加入藥理血清后，分別培養(yǎng)24小時、48小時、72小時后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，37℃孵育4～6小時后吸取上清培養(yǎng)液，每孔加DMSO 150 μL，搖床上震蕩10分鐘，選擇波長490 nm，讀取各孔吸光度(optical density,OD)值并記錄結(jié)果。

1.6 流式細胞儀檢測顆粒細胞周期各時相的變化

卵巢顆粒細胞培養(yǎng)及造模分組同1.4，接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)。棄去培養(yǎng)基，PBS清洗2次，0.25%含EDTA胰酶消化4分鐘，1200 rpm離心，10分鐘后棄上清，加入500 μL PBS配置成單細胞懸液，將單細胞懸液緩慢加入預冷的2 mL 70%冰乙醇中固定，4℃過夜。離心后收集細胞，PBS洗滌，1200 rpm離心10分鐘后棄上清，加RNaseA溶液，使之終濃度為20 μL/mL，37℃作用40分鐘。再加碘化丙啶染液染色，使之終濃度為50 μg/mL，避光，1小時內(nèi)采用流式細胞儀對樣品進行檢測，激發(fā)波長488 nm，Multicycle AV Software軟件讀取G0/G1期、S、G2/M期的數(shù)據(jù)，計算細胞增殖指數(shù)(proliferation index,PI)。進行細胞周期分析計算PI。PI=[S+G2M/(G0G1+S+G2M)]×100%。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 不加抑制劑對各組大鼠顆粒細胞增殖的影響

不加PI3K/AKT通路的抑制劑LY294002時，藥理血清作用相同時間內(nèi)，模型組和正常組相比有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，說明順鉑對卵巢顆粒細胞具有顯著的增殖抑制作用，而戊酸雌二醇及二仙湯藥理血清與模型組相比有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，說明其對順鉑損傷的卵巢顆粒細胞具有一定的增殖改善作用，且增殖改善作用一直持續(xù)到72小時，其中48小時效果最為明顯(P<0.01)。藥理血清作用24小時，二仙湯中劑量組與模型組相比具有統(tǒng)計學差異(P<0.01)；藥理血清作用48小時時，戊酸雌二醇組和二仙湯高、中劑量組與模型組相比具有顯著的統(tǒng)計學意義(P<0.01)；藥理血清作用72小時時，戊酸雌二醇組及二仙湯高、中劑量組與模型組相比具有顯著的統(tǒng)計學意義(P<0.01)。總體來看，二仙湯中劑量組的增殖改善效果最為顯著。見表1。

表1 不加抑制劑各組藥理血清作用不同時間吸光度值比較±s)

注： 與模型組比較，aP<0.05，bP<0.01；與正常組相比，cP<0.01。

表2 加抑制劑各組藥理血清作用不同時間吸光度值比較±s)

注： 與模型組比較，aP<0.05，bP<0.01；與正常組相比，cP<0.01。

注：a.正常組；b.模型組；c.戊酸雌二醇組；d.二仙湯高劑量組；e.二仙湯中劑量組；f.二仙湯低劑量組圖1 各組周期時相圖

2.2 加抑制劑對各組大鼠顆粒細胞增殖的影響

加入PI3K/AKT通路的抑制劑LY294002后，藥理血清作用相同時間內(nèi)，模型組和正常組相比有統(tǒng)計學差異，說明順鉑和LY294002聯(lián)合作用顯著抑制卵巢顆粒細胞的增殖，戊酸雌二醇組和二仙湯藥理血清組與模型組相比均具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，說明戊酸雌二醇及二仙湯藥理血清對順鉑損傷且AKT信號通路被抑制后的卵巢顆粒細胞具有一定的增殖改善作用，其機制可能是通過促進AKT信號通路來實現(xiàn)的。藥理血清的增殖促進作用一直持續(xù)到72小時，其中48小時效果最為顯著。藥理血清作用24小時，戊酸雌二醇組與模型組相比具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；藥理血清作用48小時，戊酸雌二醇組和二仙湯高、中劑量組與模型組相比具有顯著的統(tǒng)計學意義(P<0.01)；藥理血清作用72小時，戊酸雌二醇組及二仙湯中劑量組與模型組相比具有顯著的統(tǒng)計學意義(P<0.05)?？傮w來看，二仙湯中劑量組的增殖改善效果最為顯著。見表2。

從時間動態(tài)上來看，加入抑制劑24小時后，各組吸光度值較對應不加抑制劑各組有明顯增加，可能是由于細胞啟動凋亡，膜的通透性增加的緣故；加入抑制劑48小時后，各組吸光度值較對應不加抑制劑各組有明顯降低，顯微鏡下也能看到部分死亡的細胞；加入抑制劑72小時后，各組吸光度值較對應不加抑制劑各組有明顯降低，顯微鏡下可看到大量死亡的細胞。

2.3 各組周期時相圖比較

流式結(jié)果顯示，模型組與正常組相比，G0/G1期比例明顯增加，S期比例明顯降低，PI值明顯減小，均具有顯著的統(tǒng)計學差異(P<0.05)；而G2/M期比例增加，但無統(tǒng)計學差異，說明順鉑損傷后的卵巢顆粒細胞增殖指數(shù)的下降可能是通過降低S期比例，增加G0/G1期比例來實現(xiàn)的。戊酸雌二醇組、二仙湯高、中、低劑量組與模型組相比，G0/G1期比例明顯降低，S期比例明顯增加，PI值明顯增大，且均具有顯著的統(tǒng)計學差異(P<0.01)，而G2/M期比例與模型組相比無統(tǒng)計學差異，說明二仙湯能促進順鉑損傷卵巢顆粒細胞的增殖，其機制可能是通過提高S期比例、降低G0/G1期比例進而提高增殖指數(shù)PI來實現(xiàn)的。見表3、圖1。

3 討論

順鉑作為一種常用的臨床化療藥物，在殺死腫瘤細胞的同時對正常細胞也有不同程度的損害。因化療而導致卵巢功能低下和不孕的報道日漸增多。有文獻表明順鉑可誘導卵巢損傷[7-8]。本實驗以順鉑作用于離體培養(yǎng)的卵巢顆粒細胞來模擬化療所致卵巢早衰中的顆粒細胞。在順鉑作用12小時后，模型組與正常組相比具有明顯統(tǒng)計學差異，證明造模成功。

MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazoliumbromide]是一種四唑鹽，經(jīng)線粒體琥珀酸脫氫酶裂解后生成Formazan，F(xiàn)ormazan的生成量與細胞釋放出的酶活性成比例，而酶活力與細胞數(shù)及細胞活力成比例，因此該方法廣泛應用于檢測細胞活力。本實驗中，戊酸雌二醇組和二仙湯各劑量組對順鉑損傷的卵巢顆粒細胞具有一定的提高細胞活力作用，其中以二仙湯中劑量組藥理血清作用48小時效果最為顯著。由此看出，二仙湯對于卵巢早衰的治療作用主要是通過改善顆粒細胞活力來實現(xiàn)的。

LY294002是PI3K可逆、高效的選擇性抑制劑，使其α/ō/β亞基失活，進而抑制其磷酸化，阻斷下游信號傳導。加入抑制劑后，各組較其對應的不加抑制劑的各組，吸光度值明顯降低，且從48小時起在顯微鏡下即能看到細胞慢慢走向死亡，說明抑制劑對細胞的活力具有顯著的抑制作用。而加入抑制劑的戊酸雌二醇組和二仙湯各劑量組較加入抑制劑的模型組相比，吸光度值明顯升高，說明戊酸雌二醇及二仙湯對LY294002引起的細胞凋亡具有一定的改善作用，其機制可能是通過提高PI3K/AKT通路的功能來實現(xiàn)的。

卵泡發(fā)育以顆粒細胞的增殖為前提，而顆粒細胞的增殖需要合成大量DNA，所以顆粒細胞的增殖情況可以通過其DNA的水平來反映[9]。因此，本實驗通過流式細胞術(shù)檢測二仙湯各劑量組卵巢顆粒細胞所處的細胞周期時相。實驗結(jié)果表明，戊酸雌二醇及二仙湯可以明顯縮短G0期細胞的比例，提高S期細胞比例，增加細胞的增值指數(shù)。

近年來，卵巢早衰在育齡婦女中的發(fā)生率逐年升高且有向年輕化發(fā)展的趨勢[10]，雖然各醫(yī)家對POF病因的認識有所不同，但總體看來以腎虛為主[11]。二仙湯是治療腎精不足、相火偏旺所致更年期綜合征、更年期高血壓病的現(xiàn)代名方，方中溫補與寒瀉同施，壯陽與滋陰并舉，溫而不燥，寒而不滯，共奏調(diào)和陰陽之功效[12]。二仙湯及其拆方能通過“下丘腦—腺垂體—卵巢”性腺軸調(diào)節(jié)衰老，且能增進該軸功能[5]。艾浩等[13]研究表明，二仙湯能促進卵巢性激素的分泌，提升顆粒細胞、卵泡膜內(nèi)層細胞的功能，對抗順鉑的破壞與氧化損傷效應影響；能改善卵巢組織的穩(wěn)態(tài)內(nèi)環(huán)境，從而發(fā)揮促進卵泡發(fā)育，解除閉鎖狀態(tài)，促進卵巢甾體激素分泌的作用。本實驗初步探究證明，二仙湯對于卵巢早衰具有明顯的改善作用，主要是通過促進顆粒細胞增殖，促使其由G0期向S期轉(zhuǎn)化，增強PI3K/AKT信號通路的表達，抑制顆粒細胞凋亡來實現(xiàn)的。這與相關(guān)研究結(jié)果具有一致性。而二仙湯作為補腎名方，對于其在治療卵巢早衰中的具體分子機制還有待于進一步的深入探究。

表3 各組周期時相表±s)

注： 與模型組比較，aP<0.05，bP<0.01；與正常組相比，cP<0.01。

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(本文編輯： 董歷華)

Influences ofErxiandecoction on proliferation and cell cycle of ovarian granulosa cells in premature ovarian failure model caused by CDDP

ZHAODi，ZHAOPiwen，WUHongbo，etal.

BeijingUniversityofChineseMedicinebasicmedicalcollege，Beijing100029，ChinaCorrespondingauthor：ZHAOPiwen，E-mail：pwzhao@sina.com

Objective To observe the influences ofErxiandecoction on the proliferation and cell cycle ovarian granulosa cells caused by CDDP. Methods Different doses ofErxiandecoction pharmacological serum were injected in ovarian granulosa cells injured by CDDP，normal pharmacological serum was used as blank control，progynova pharmacological serum was used as positive control，and focus on the comparison of changes after joined LY294002 which was PI3K/AKT pathway inhibitor in each group at the same time. Each group of ovarian granulosa cells proliferation was detected by MTT method when pharmacological serum dosing for 24h，48h and 72h. Cell cycle and phase changes in each group were determined by flow cytometry. Results (1)Erxiandecoction has proliferation promoting effect on CDDP injury ovarian granulosa cells，and has proliferation effect of ovarian granulosa cells after injured by CDDP and added LY294002 inhibitors. (2)Erxiandecoction each dose group and progynova group can rise the proliferation index by enhancing the proportion of S phase granulosa cells and decreasing G0/G1phase proportion. ConclusionsErxiandecoction has significant proliferation promoting effect of CDDP injury ovarian granulosa cells. The possible mechanism on one hand is that it activates or enhances AKT signaling pathways and inhibits cell apoptosis. On the other hand，it perhaps promotes S phase proportion transformation from G0phase therefore increases the ratio of S phase cells.

Erxiandecoction； Premature ovarian failure； Ovarian granulosa cells； Cell proliferation； Cell cycle

國家自然科學基金(81273887)

100029 北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院[趙迪(碩士研究生)、趙丕文、武虹波(碩士研究生)、蔡欣悅(碩士研究生)、孫麗萍、陶仕英、牛建昭、盧迪(碩士研究生)、齊明月(碩士研究生)]

趙笛(1990- )，女，2014級在讀碩士研究生。研究方向：婦科常用中藥的作用機制。E-mail：jody201096@163.com

趙丕文(1967- )，女，博士，教授。研究方向：婦科常用中藥的作用機制。E-mail：pwzhao@sina.com

張伯禮院士與屠呦呦研究員親切交談

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.02.001

2015-10-22)